Replicação do DNA

Prévia do material em texto

Replicação do DNA
	 DNA ocupa uma posição central como repositório das informações genéticas.
 
	 Suas seqüências de nucleotídeos codificam todos RNAs e proteínas celulares.
	Portanto, deve ser preservado sem alterações e transmitido de uma geração para outra intacto.
INTRODUÇÃO
	 Tamanho da molécula 
	 Compactação e ligação a outras proteínas 
	 Velocidade 
	 Simultaneidade
	 Momento certo dentro do ciclo celular
	 Fidelidade
 
Modelo: E. coli
Complicadores do Processo
Replicação do DNA
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.
A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases
A replicação do DNA é semi-conservativa
Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958
Cultivo em meio
14NH4Cl
Cultivo em meio
15NH4Cl
Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl
A replicação inicia-se nas ORIGENS DE REPLICAÇÃO, que são sequências específicas ricas em pares AT
DNA de células procarióticas, plasmídeos e vírus -1 origem de replicação.
Eucariotas – múltiplas origens de replicação localizadas ao longo do cromossomo.
Todos organismos - o início da replicação é caracterizado pelo reconhecimento da origem por proteínas específicas, que posteriormente recrutam proteínas adicionais formando o replissomo
Início da Replicação
Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
Movimento da forquilha de replicação
A partir da origem – replicação prossegue ao longo da fita de DNA
Unidirecional: 1 forquilha de replicação parte da origem e segue replicando o DNA em uma só direção.
Bidirecional: 2 forquilhas deixam a origem em direção oposta
A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua
Direção da replicação
*
Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
Replicon: 
	Origem + Término
	Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
	O genoma de uma célula procariótica constitui um único replicon
	Cada cromossomo eucariótico constitui vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado
O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
	 A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min
	 Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
O genoma eucariótico constitue vários replicons
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min
 Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
Enzimas e suas ações
DNA Polimerases
Endonucleases
Helicases 
Topoisomerases
Primases
Telomerases 
Principais enzimas envolvidas no sistema de replicação do DNA
DNA Polimerases
	Principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo 
	Requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início – alongamento 
	3 tipos principais : I, II, III
 I : importante no sistema de reparo 
III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades) 
	Polimerases: todas além da atividade de polimerização (somente no sentido 5’ → 3’), apresentam uma atividade de exonuclease (reparo DNA). 
	Quando removem do final do filamento são chamadas de exonucleases. 
	Se os removem em algum outro lugar do filamento, são chamadas de endonucleases). 
	A remoção é feita no sentido inverso, ou seja 3’ → 5’)
DNA Polimerases
DNA Polimerase em E. coli (procariotos)
	Tipo	Função 
	DNA Polimerase I 	Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5´3´
Atividade de exonuclease 3´5´ e 5´3´
Preenche pedaços pequenos de DNA durante a replicação e processo de reparo 
	DNA Polimerase II 	Polimerase alternativa de reparo, mas também pode replicar DNA quando o filamento molde é danificado 
	DNA Polimerase III 	Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5´3´. É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA 
Modelo da estrutura das DNA-polimerases
DNA polimerase I não é a responsável pela replicação do cromossoma de E.coli:
􀂌Velocidade de polimerização demasiado baixa;
􀂌Processividade baixa;
􀂌Estudos genéticos demonstraram que a DNA polimerase I não atua sozinha;
DNA POLIMERASE I
􀂾 Enzima responsável pela replicação de DNA em E.coli
􀂾 In vivo PolIII é uma holoenzima constituída por, pelo menos, 10 subunidades:
α, ε e θ formam o núcleo da enzima
τ liga dois núcleos da polimerase
DNA POLIMERASE III
A subunidade β da DNA Polimerase III forma uma estrutura em anel à voltado DNA e é responsável pela sua elevada processividade (> 500.000 nucleotídios). 
DNA POLIMERASE III
DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica
NUCLEASES
	Degradam o DNA, clivando-o em pedaços menores 
EXONUCLEASES: clivam o DNA a partir do final da molécula
ENDONUCLEASES: clivam em qualquer local da molécula 
OUTRAS ENZIMAS 
	 HELICASES: separação da dupla fita (quebra pontes de H das bases).
	 DNA-binding proteins (SSB): mantém as fitas separadas estabilizadas, impedem a ação das nucleases na fita simples.
 
	 PRIMASES: formação dos primers.
	 LIGASES: conectam fragmentos de fitas menores 
Replicação em E. coli
ESTÁGIOS DA REPLICAÇÃO 
INICIAÇÃO 
ALONGAMENTO
TERMINAÇÃO 
ORIGEM DA REPLICAÇÃO – OriC :
 - 245 pb; 
 - 3 sequencias repetidas de 13 pb – ricas em AT localizadas antes das sequencias abaixo; 
 - 4 sequencias repetidas de 9 pb - consenso 5’TTAT(C/A)CA(C/A)A3’ – sítio específico da proteína iniciadora DnaA
Iniciação
OriC do cromossomo de E.coli
Ligação da DnaA à origem – cooperativa – originando a ligação de 20 – 40 monômeros nessa região.
Formando uma região central onde o DNA se enrola – COMPLEXO INICIAL.
COMPLEXO ABERTO – separação das duas fitas na região das sequências de 13pb – devido as alterações estruturais em função do complexo DnaA:oriC. Estão envolvidas outras proteínas como a HU – estabiliza a curvatura doo DNA.
COMPLEXO PRÉ-PRIMING – ligação de DnaB na região das sequências repetidas de 13pb. Forma complexo com DnaC. DnaA auxilia posicinamento de DnaB por meio de possíveis interações DnaA-DnaB ou DnaA-DnaC.
Ligação do complexo DnaB-DnaC em oriC representa início da replicação.
Iniciação
Papel da: DnaA (principal) 
	 DnaB (helicase)
 DnaC 
􀂾Permitir que a iniciação se faça no momento adequado do ciclo de divisão;
􀂾Impedir que o cromossoma se replique mais do que uma vez por cada ciclo;
􀂪Mecanismo de sequestração
Metilação de oriC, nas sequências GATC, pela DNA-adenina-metiltransferase (Dam-metilase)
Após replicação, o DNA semi-metilado liga-se à membrana bacteriana, ficando as origens de replicação inacessíveis
CONTROLE DA ETAPA DE INICIAÇÃO
METILAÇÃO DO DNA E INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO
Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação
2. ALONGAMENTO 
Envolve duas operações distintas, mas relacionadas: 
	Síntese da fita líder 
	Síntese da fita tardia 
Início comum na forquilha de replicação envolvendo: 
	helicases
	topoisomerase
	DNA binding proteins
	Síntese de um RNA primer pela primase na origem de replicação 
	Desoxirribunocleotídeos são adicionados pela DNA polimerase III continuamente a partir da forquilha de replicação 
SÍNTESE DA FITA LÍDER 
As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA
 A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. 
O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato
 Sentido da síntese sempre é 5’  3’
 A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA-polimerases tem atividade revisora
	A primase (que é uma RNA-polimerase) constrói o primer de RNA em uma região não coberta pelas SSB;
	A topoisomerase alivia atensão da espiralização provocada pela abertura do DNA Ex. DNA girase;
	A DNA polimerase (III) sintetiza as novas cadeias. Elas capturam os nucleotídeos, prontos com um trifosfato, os levam ao molde, retiram dois fosfatos e os ligam ao C 3’ do nucleotídeo anterior;
	Elas vão polimerizando muito rapidamente (100.000 nucl./min). Outras DNA polimerases preenchem as falhas e corrigem erros.
Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)
Fita sendo polimerizada
Fita molde
O complexo de replicação
	 A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha. 
	 Cada core catalítico da DNA Pol III sintetiza uma das fitas-filhas.
	 Afastamento das fitas molde.
	 Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas.
Fita contínua necessita de somente um primer inicial;
Fita descontínua utiliza vários primers;
Fita descontínua são gerados vários fragmentos (fragmentos de Okazaki);
Procariontes – 1000 à 2000 nucleotídeos;
Eucariontes – 100 à 200 nucleotídeos.
A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA
Fita contínua
Fita descontínua
Síntese da Fita descontínua
Síntese da Fita Contínua
	 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua
	 A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA
	 A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas
	 A DNA ligase sela as quebras
Síntese contínua da cadeia leading
􀂾 Síntese descontínua da cadeia lagging em fragmentos de Okazaki;
􀂪 Coordenação da síntese das duas cadeias:
-Ambas as cadeias são sintetizadas por uma única DNA polimerase assimétrica
-O looping do DNA da cadeia lagging junta os dois pontos de polimerização 
SÍNTESE DA FITA TARDIA 
	Síntese de um RNA primer pela primase (DnaG) na origem de replicação. 
	Síntese dos fragmentos de Okasaki.
	Uma só polimerase: são criadas alças para aproximar os dois pontos de replicacao ( das duas fitas). 
	Processo repetido diversas vezes.
TERMINAÇÃO 
	Procariotos: DNA circular, quando as duas forquilhas de replicação se encontram ela termina. Ainda há o sistema Ter-tus. 
	Eucariotos: seqüências de nucleotídeos específicas no final dos cromossomos, incorporadas a telômeros. Ou fusão das forquilhas
	 Duas forquilhas se encontram na região terminal denominada sítio ter - 180˚ de oriC.
	 Cada sítio ter é específico para uma direção do movimento de forquilha.
	 Fazendo com que cada forquilha deva passar pela outra para finalizar a replicação.
TERMINAÇÃO 
*
Atividade revisora 3’  5’ garante a fidelidade da replicação
A DNA ligase sela as quebras
A replicação em eucariotos
PARTICULARIDADES DOS EUCARIOTOS
 Diferenças fundamentais : 
	estrutura nucleoproteica complexa; 
	molécula de DNA maior ( 150 x 106 vs 4,7 x 106);
	cromossomos lineares.
 Soluções: 
	maquinário enzimático mais complexo; 
	múltiplas origens de replicação;
	telômeros.
A replicação é um acontecimento muito mais raro nos eucariotas do que nos procariotas. 
A iniciação da replicação é fortemente regulada
O DNA não se encontra nu na célula, mas sob a forma de cromatina.
Esta encontra-se organizada sob a forma de nucleossomas. 
Nível superior de organização implica complexidade maior para a replicação
Nos eucariotos existem outras DNA polimerase análogas às dos procariotos
	DNA Polimerase em eucariotos 	Função 
	DNA Polimerase α 	Replicação do cromossomo nuclear (fita lagging) 
	DNA Polimerase β 	Reparo de DNA no preenchimento de espaços do cromossomo nuclear. Análoga a Polimerase I 
	DNA Polimerase γ 	Replicação de DNA mitocondrial 
	DNA Polimerase δ 	Replicação do filamento leader a da lagging do cromossomo nuclear 
	DNA Polimerase ε 	Reparo do DNA do cromossomo nuclear 
	DNA Polimerase ζ 	Aparentemente reparo de DNA 
Notar a semelhança desta estrutura com
com o dímero β2 da DNA Polimerase III de E.coli
CONTROLE DA REPLICAÇÃO PELO CICLO CELULAR
A síntese de DNA tem início, em muitas origens diferentes, durante a fase S.
􀂾A replicação produz uma única cópia de cada molécula. 
Bloqueio da iniciação da replicação até ao próximo ciclo celular.
􀂾A replicação do genoma inteiro deve estar concluída antes da passagem à fase G2.
􀂾 A replicação inicia-se em múltiplas origens. Porquê?
O movimento da forquilha de replicação é~20x mais lento nos eucariotas do que nos procariotas (50 nt/seg). 
A esta velocidade a replicação de um cromossoma humano de tamanho médio levaria 500 horas.
􀂾 As origens de replicação ou sequências de replicação autónoma (Autonomously Replicating Sequence ou ARS) foram identificadas e estudadas na levedura. Existem cerca de 400 ARS no genoma da levedura.
REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
INICIAÇÃO
Forquilha 
sentido 
horário
Forquilha 
sentido 
antihorário
Terminação
Terminação
Forquilha 
sentido 
horário
Forquilha 
sentido 
antihorário
Terminação
Terminação