Maquinaria proteica de replicação do DNA

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Replicação do DNA: maquinaria 
proteica 
Adriana Taveira 
Nucleotídeo: monômero da molécula de DNA 
 
DNA: polímero de nucleotídeos 
 
DNA dupla fita e complementariedade de bases 
 
 
Replicação do DNA 
 
Dogma central da biologia 
 
Transcrição do DNA em moléculas de RNA 
 
Dinâmica da manutenção da vida 
 
Replicação da DNA 
• Maquinaria proteica envolvida no processo de 
replicação do DNA: 
– DNA polimerase 
– DNA primase 
– DNA ligase 
– Helicase 
– SSB 
– Cinta reguladora 
– Montador da cinta 
– DNA Topoisomerase 
 
Quais são os eventos necessários 
para a replicação do DNA? 
Primeiros eventos necessários para a 
replicação 
• Separação das duas fitas da hélice de DNA 
• DNA-molde 
• Reconhecimento de cada nucleotídeo na fita molde de DNA 
por um nucleotídeo complementar livre (não-polimerizado) 
• Enzima que polimeriza os nucleotídeos na nova fita nascente 
 
DNA polimerase 
• Descoberta em 1957 
• Utiliza como substrato trifosfatos de desoxirribonucleosídeo 
Forquilha/bolha de replicação 
 
Forquilha/bolha de replicação 
 
 
Forquilha replicação é assimétrica 
• Fita líder (leading) 
• Fita retardada (lagging) - fragmentos de Okazaki 
Mecanismos de correção da DNA 
polimerase 
 
Mecanismos de correção da DNA 
polimerase 
• 1ª etapa da correção: ocorre imediatamente antes da adição 
do novo nucleotídeo à cadeia crescente 
• Verificar novamente a geometria exata do pareamento de 
bases antes de catalisar a adição do novo nucleotídeo 
 
 
2º etapa na correção: 
correção exonucleolítica 
Mecanismos de correção da DNA 
polimerase 
• 2ª etapa da correção: ocorre após a incorporação incorreta de 
um nucleotídeo de forma covalente 
• correção exonucleolítica - atividade de exonuclease de 
correção 3´-5’ 
• cliva qualquer nucleotídeo não-pareado na extremidade do 
iniciador 
 
 
Apenas a replicação do DNA 
na direção 5'- 3' permite 
correção eficiente de erros 
Mecanismos de correção do mau pareamento 
do DNA – maquinaria de reparo 
• Reparo de erros de pareamento incorreto – detecta distorção 
da hélice do DNA 
• Em E. coli – grupo metil são adicionados a todos os resíduos A 
na sequência GATC 
• Nos eucariotos – fitas de DNA recém-sintetizadas sofrem 
cliuagens transitórias 
• 3 etapas: 
– reconhecimento do erro 
– a remoção do segmento de DNA contendo o pareamento incorreto na 
fita recém-sintetizada 
– ressintese do segmento removido 
Mecanismos de correção do mau 
pareamento do DNA 
 
 
Iniciador 
• Enzima: DNA primase 
• Substrato: Trifosfato de 
ribonucleosídeo 
• Dupla hélice híbrida 
 
União dos fragmentos de Okazaki 
• Sistema de reparo do 
DNA – RNAse H 
• DNA ligase 
Atividade da DNA ligase 
 
Iniciador para início da replicação 
 
Por que é necessário o iniciador? 
 
Abertura da dupla-hélice de DNA 
• Helicases 
• mil pares de nucleotídeos / segundo 
 
 
Proteínas ligadoras de DNA simples fita 
• SSB - single strand DNA-binding 
 
Cinta reguladora 
• É montada na junção 
molde-iniciador 
• Montador da cinta 
 
Complexo multienzimático 
 
DNA linear e circular 
 
DNA Topoisomerase 
• Deslocamento da forquilha - “problema do 
enrolamento” 
 
DNA superenrolado 
 
 
 
Para aliviar a tensão existente no DNA 
• DNA teria que girar – muita energia 
• Topoisomerase – nuclease reversível 
Topoisomerase 1 
 
Topoisomerase 2 
• Agem em sítios nos cromossomos em que 
duas duplas-hélices se entrelaçam 
Topoisomerase 2 
 
 
 Topoisomerase 2 - evita 
entrelaçamentos de DNA 
Replicação 
PROCARIOTOS X EUCARIOTOS 
 Como a maquinaria de replicação e a 
forquilha é formada na molécula de DNA de 
fita dupla? 
Origem da replicação 
• Como a replicação é iniciada? 
• Como as células regulam cuidadosamente 
esse processo? 
– Local adequado do cromossomo 
– Momento adequado da vida da célula 
 
Origem de replicação em bactérias 
• Ori: centenas de pares de 
nucleotídeos (~250 bp) 
• Rica em A e T 
• Origem única 
• Tempo para replicação ser 
completada: 40 min 
 
 
Início da replicação 
em bactérias 
 A metilação da origem e período 
refratário para o inicio da replicação 
• GATC (apresentam 11 repetições) 
Origem de replicação em células 
eucariontes 
• Quando ativadas em grupo formam unidades de 
replicação 
Origem de replicação em células 
eucariontes 
• Várias origens de replicação 
• Tendem a ser ativadas em grupos (unidades de 
replicação, com 20 a 80 origens) 
• Unidades de replicação distintas podem ser ativadas 
em diferentes períodos 
Descoberta das origem de replicação 
em eucariotos 
• sequência de replicação autônoma (ARS, autonomously replicating 
sequence) 
• S. cerevisiae 
Os componentes da origem de 
replicação em eucariotos 
 
Os componentes da origem de 
replicação em eucariotos 
• Origem de replicação contém: 
– um sítio para a ligação de uma enorme proteína 
iniciadora com múltiplas subunidades, chamada 
de complexo de reconhecimento de origem (OCR, 
origin recognition complex), 
– uma sequência de DNA rica em As e Ts, portanto 
mais fácil de ser desenrolada 
– pelo menos um sítio de ligação para proteínas que 
auxiliam a atrair a ORC à origem de replicação 
 Mecanismo para o início da replicação 
em eucariotos 
• Cdc6 e Cdt1 – inibidores da helicase 
• Cinases dependentes de ciclinas - cdks