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Um livro sobre Genômica de alta qualidade e clareza, escrito por pesquisadores brasileiros. Que privilégio! O estudo da genômica tem uma história relativamente recente: iniciou-se há pouco mais de vinte anos, quando passamos a sequenciar o DNA de genomas DNA de genomas DNA inteiros de organismos (bactérias), com cerca de 4 milhões de pares de bases, e não mais apenas genes isolados (de 1000 a 2000 pares de bases). E rapida- mente se transformou em uma fonte de informação fabulosa, tendo um impacto espetacular pouco tempo depois (ano 2000) com o sequenciamento do genoma humano, com 3 bilhões de pares de bases. Novas tecnologias foram incorporadas e hoje o genoma humano, inicialmente sequenciado em um projeto de mais de 10 anos, pode ser sequenciado em até um dia! A quantidade de informação gerada chega a ser fantástica: é um oceano de dados que precisa e deve ser estudado em suas diferentes facetas. E por isso, a genômica rapidamente transformou a forma de estudar Biologia, incorporando o essencial uso da bioinformática, com seus bancos de dados, na análise de genomas já sequenciados para uma quantidade fenomenal de organismos. Premissas evolutivas foram confirmadas demonstrando a fantástica simi- laridade entre todos os organismos, mas também destrinchando as divergências entre eles. A compa- ração dos diferentes genes e genomas revelou novas processos de Evolução, nos brindando com surpresas que nos indicam o quão pouco conhecemos e nos estimula a buscar mais conhecimento sobre a vida em nosso planeta. A facilidade na obtenção de dados tem nos mostrado o quão nós, seres humanos, somos parecidos não só com outros primatas, mas também com outros animais, sobretudo mamíferos, de quem divergimos na última centena de milhões de anos. A anatomia do genoma dos organismos, incluindo humano, expôs também a importância de regiões não codificantes de proteínas (98% de nosso genoma!), demonstrando o quanto ainda precisamos descobrir e aprender. Ao mesmo tempo, o sequenciamento de diferentes genomas humanos, permite conhecer melhor não só a história da Evolução humana, como também a diferença entre as pessoas. Essas dife- renças em alguns milhões de nucleotídeos, possibilita não só a identificação de mutações responsáveis por patologias genéticas, mas também garantem a individualidade definindo avanços em processos terapêuticos, com profundo impacto na Medicina. O estudo de genomas deu ferramentas e estimulou o estudo em larga escala do funcionamento celular, gerando outras Ômicas. Assim, estudar os genes que são expressos em diferentes tecidos ou em determinadas condições é também conhecido como a Transcrissômica, também empregando tecnologias de sequenciamento a partir das moléculas de RNA. Outras tecnologias também permitem os estudos A formação de recursos humanos de qualidade em pesquisa científica requer uma robusta formação teórica. Entretanto o que temos visto ao longo da última década é uma academia preocupada em publicar cada vez mais artigos científicos em revistas especializadas, não necessariamente com qualidade, em detrimento da popularização da ciência e formação de recursos humanos. Neste contexto, alunos de distintos programas de pós-graduação estão se tornando tecnicistas pouco críticos e desarticulados com a evolução do pensamento científico em Ciências Genômicas. Na tentativa de minimizar estas condições, a elaboração deste livro passou por uma criteriosa análise de demanda por conhecimento, estabelecido junto aos alunos de pós-graduação com os quais tive a oportu- nidade de trabalhar. Isto propiciou uma organização de capítulos que permite ao leitor compreender um pouco da história da genômica no Brasil e no mundo, e os decorrentes avanços oriundos de uma área do conhecimento que, em curto espaço de tempo, torna-se obsoleta pelas novas e fascinantes descobertas associadas. Com a participação de pesquisadores renomados, cada capítulo propicia ao leitor a oportunidade de se envolver a uma fundamentação teórica, ao mesmo tempo em que pincela aprofundamentos em conhecimentos específicos o que torna a obra diferenciada e, possivelmente, uma das principais fontes de consulta nesta área do conhecimento. Assim, esperamos que este livro possa se tornar uma bibliografia obrigatório a professores, pesquisadores e alunos dos mais distintos cursos de graduação e programas de pós-graduação em que as Ciências Genômicas possam se inserir. Leandro Marcio Moreira Professor e Pesquisador da Universidade Federal de Ouro Preto, membro permanente dos programas de pós-graduação em Biotecnologia (PPGBiotec) e do Mestrado Profissional em Ensino de Ciências (MPEC) amplos da Proteômica, proteínas, ou mesmo da Metabolômica, vias metabólicas, que permitem um conhecimento mais completo da fisiologia celular e de organismos multicelulares. O controle da expressão gênica em dimensões acima da sequência gênica, ao nível de modificações de bases ou de alterações nas proteínas da cromatina, também é feita agora em larga escala com a Epigenômica. E além do conhecimento dos genomas completos conhecer ambientes através de suas sequências gênicas gera dados fascinantes, o que é estudado pela Metagênomica. Esta permite estudar ambientes como uma região específica de um Oceano, gerando dados de sobre a vida de ecos- sistemas, como também em ambientes específicos dentro dos organismos multicelulares, permitindo o conhecimento da microbiota humana, por exemplo, e como esta influencia nossas vidas. Ainda dentro de uma mesma célula, conhecer como as diferentes macromoléculas se relacionam, fazendo uma rede de interação, buscando compreender a células como um sistema completo e não fragmentado, é alcançado por estudos de Biologia de Sistemas. Ainda, compre- ender, identificar e classificar as espécies que habitam nosso planeta ganhou impulso com o sequencia- mento de poucos genes, mas de todos organismos de um ecossistema, através do Barcoding. E, finalmente, conhecer genes e sequencias gênicas incitou formas de engenheirá-los com benefícios para a sociedade, através do que hoje se conhece como Biologia Sintética. Esses conceitos estão discutidos com detalhe neste ousado livro de Genômica. De fato, reunir esses con- ceitos em um livro de genômica é um desafio enorme, alcançado para que possamos navegar sobre esse conhecimento tão fundamental na biologia moderna. Dado ao conteúdo altamente multidisciplinar, o leitor com conhecimentos básicos de várias áreas pode desfrutar de como essa nova ciência foi originada, as contribuições científicas atuais e sobretudo das perspectivas que nos esperam no futuro. A revolução genômica já começou e este livro nos abre as portas a esse conhecimento. Aproveite. Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck Professor titular pelo Departamento de Microbiologia (ICB) - Universidade de São Paulo, bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq - Nível 1A - Genética Ciências genômicas: fundamentos e genômicas fundamentos e genômicas aplicações Leandro Marcio Moreira organizador Apoio PROJETO BIGA Bioinformática, Genômica e Associados Processo 3385/2013, edital 051/2013 COMISSÃO EDITORIAL SOCIEDADE BRASILEIRA DE GENÉTICA Editor Élgion Lúcio Silva Loreto Universidade Federal de Santa Maria Comissão Editorial Carlos Frederico Martins Menck Universidade de São Paulo Louis Bernard Klaczko Universidade Estadual de Campinas Marcio de Castro Silva-Filho Universidade de São Paulo Maria Cátira Bortolini Universidade Federal do Rio Grande do Sul Marcelo dos Santos Guerra Filho Universidade Federal de Pernambuco Pedro Manoel Galetti Junior Universidade Federal de São Carlos Sociedade Brasileira de Genética Rua Capitão Adélmio Norberto da Silva, 736 Alto da Boa Vista | CEP 14025-670| Ribeirão Preto, SP Tels .: (16) 3621-8540 | contato@sbg .org .br | www .sbg .org .br Capa, projeto gráfico e diagramação Ciências genômicas : fundamentos e aplicações / Leandro Marcio Moreira (organizador). – Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2015. 403 p: il Idioma: Português ISBN 978-85-89265-22-5 1. Genômica estrutural. 2. Genômica funcional. 3. Genômica comparativa. 4. Biologia sintética. 5. Biologia de sistemas. 6. DNA barcoding. 7. Metagenômica. 8. Epigenômica. 9. Metabolômica. 10. Filogenômica. I. Moreira, Leandro Marcio, org. II. Título. A minha esposa Edmara, e ao meu filho, Ângelo. Aos meus Mestres, amigos e contemporâneos de formação. Com carinho. Leandro Marcio Moreira Os autores Alessandro de Mello Varani. Biomédico. Especialista em Bioinformática (LNCC) e Doutor em Biotecnologia pela USP. Pesquisador III do Departamento de Tecnologia da FCAV/UNESP- Jaboticabal. Trabalha com Bioinformática, Genômica e Evolução de Micro-organismos e Plantas. Camila Carrião M. Garcia. Graduada em Química e Doutora em Bioquímica pelo IQ-USP. Atualmente é professor efetivo de Bioquímica e Biologia Molecular lotado no Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. Trabalha mecanismos de danos e reparo de DNA e suas implicações no Câncer e Envelhecimento. Claudio de Oliveira. Biólogo, Mestre e Doutor em Biologia/Genética pela USP. Atualmente é professor titular de Biologia Celular, lotado no Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP). Trabalha desenvolvendo estudos em sistemática, biodiversidade, conservação e evolução. Denise Dagnino. Bióloga, Especialista em Biologia de Cianobactérias. Doutora em Ciências Naturais e Matemática pela Universidade de Leiden na Holanda. Professora Associada de Biologia no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense. Trabalha com fisiologia de micro-organismos. Diego Bonatto. Biólogo pela UFRGS. Especialista em Biofísica, Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular UFRGS. Atualmente é professor adjunto de Biologia Molecular e Bioinformática, lotado no Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Trabalha com ferramentas de biologia de sistemas aplicadas a mecanismos biológicos complexos, como envelhecimento e desenvolvimento. É membro afiliado da Academia Brasileira de Ciências (2011-2015). Francisco Prosdócimi. Biólogo, Mestre em Genética e Doutor em Bioinformática pela UFMG. Atualmente é professor adjunto de Bioinformática no Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Trabalha com montagem e anotação de genomas animais, genômica e transcriptômica comparativa, filogenômica e genética de populações. Gonçalo Castelo-Branco. Licenciado em Bioquímica pela Universidade de Coimbra, Portugal, Doutor em Bioquímica Medica, pelo Instituto Karolinska, Estocolmo, Suécia. Atualmente é Professor Associado e Investigador Principal no Departamento de Bioquímica e Biofísica do Instituto Karolinska, Estocolmo, Suécia. Trabalha com estudos de epigenética em células progenitoras e células-mãe, com um foco em desenvolvimento neural e doenças neurológicas. Helder I. Nakaya. Obteve seu grau de Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade de São Paulo em 2002 e seu doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular pelo Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP em 2007. O doutorado foi voltado para a área de Biologia Molecular e ioinformática. Se tornou professor assistente do Departamento de Patologia da Emory University em 2011, onde utiliza a biologia de sistemas para prever e entender a resposta imune a diferentes vacinas. Foi contratado como docente do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas do Instituto de Ciências Farmacêuticas da USP em 2013. Jan Schripsema. Farmacêutico, Especialista em Fitoquímica, Biotecnologia Vegetal e Metabolômica. Doutor em Ciências Naturais e Matemática pela Universidade de Leiden na Holanda. Professor Titular de Química de Produtos Naturais no Laboratório de Ciências Químicas da Universidade Estadual do Norte Fluminense. Trabalha com estudos de metabolômica em plantas medicinais e alimentos. Jeronimo Conceição Ruiz. Químico pela UFSCar, Especialista em Bioinformática e Biologia Computacional e Doutor em Bioquímica pela FMRP/USP com pós-doutorado no Wellcome Trust Sanger Institute, Inglaterra. É pesquisador adjunto da FIOCRUZ (CPqRR, Belo Horizonte, MG). Atua primariamente na integração computacional de dados biológicos (redes de interação de proteínas, desordem estrutural proteica, imunoinformática, genômica e transcriptômica comparativa) em patógenos de interesse em saúde pública. Juliana Lopes Rangel Fietto. Farmacêutica. Doutora em Bioquímica pela USP. Professora associada da Universidade Federal de Viçosa. Tem experiência na área de Biotecnologia e Bioquímica, com ênfase em biologia molecular, produção de proteínas recombinantese e aplicações biotecnológicas, bioquímica de enzimas e biologia celular, voltados para doenças infecciosas humanas e animais. Julio Cezar Franco de Oliveira. Farmacêutico-Bioquímico. Doutor em Bioquímica pela USP. Professor Adjunto da Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP - Diadema. Trabalha em Bioquímica com ênfase em Genômica Funcional. Laila Alves Nahum. Bióloga. Bacharel em Microbiologia pela UFMG, Mestre em Bioquímica e Doutora em Genética pela USP com pós-doutorados no Marine Biological Laboratory e Louisiana State University, Estados Unidos. É pesquisadora efetiva na FIOCRUZ (CPqRR, Belo Horizonte, MG). Trabalha com filogenômica e evolução molecular de famílias de proteínas de diversos organismos atuando na interface entre Ciência e Educação. Leandro Marcio Moreira. Biólogo e Especialista em Biologia Molecular pela USJT, Mestre e Doutor em Bioquímica pelo IQ-USP. Atualmente é professor efetivo de Bioquímica e Biologia Molecular lotado no Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. Trabalha com estudos de genômica comparativa e funcional de micro-organismos, bioprospecção e metagenômica de ambientes de canga e desenvolvimento de ferramentas didáticas em baixo custo para o ensino de ciências moleculares. Leandro Xavier Neves. Bacharel em Nutrição. Mestre e doutorando em Biotecnologia pela Universidade Federal de Ouro Preto, área de concentração Genômica e Proteômica. Tem atuado na caracterização de proteínas da interface parasito-hospedeiro, em infecções causadas por helmintos e protozoários, e métodos de purificação, depleção e fracionamento proteico. Luciana Principal Antunes. Bióloga. Bacharel em Ciências Biológicas pela UNIFESP e doutoranda em Ciências Biológicas (Bioquímica) pelo IQ- USP. Desenvolve projeto nas áreas de metagenômica e metatranscritômica de micro-organismos da compostagem do Zoológico de São Paulo. Atualmente também atua como Perita Criminal na Superintendência da Polícia Técnico-Científica de São Paulo. Luciano Antonio Digiampietri. Bacharel e Doutor em Ciência da Computação pela UNICAMP. Atualmente é professor-doutor nos cursos de bacharelado e mestrado em Sistemas de Informação na Universidade de São Paulo. Trabalha com montagem e anotação de genomas e metagenomas; gerenciamento de experimentos científicos; mineração de dados; e análise de redes sociais. Luciano Gomes Fietto. Farmacêutico. Doutor em Bioquímica e Biologia Molecular pelo Instituto de Química da USP. Professor Associado do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa (UFV). Trabalha com melhoramento de leveduras para produção de Bioetanol e no estudo da resposta a estresses em plantas e leveduras. Luiz Henrique Garcia Pereira. Biólogo e Doutor em Ciências Biológicas (Zoologia) pela UNESP.Atualmente é Professor Adjunto de Biologia Molecular e Genética, lotado no Instituto Latino- Americano de Ciências da Vida e da Natureza da Universidade Federal de Integração Latino- Americana (UNILA). Trabalha com estudos em genética animal nas áreas de biodiversidade, conservação, sistemática e evolução. Marcia Regina Soares da Silva. Física. Mestre em Física pelo Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas. Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica) pela UFRJ. Pós-doutora pelo LNLS. Professor adjunto do Instituto de Química da UFRJ. Tem experiência na área de Biofísica, com ênfase em Biofísica Molecular, atuando principalmente com proteínas e peptídeos, espectrometria de massas e proteômica. Márcia Rogéria de Almeida. Bióloga (PUC-MG), Mestre em Bioquímica e Imunologia pela UFMG, Doutora em Bioquímica pela UFRGS/Plum Island Animal Disease Center-USDA-EUA. Professora titular da Universidade Federal de Viçosa. Têm experiência em Bioquímica Aplicada e Medicina Veterinária Preventiva, com ênfase em biologia molecular de vírus animais, atuando principalmente nos seguintes temas: infectologia molecular, diagnóstico, vacinas recombinantes e antivirais. Mateus Schreiner Garcez Lopes. Biólogo, Especialista em Gestão de Projetos, Doutor em Biotecnologia com ênfase em Engenharia Metabólica e cursando MBA em Agronegócios. Possui experiência internacional em P&D em biotecnologia e atualmente trabalha na Inovação Corporativa da Braskem S.A. com novos negócios em biotecnologia. Paulo Adriano Zaini. Biólogo e Doutor em Bioquímica pela USP. Atualmente é pesquisador nível pós-doutorado no Departamento de Bioquímica da Universidade de São Paulo. Trabalha com estudos de genômica comparativa e funcional de micro-organismos, com ênfase em bactérias fitopatogênicas. Paulo de Paiva Amaral. Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade de Brasília, Mestre em Bioquímica pela Universidade de São Paulo e Doutor em Genética Molecular pela Universidade de Queensland, Austrália. Atua como Pesquisador Associado no Wellcome Trust / Cancer Research UK Gurdon Institute, Universidade de Cambridge, Reino Unido. Sua pesquisa abrange a caracterização das funções, evolução e mecanismos de ação de RNAs regulatórios em vertebrados, com foco na regulação da cromatina. Renata Guerra de Sá Cota. Farmacêutica. Doutora em Bioquímica pela Universidade USP. Pós- doutora na área de Parasitologia Molecular pela USP. Professora Associada da Universidade Federal de Ouro Preto. Tem experiência nas áreas de Bioquímica e Biologia Molecular, com ênfase em Biologia Molecular de Parasitos. Talles Eduardo Ferreira Maciel. Bioquímico. Mestre e Doutor em Bioquímica Agrícola pela UFV. Atualmente é pesquisador nível pós-doutorado no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa; trabalhando essencialmente com Bioinformática. Trabalha com análise de dados oriundos de plataformas de sequenciamento de nova geração (tratamento inicial dos dados, montagem de genomas e transcriptomas, predição gênica e anotação), análise de expressão gênica diferencial, estudos de genômica comparativa e metagenômica. William de Castro Borges. Farmacêutico. Doutor em Bioquímica pela USP. Pós-doutor pelo Centre of Excellence in Mass Spectrometry - University of York / UK (2005 - 2007). Professor Adjunto do Departamento de Ciências Biológicas da UFOP. Trabalha com Bioquímica dando ênfase na área de Proteômica. Agradecimentos A todos os professores e pesquisadores que fizeram parte desta conquista, ora como membro de autoria em um dos capítulos, ora como orientadores em tomada de decisão. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e ao Projeto BIGA - Biologia Computacional (Coordenado pelo Prof. Dr. João Carlos Setubal) por fomentarem este sonho. À SBG (Sociedade Brasileira de Genética), em especial ao editor de livros Prof. Dr. Élgion Lúcio Silva Loreto, pelo apoio técnico nesta empreitada. Aos alunos dos cursos de graduação e pós-graduação que, de uma forma ou de outra, me mostraram a importância de produzir algo dentro desta linha de conhecimento. Aos professores/pesquisadores Fernando de Castro Reinach, Paulo Lee Ho, Carlos Frederico Martins Menck e Bayardo Baptista Torres por redigirem respectivamente os textos presentes no prefácio, forewords, orelha de capa e capa, respectivamente. A todos que de alguma forma participaram da construção e caracterização desta obra. Sumário Prefácio 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Prefácio 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Capítulo 1 História e importância da genômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Luciano Gomes Fietto; Márcia Rogéria de Almeida Lamëgo Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Cronologia das descobertas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Capítulo 2 Sequenciando genomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Juliana Lopes Rangel Fietto; Talles Eduardo Ferreira Maciel Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Metodologias de sequenciamento em pequena escala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 Sequenciamento químico de Maxam-Gilbert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 Método de Sanger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Aprimoramento do método de Sanger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Método automatizado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 Estratégias de sequenciamento de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Shotgun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Primer Walking .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Estratégias de sequenciamento de RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Sequenciamento de ESTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 Produção de bibliotecas de cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 Orestes (Open Reading Frame ESTs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing – NGS) . . . . . . . . . . . . . . . . .43 Plataforma 454 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43 Plataforma Illumina® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Plataforma SOLiD® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 Cronologia e evolução do sequenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54 Sanger × tecnologias de sequenciamento de segunda geração . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55 Sequenciamento do genoma humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56 Montagem de genomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 Predição gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58 Anotação gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Mapas genômicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 Genomas incompletos (draft): problemas e soluções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62 Capítulo 3 Construindo bancos de dados biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 Luciano Digiampietri; Jerônimo Conceição Ruiz Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 Tipos comuns de bancos de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 Arquivos texto (Flat text files) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 Arquivos XML (Extensible Markup Language) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 Relevância da linguagem Perl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69 O SGBD MySQL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 Acessando banco de dados relacionais utilizando Perl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 BioPerl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Interação na Web . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 Conceitos básicos de HTML . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 Uso de CGI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Scripts CGI escritos em Perl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Recebendo e retornando informações básicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 Permitindo interação Web com um banco de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80 Capítulo 4 Genômica comparativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 Francisco Prosdócimi; Leandro Marcio Moreira Introdução: por que comparar genomas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 Histórico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85 Comparando o conjunto de biomoléculas produzido em uma célula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85 Genes conservados, genes espécie-específicose herança vertical . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 Sintenia e mudança de organização estrutural de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .95 Genoma mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 Genes hipotéticos e conservados hipotéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 SNPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .98 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99 Capítulo 5 Plasticidade e fluxo genômico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 Leandro Marcio Moreira; Alessandro de Mello Varani Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 Plasticidade genômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .102 Reorganização da estrutura cromossômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Duplicação, inversão, deleção e translocação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .105 Elementos genéticos móveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .105 Fluxo do/no genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 Plasticidade do genoma e adaptação ao ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Plasticidade genômica e aquisição de genes de virulência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Capítulo 6 Filogenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Laila Alves Nahum; Jerônimo Conceição Ruiz Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Árvores evolutivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Homologia e evolução molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 Relações de homologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Mecanismos de evolução molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .122 Tipos de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123 Sequências moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123 Seleção de sequências para análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .124 Conteúdo gênico, ordem gênica e outros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125 Alinhamentos e reconstrução filogenética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .126 Outras considerações sobre o alinhamento de sequências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .129 Reconstrução de árvores evolutivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 Predição funcional de genes e seus produtos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .133 Predição funcional via filogenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .133 Exemplos de estudos usando filogenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135 Conclusões, desafios e perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .137 Agradecimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138 Capítulo 7 Mutassômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .143 Leandro Marcio Moreira; Marcia Regina Soares Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .143 Como induzir mutações para verificar perda de função gênica? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 Tipos de bibliotecas de mutantes . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 Mutações aleatórias usando cassetes de inserção com elementos de transposição . . . . 147 Mutações regiões específicas usando cassetes de recombinação homóloga . . . . . . . . . . . . 151 Geração de um duplo mutante em organismos diploides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .154 Mutações polares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 Bancos de dados integrativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 Bancos de dados contendo informações de mutantes em organismos-específicos . . . . . 157 Bancos de dados envolvendo mutações relacionadas com patologias-específicas . . . . .158 Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .159 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .159 Capítulo 8 Transcrissômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Leandro Marcio Moreira; Renata Guerra de Sá Cota; Camila Carrião M . Garcia Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Conceituando e destacando a importância dos transcrissomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .163 Um breve histórico envolvendo a análise de expressão gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 Análise global da expressão gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Análise em larga escala utilizando microarranjos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Fatores que interferem e prejudicam análises usando microarranos de DNA . . . . . . . . . . . . . 174 Obtenção das imagens de hibridação e análise preliminar dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . 175 Diferentes métodos para se analisar resultados de transcrissoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178 Análise por diagrama de Venn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178 Análise baseada em heat map (mapas de intensidade) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178 Análise de agrupamentos de genes baseada em K-means . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .179 Gráficos de indução × repressão gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .182 Capítulo 9 Análise proteômica: princípios e aplicações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .183 William de Castro Borges; Leandro Xavier Neves Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .183 A técnica de eletroforese bidimensional (2-DE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 A primeira dimensão: isoeletrofocalização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 A segunda dimensão: SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 A identificação de proteínas por espectrometria de massas e bioinformática . . . . . . . . . . . .187 A espectrometria de massas aplicada à análise de peptídeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 Bioinformática aplicada à proteômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .192 Identificação de proteínas em larga escala - Shotgun Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 Capítulo 10 Metabolômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 Jan Schripsema; Denise Saraiva Dagnino Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 Os metabólitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201 Açúcares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 Amino ácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Ácidos graxos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 Terpenóides . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 Ácidos orgânicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Flavonoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Outros fenólicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .210 Alcaloides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Das quantidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Previsão dos metabolitos presentes na amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .212 Coleta e extração da amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .213 Polaridade e solubilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .214 As técnicas analíticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .216 Processamento de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .219 A identificação dos metabolitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 Capítulo 11 Epigenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 Paulo de Paiva Amaral; Gonçalo Castelo-Branco Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 O que é epigenética? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 Cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 Regulação da estrutura da cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 Modificação do DNA por metilação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 Modificações covalentes de histonas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 Substituição de histonas por variantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236 Remodelamento de nucleossomos dependente de ATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 RNAs não-codificadores de proteínas e cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 A organização tridimensional da cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .241 Epigenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242 Tecnologias epigenômicas: mapeamento global de domínios funcionais da cromatina . . 243 Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 Douglas Destacar Estratégias de Captura da Conformação da Cromatina: 3C e suas variantes (4C, 5C e “HiC”) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246 3C (Captura de Conformação da Cromatina) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246 4C (“Captura de Conformação da Cromatina Circular” ou “Chromosome Conformation Capture on Chip”) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 5C (3C cópia de carbono ou “3C-carbon copy”) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 HiC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 ChIP-loop e ChIA-PET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250 Técnicas comuns para o estudo de metilação de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251 Conversão com bissulfito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251 Digestão diferencial de DNA metilado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 Técnicas de enriquecimento de DNA metilado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 Técnicas para determinação do estado de compactação da cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 EWAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 Conclusão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 Capítulo 12 Metagenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .261 Luciana Principal Antunes; Julio Cézar Franco de Oliveira Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .261 Estudo da diversidade microbiana a partir de amostras ambientais através de análise do rRNA por PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Metagenomas da microbiota ambiental e associada a hospedeiros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 Sequenciamento de alto-desempenho de metagenomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 Análise de metadados obtidos com sequenciamento de alto-desempenho . . . . . . . . . . . . . 269 O link funcional que estava faltando nas análises da metagenômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .271 Metagenômica e biotecnologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 Capítulo 13 Genômica e biologia de sistemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .277 Diego Bonatto; Helder Takashi Imoto Nakaya Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .277 Definindo a biologia de sistemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 Histórico da biologia de sistemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .281 Fluxo de informações nos sistemas biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 Tipos de biologia de sistemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284 Fundamentos teóricos da biologia de sistemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 Propriedades matemáticas das redes de interações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 A questão da modularidade biológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 Quantificando e modelando o sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295 Aplicações da biologia de sistemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 Estudos da interação DNA-proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298 Organização e evolução dos sistemas biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 Páginas na Internet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302 Capítulo 14 Genômica e o código de barras da vida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 Luiz Henrique Garcia Pereira; Claudio Oliveira Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 Como identificamos espécies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 Números da biodiversidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 Extinção . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308 Impedimento taxonômico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310 Métodos alternativos de identificação de espécies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311 Vantagens dos métodos moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .312 O código de barras da vida - DNA barcoding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .314 Fundamentos da técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .315 A escolha do segmento de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .318 Protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 Construção de bancos de dados . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330 Operação do banco de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330 Validação das sequências barcode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335 Aplicações do DNA barcoding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335 Limitações da metodologia de DNA barcoding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338 Críticas e controvérsias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339 Estado atual da arte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .341 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 Capítulo 15 Biologia sintética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 Paulo Adriano Zaini; Mateus Schreiner Garcez Lopes Introdução e bases conceituais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 Origens, bases de conhecimento e eventos históricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 Biobricks e a secretaria de partes padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 Dispositivos sintéticos: interruptores e portas lógicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362 Osciladores e uma bactéria que conta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 Sistemas gênicos multicelulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367 Estado da arte da BS: grupos de pesquisa e empresas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368 Pesquisas e projetos acadêmicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369 Fábricas de DNA, biopartes e informática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .371 BS aplicada aos combustíveis, químicos e biorremediação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372 Biotecnologia farmacêutica e medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375 Tratamento de câncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 Desenvolvimento de vacinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 Engenharia de microbiomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .381 Terapia celular e medicina regenerativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382 Biocomputação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383 Comunidade da biologia sintética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385 Do-It-Yourself Biology e a Ciência Cidadã . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385 Aspectos legais, bioética e biossegurança . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386 iGEM e SynbioBrasil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 388 Bibliografias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .391 Glossário . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 395 Apêndice 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399 Apêndice 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401 Apêndice 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403 17 Prefácio 1 Fernando Reinach O livro que você têm em mãos demonstra de maneira cabal o enorme progresso da Genômica nas últimas décadas. É impressionante o quanto a tecnologia mudou desde meados do século XX quando a estrutura do DNA foi descoberta. Hoje somos capazes de sequênciar genomas inteiros em dias, mapear padrões de expressão de RNAs, caracterizar a expressão de proteínas e até determinar o genoma de comunidades de microorganismos. Além disso a tecnologia necessária para alterar genes individuais ou conjuntosde genes em diversos tipos de organismos é hoje uma atividade quase rotineira. Todas essas tecnologias estão muito bem explicadas nos diversos capítulos desse livro, com exemplos de aplicações e ilustrações de ótima qualidade. A simples existência desse livro é uma demonstração que a Genômica é hoje uma área do conhecimento muito bem estabelecida em que o arcabouço teórico e experimental está suficientemente desenvolvido para permitir o surgimento de novas tecnologias e produtos. Essa é uma área do conhecimento em que os avanços estão deixando de ser revolucionários para serem incrementais. Mas isso não quer dizer que já sabemos o que está por ser descoberto. Olhando pela perspectiva do genoma e seus constituintes o que sabemos é impressionante. Mas se olharmos sob a perspectiva do fenótipo nossa ignorância é quase total. Sugiro ao leitor, antes e depois de ler esse livro, que faça o seguinte exercício mental. Imagine o olho de um vertebrado. Depois tente listar o que ainda falta para podermos descrever a formação desse olho durante a embriogênese com uma sequência de ativações e desativações de genes presentes do genoma no desse animal. Basta tentar fazer um exercício dessa natureza para perceber que apesar de termos técnicas altamente sofisticados para analisar e interpretar o genoma, ainda estamos longe de entender o que está codificado no DNA que compõe esse genoma. O estudo da Genômica só poderá ser considerado terminado quando, de posse da sequência de DNA de um dado organismos, formos capazes de derivar e descrever a forma do seu corpo, seu desenvolvimento embrionário, parte de seu comportamento, e seu ciclo de vida. Ainda estamos muito, muito longe essa façanha. É por isso que a leitura desse livro impressiona. Se por um lado ela demonstra o quanto esta ciência progrediu nos últimos 6 0 anos, por outro lado deixa claro o quanto ainda temos pela frente. 19 Prefácio 2 Dr. Paulo Lee Ho Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq - Nível 1A - CA BI - Biotecnologia Pesquisador Científico IV e Diretor Técnico da Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção do Instituto Butantan A obra “Ciências Genômicas: fundamentos e aplicações”, organizada pelo Prof. Dr. Leandro Márcio Moreira, contém diversos capítulos escritos por vários especialistas reconhecidos em suas áreas de atuação, incluindo o próprio Prof. Leandro. Tem o suporte da Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior), da Sociedade Brasileira de Genética e da Universidade Federal de Ouro Preto. Portanto, ela já se apresenta com vários selos de qualidade, que é confirmada com sua leitura. Organizar e escrever uma obra técnica-científica, como o presente livro, é um desafio ingrato e de grande risco. O livro tem um propósito diferente de um artigo científico e busca revisar o conhecimento atual, de forma a educar um leitor fora da área e ao mesmo tempo organizar esse conhecimento e discuti-lo criticamente, permitindo àqueles que atuam em ciências genômicas, uma visão orgânica e atual dos mesmos. Por ser uma área técnico-científica, novos conhecimentos são gerados a cada dia. Assim, escrever um livro com tal conteúdo significa que ele já está desatualizado quando é finalizado. Desta maneira, este livro é muito diferente de um livro de romance, de crônicas, entre outros, que são obras perenes. Ainda assim, um livro técnico-científico é necessário e de grande importância, pois em função dos avanços diários no conhecimento científico, da complexidade e do grande volume de informações, facilita o acompanhamento no desenvolvimento das pesquisas e os avanços teóricos e técnicos da área, mesmo para os mais experimentados no assunto. Conheci o Prof. Leandro quando foi meu aluno. Ele já era um aluno que se destacava dos demais não somente quanto à facilidade de aprendizado, mas também pelo “brilho nos olhos”, de querer fazer mais, de querer melhorar sempre, de querer aprender constantemente, características imprescindíveis a um cientista. Outras qualidades que me chamaram a atenção foram sua honestidade, sinceridade e a transparência das suas ideias. De fato, esta obra é produto de um profissional preocupado em educar e passar adiante os conhecimentos, de uma pessoa que pensa grande. O País precisa de talentos e de profissionais ousados como o Prof. Leandro, que aceitou o desafio de organizar este livro com todos os riscos mencionados acima. A leitura do livro é apenas o início da aventura do conhecimento. Se ela for bem-sucedida, irá envolver as mentes de jovens Ciências genômicas: fundamentos e aplicações20 estudantes com perguntas, curiosidades, desejo de conhecer mais e mais esta área, de experimentar, de entender os fatos da natureza, de criar conhecimento, de contribuir para o bem-estar da humanidade com os novos conhecimentos científicos. E é isto o que importa, pois estes jovens irão construir o futuro deste País e irão inspirar outros jovens estudantes e assim, sucessivamente. Parabéns ao Prof. Leandro, aos autores dos capítulos, à Editora e aos patrocinadores pelo excelente trabalho. 21 1 História e importância da genômica Luciano Gomes Fietto Márcia Rogéria de Almeida Lamëgo Introdução Várias descobertas podem ser consideradas como o início da Ciência Genômica (Singer and Berg 2004). Na Tabela 1 está representada uma linha do tempo, onde descobertas no estudo da Genética e da Biologia Molecular estão listadas como fundamentais para o desenvolvimento da Genômica como nós a conhecemos hoje. Muitos leitores sentirão falta de algumas descobertas importantes ou mesmo não considerarão algumas destas apresentadas como importantes para o desenvolvimento desta importante e moderna Ciência. Este fato é esperado já que apesar de descobertas importantes serem atribuídas a uma pessoa ou a um grupo específico, certamente os achados fundamentais estão baseados em uma bibliografia vasta e coerente. Desse modo podemos considerar a Genômica uma ciência moderna que surgiu e cresceu pela convergência de outras ciências, principalmente a Bioquímica, a Estatística e a Ciência da Computação. O objetivo central deste capítulo é posicionar o leitor num contexto histórico que o permita compreender melhor a importância destas descobertas no atual desenvolvimento da Ciência Genômica. Ao mesmo tempo, esperamos que esta proposta possa ser amplamente utilizada por docentes e alunos dos mais variados cursos de graduação e pós-graduação como uma ferramenta fundamental ao desenvolvimento de disciplinas relacionadas. Após uma breve descrição e cronologia das principais descobertas faremos uma abordagem detalhada de algumas experimentações que consideramos fundamentais e deveriam ser discutidas com todos os alunos formandos em ciências biológicas, uma forma de resgatar o conhecimento histórico e o desenvolvimento do pensamento científico. Ciências genômicas: fundamentos e aplicações22 Cronologia das descobertas Desde que Gregor Mendel realizou experimento com ervilhas e definiu os primeiros conceitos na genética, em 1858, se passou mais de um século até que os primeiros genomas viessem a ser sequenciados. Após o primeiro genoma ser decifrado, em pouco mais de uma década foram sequenciados os genomas completos de vários organismos procariotas e eucariotas, chegando até o genoma humano. Simplificando a linha do tempo podemos considerar o nascimento da Era Genômica quando o genoma de 5.375 mil pares de bases do Bacteriófago ɸx174 foi determinado (Sanger, Air et al. 1977). Outra revolucionária técnica descrita por Sanger conhecida como shotgun, que consiste no isolamento de pedaços randômicos do DNA que depois de sequenciados são agrupados em pedaços maiores até a montagem completa de uma longa sequência de DNA contínua, possibilitou o sequenciamento do Bacteriófago λ que possui um genoma de 48.502
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