Técnicas de estudo de RNA e transcriptomas

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Técnicas de análise de RNA
Extração de RNA 
- Agentes desnaturantes (ex: isotiocianato de guanidina, Trizol)
Inibidores de RNAse
Água DEPC (dietilpirocarbonato)
DNAse livre de RNAse
Eletroforese de RNA
–agentes desnaturantes : Formaldeído
			 Formamida 
			 Hidróxido de metilmercúrio 
			 Glioxal/DMSO
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Lavagem com PBS e centrifugação das células
 
Adição de TRIzol 
  
Lise por passagem em seringas de 18 gauge ou por agitação vigorosa 
  
Adição de clorofórmio
Agitação e centrifugação 
Transferência de sobrenadante para novo tubo
 
 	 Precipitação do RNA com isopropanol
Ressupensão em água DEPC (dietilpirocarbonato)
Extração de RNA usando TRIzol 
 
TRIzol ou TRI reagente 
(reagente de tiocianato de guanidina e fenol ácido) 
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Pureza e Quantificação do RNA
Quantificação por espectrofotometria:
- DNA  1 UA260nm = ~50 µg/mL
- RNA  1 UA260nm = ~40 µg/mL
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Eletroforese de RNA
Eletroforese em gel de agarose (1-2 %)
	Desnaturante (formaldeído)
Coloração com Brometo de etídio
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Eletroforese de RNA
Eletroforese em gel de agarose (1-2 %)
	Desnaturante (formaldeído)
Coloração com Brometo de etídio
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Isolamento de mRNA
Oligo dT
5’
3’
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Métodos clássicos (em pequena escala)
Northern blot
RT-PCR
Quantitative real-time PCR
Análise da expressão gênica 
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Northern blot
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RNase H
RT-PCR 
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RT-PCR 
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Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
Iniciadores forward e reverse são estendidos com Taq DNA polimerase como em um PCR tradicional. 
Uma sonda ligada a dois fluorocromos anela a uma seqüência gênica entre os dois iniciadores. 
À medida que a polimerase estende os iniciadores a sonda é deslocada. 
 A atividade 5’ exonucleasica da DNA polimerase cliva o corante repórter da sonda. 
Após ser liberado do quencher, um sinal fluorescente é emitido. 
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Uma das opções de visualização do resultado da qPCR é a janela de amplificação. 
 Esta opção mostra a quantidade de fluorescência obtida em cada ciclo de amplificação. 
O ciclo threshold (Ct) é aquele no qual a quantidade de fluorescência ultrapassa um limite crítico previamente determinado (nível threshold) representado pela linha escura horizontal. Amostras que ultrapassam este nível são positivas. 
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Métodos em larga escala
Microarrays
RNAseq
Análise da expressão gênica 
Microarray introduction
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Microarrays
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 Experimento de Microarray
 Fabricação da lâmina/chip
Microarray introduction
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O “Spotter” e fixação no U.V.
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Marcação direta
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scanner
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Escaneamento 
Aquisição dos dados
GenePix
Quantarray
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Microarray introduction
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RNASeq
1
2
Microarray introduction
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Análise e contagem das sequências obtidas por RNASeq
Microarray introduction
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https://www.youtube.com/watch?v=O4bBZ_UOcK8
https://www.youtube.com/watch?v=wvt1lkH_mJU&feature=youtu.be
https://www.youtube.com/watch?v=MniYgsZSp30
Isotiocianato de Guanidina (poderoso agente desnaturante de proteínas) -> inativa RNAses 
Fenol ácido /clorofórmio -> separa o RNA na fase aquosa o DNA fica na interface e as proteínas na fase orgânica
Nota: pH baixo da solução de fenol é crítico uma vez que no pH neutro o DNA fica na fase aquosa. 
TRIsol ou TRI reagente 
(reagente de tiocianato de guanidina-fenol ácido) 
Aspirate media from the cells and wash once with Phosphate Buffered Saline (PBS). T
Add 5ml PBS and scrape cells from the plate.
Transfer cell suspension to a 50 ml polypropylene conical-bottom tube 
Wash the plate with an additional 1ml PBS and add the suspension to the tube.
Pellet the cells by centrifugation at 2,300 rpm for 3 minutes at 4°C and discard the supernatant. 
Add 2ml TRIzol per ~2x106 cells (approximately one 150 mm plate of fibroblasts) to the pellet and pass the suspension through an 18 gauge syringe several times to disrupt the pellet.
 Incubate the sample at room temperature for 5 minutes.
Add 0.4ml of chloroform (0.2ml/1ml Trizol) and shake vigorously for 1 minute
Incubate at room temperature for 2 minutes 30 seconds.
Remove cellular debris by centrifugation at 4,000 rpm for 15min at 4°C.
Transfer the supernatant to 1.2 ml microfuge tubes (0.5ml/tube) and an equal volume of isopropanol to precipitate the RNA.
Incubate at room temperature for 15 minutes.
Centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes to pellet the RNA.
Discard the supernatant and resuspend the pellet in 70% ethanol. The RNA can be stored in 70% ethanol at -20°C until use.
Prior to use, centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes at 4°C and discard supernatant.
Resuspend the pellet in diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water or RNase-free TE buffer for labeling.
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O pico de absorbância do RNA é a 260 nm (Uma leitura a 260nm igual a 1.0 equivale a 40 ug RNA/ml). Uma amostra de RNA deve exibir uma curva em formato de sino, com um único pico em 260 nm. Proteínas apresentam um pico de absorbância a 280 nm e outros contaminantes (como sais, polissacarídeos e compostos orgânicos como fenol) apresentam pico de absorbância em torno de 230 nm. Por isso, a razão das abs. 260/280nm é freqüentemente utilizada para avaliar a contaminação por proteínas, sendo o valor de referência (amostra livre de proteínas) igual a 2.0 (o que varia um pouco na literatura). E a razão das abs. 260/230nm é utilizada para avaliar a contaminação por outros compostos (valor de referência também em torno de 2.0 – e também não é consenso). 
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Em géis de 1% de agarose em 1x TBE, Xileno Cianol comigra com fragmentos de DNA de ~3500 bp e o Azul de bromofenol comigra com fragmentos de 300 bp. 
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Através de um gel de agarose desnaturante, é possível deduzir a integridade do RNA pela visualização das duas bandas de RNA ribossomal. A presença de rastro abaixo das bandas de rRNA indicam degradação e, acima delas, pode indicar contaminação por DNA genômico (o que pode comprometer resultados futuros). Portanto, um RNA de boa qualidade deve apresentar bandas bem definidas e sem rastros. Além disso, a banda referente ao rRNA 28S deve apresentar o dobro da intensidade da banda do rRNA 18S. Este parâmetro tenho sido bem utilizado (através do cálculo da razão entre as intensidades das bandas 28S/18S que deve ser igual a 2.0, mas este valor pode variar entre diferentes espécies e tecidos). No entanto, esta técnica exige uma quantidade considerável de RNA (pelo menos, 1 ug, o que pode ser limitante para alguns), além de somente detectar um grau considerável de degradação (suficiente para exibir um rastro no gel e alterar a razão 28S/18S calculada a partir da análise da imagem dele) e demandar mais tempo e trabalho.
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Durante a QPCR, a quantidade de produto formada na PCR é medida a cada ciclo e referida como unidades de fluorescência. Quanto maior a quantidade de DNA alvo presente na amostra mais rapidamente o produto medido como fluorescência) é gerado. Uma amostra é positiva se a quantidade de fluoresc~encia produzida ultrapassa o limite threshold. O valor threshold cycle (Ct) denota quantos cilos de PCR foram necessários para uma amostra alcançar o nível threshold. Assim, quanto mais DNA alvo na amostra menor o valor Ct, porque o nível threshold será alcançado mais rápido.
O número de ciclos necessários para alcançar o Ct é inversamente proporcional a quantidade de cópias da sequência no início da PCR
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