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ESPECTROSCOPIA APLICADA A ANÁLISE DE MEDICAMENTOS REGIÃO DO ULTRAVIOLETA E VISÍVEL E INFRAVERMELHO 1 Faculdade de Farmácia Disciplina: Análises Farmacêuticas - Noturno Profa Dra Adriana Passos Oliveira Email: adrianapassos@pharma.ufrj.br Espectro eletromagnético 2 PAVIA, D. L., et. al., 2001. Introdução à espectroscopia –3ª edição. p. 14. Introdução a Espectroscopia 3 PAVIA, D. L., et. al., 2001. Introdução à espectroscopia –3ª edição. p. 14. Espectroscopia na região do Ultravioleta e Visível Conteúdo: • Espectroscopia de absorção UV-Vis. • Análise Qualitativa • Análise Quantitativa – ponto-duplo; – coeficiente de extinção; – curva de calibração; 4 • Ultra-violeta – 200-400nm • Visível – 400 – 800nm • A absorção da energia é quantizada e conduz a passagem dos elétrons de orbitais do estado fundamental para orbitais de maior energia em um estado excitado. Espectroscopia de absorção no UV-Vis 5 Espectroscopia: Estudo da interação entre a matéria e a radiação eletromagnética – energia radiante que apresenta tanto as propriedades de partículas quanto de ondas. PAVIA, D. L., et. al., 2012. Introdução à espectroscopia – tradução da 4ª edição norteamericana. CENGAGE. p. 365. • A radiação UV/visível causa transições eletrônicas em uma molécula, promovendo a passagem de elétrons de um orbital ligante para um antiligante (instável). Essa energia pode ser quantizada TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS HOMO: Highest Occupied Molecular Orbital LUMO : Lowest Unoccupied Molecular Orbital Espectroscopia de absorção no UV-Vis 6 n p* - Passagem de é não compartilhado para um orbital p instável (antiligante) C O C O C O C O • CROMÓFOROS: unidades da molécula responsáveis pela absorção • Mais comuns: sistemas C=C (p to p*) and C=O (n to p*) Energia l Espectroscopia de absorção no UV-Vis 7 8 - Pequenas absortividades molares são características de transições n p*, sendo muito difíceis de serem detectadas. - Transições p p* são mais úteis em espectroscopia no UV/Vis. Espectroscopia de absorção no UV-Vis 9 PAVIA, D. L., et. al., 2001. Introdução à espectroscopia –3ª edição. p. 14. A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a energia radiante Luz incidente Luz emergente Luz absorvida Perdas: - reflexões - dispersão -absorção •Boa sensibilidade •Baixo custo de análise •Fácil operação •Equipamentos robustos Espectroscopia de absorção no UV-Vis Cores de Radiação Região do Visível Lei de Beer-Lambert A espectroscopia de absorção molecular está baseada na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que estão relacionadas através das equações: 12 Substâncias com o mesmo cromóforo mesmo lmáx A Lei de Lambert-Beer - Em um dado comprimento de onda, a absorbância de uma amostra depende da quantidade de espécie absorvente que a luz encontra ao passar através de uma solução da mesma. - A absorbância depende tanto da concentração da amostra quanto do comprimento do caminho da luz através da amostra. A = cl A = absorbância da amostra = log I0/I I0 = intensidade da radiação incidindo sobre a amostra I = intensidade da radiação emergindo da amostra C = concentração da amostra, em mol/l l = comprimento do caminho percorrido pela luz através da amostra, em centímetros = absortividade molar (litro mol-1 cm-1) Espectroscopia de absorção no UV-Vis 13 - A absortividade molar (também denominada coeficiente de extinção) de uma substância é uma constante que é característica da substância em um comprimento de onda específico. - É a absorbância que deve ser observada para uma solução 1 M com um caminho de 1 cm de comprimento. - A absortividade molar da acetona, por exemplo, é 9000 a 195 nm e 13.6 a 274 nm. - O solvente no qual a amostra está dissolvida quando o espectro é confeccionado deve ser relatado porque a absortividade molar não é exatamente a mesma em todos os solventes. lmáx 195 nm (máx = 9000, hexano); lmáx 274 nm (máx = 13.6, hexano) - Sendo a absorbância proporcional a concentração, a concentração de uma solução pode ser determinada se a absorbância e a absortividade molar em um comprimento de onda particular são conhecidos. Espectroscopia de absorção no UV-Vis 14 Efeito da Conjugação sobre o lmáx ligações duplas conjugadas LUMO (orbital molecular desocupado de mais baixa energia) HOMO (orbital molecular ocupado de maior energia) Menor E requerida para um sistema conjugado Espectroscopia de absorção no UV-Vis 15 - Quanto mais ligações duplas conjugadas existirem em uma substância, menor a energia requerida para a transição eletrônica maior será o l na qual a transição ocorrerá. - o lmáx de uma substância pode ser usado para predizer o número de ligações duplas conjugadas numa dada substância. - Se uma substância possui ligações duplas conjugadas suficientes, ela irá absorver luz visível (lmáx 400 nm) e a substância será colorida. Espectroscopia de absorção no UV-Vis 16 - Um auxocromo é um substituinte que, quando ligado a um cromóforo, altera o lmáx e a intensidade de absorção, geralmente aumentando os dois; grupos OH e NH2 são auxocromos. lmáx Deslocamento para o vermelho Deslocamento para o azul Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Qualitativa 240 250 260 270 280 290 300 Comprimento de onda (nm) 2 ,0 2 ,2 2 ,4 2 ,6 2 ,8 3 ,0 3 ,2 L o g ε A ou B C D C5H11 C5H11 OH C5H11 R OH OH R OH C5H11 OH OH OH OH (A) (B) (C) (D) Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis. Espectroscopia de absorção no UV-Vis • Análise quantitativa de uma determinada substância pode ser realizada por UV/VIS. Para isso é necessário: • Que a substância absorva na região UV/VIS (presença de grupos cromofóricos na molécula) • Apresentar especificidade no l da análise • Pode ser utilizado para quantificação: • De uma substância específica (Ex: teor em hypericina) • De uma classe de substâncias (Ex: flavonóides totais) 18 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa A concentração da amostra pode ser calculada utilizando um dos 3 procedimentos: 1- Padronização por ponto duplo ou simples Envolve a leitura da absorbância da amostra e da solução contendo o padrão. A concentração do padrão deve ser próxima a da amostra. É ideal quando existe um padrão com alto grau de pureza. Ca = Aa x Cp / Ap Análise de Matéria Prima e Produto Acabado Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa 19 A C B Absorbância Absortividade molar Concentração molar Comprimento de percurso da célula Lei de Lambert-Beer. BCA aa BCA pp BCA p p a a C A C A p a pa A A CC aC aA Absorbância da amostra Conc. da amostra pA pC Absorbância do padrão Conc. do padrão (A) Solução amostra (B) Solução padrão Substituindo (A) em (B) 20 Espectroscopia de absorção no UV Análise Quantitativa: Ponto duploValor rotulado da amostra: 250 mg/100mL Farm. Bras. 4 Ed, Parte II, 1 fascículo Tomada da amostra: 10 mL Absorbância da amostra = 0,336 Absorbância do padrão = 0,350 Qual a concentração de prometazina obtida para a amostra? 21 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa p a pa A A CC Solução padrão: 25 mg 50 mL 100 mL 5 mL Cp = 0,025 mg/mL Ap = 0,350 Ca = 0,024 mg/mL Solução amostra Massa correspondente a 25 mg 100 mL 50 mL 5 mL Aa = 0,336 Teor = 96% 22 Ca = ? Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa: Ponto duplo 2- Usando valores de absortividade padrão Coeficiente de Extinção OU Absorbância Específica, representado por A1% equivalente a solução 1% (p/v) do padrão. Utilizado quando a substância é estável e tem uma banda de absorção ampla e clara, praticamente não afetada por parâmetros instrumentais. É útil quando a substância de referência é cara ou difícil de se obter. 23 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa: Coeficiente de extinção (A1% ) Farm. Bras. 5 Ed, volume 2 Furosemida comprimidos 40 mg p a pa A A CC Solução padrão: A1%,1cm = 580 em 271 nm Cp = 1% = 1g/100mL = 10 mg/mL Ap = 580 Ca = 0,0078 mg/mL Solução amostra 100 mL 50 mL 1 mL Ca = ? Aa = 0,450 Teor = 97,5 % 24 Massa correspondente a 40 mg Espectroscopia de absorção no UV Análise Quantitativa: Coeficiente de extinção (A1% ) • É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. • A relação matemática entre o sinal e a concentração ou massa da espécie de interesse deve ser determinada empiricamente. Essa relação matemática pode ser expressa como uma equação de reta chamada de curva de calibração. • No mínimo 5 concentrações diferentes. • Efetuar análise por no mínimo 3 vezes, cada • Plotar diagrama de dispersão dos pontos: Y = f ( X ) • Aplica-se reta de regressão linear: Y = a + b X 25 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa: Curva de calibração 3- Usando curva de calibração • No mínimo 5 concentrações diferentes, dentro da seguinte faixa: Ensaio Intervalo Determinação Quantitativa 80% a 120% concentração teórica Uniformidade Conteúdo 70% a 130% concentração teórica Teste de dissolução ± 20% além do intervalo especificado; impurezas do nível esperado até 120% do limite máximo especificado. • A relação linear simples, descrita pela equação y = ax + b, só é válida em um determinado intervalo de massa ou concentração da espécie medida. • Faixa de aplicação corresponde ao intervalo entre o valor superior e inferior da substância em exame, que atenda aos requisitos de precisão e exatidão. • Depende da aplicação pretendida do método. 26 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa: Curva de calibração Brasil 2003. Ministério da Saúde. ANVISA. RE n º 899 de 29 de maio de 2003. Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Faixa (Intervalo) de concentração Calcular os coeficientes de regressão a e b da curva analítica através do método matemático conhecido como regressão linear Calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlação r. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. Um coeficiente de correlação maior que 0,99 é considerado como evidência de um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão. Reportar : coeficiente linear da reta (a) ; coeficiente angular da reta (b) ; coeficiente de correlação (r) Ideal r > 0,99 Fitoterápico r > 0,98 Critério de aceitação 27 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa: Curva de calibração CUIDADOS BÁSICOS Usar cubetas bem limpas: de quartzo para análise na região do ultra-violeta e de quartzo ou vidro para a região do visível (400 – 750nm); Usar sempre solvente de grau espectroscópico; Solvente deve ser transparente na área a ser analisada. 28 Espectroscopia de absorção no UVc Na amostra poder conter outros componentes, além do principio ativo que podem absorver no comprimento de onda de leitura, ausentes na solução padrão? Isto produziria alguma interferência no resultado? O principio ativo tem o grupamento cromóforo que absorve no comprimento de onda especifico de leitura. São poucas as substancias na formulação que absorvem neste comprimento, portanto há poucos interferentes. 29 Espectroscopia de absorção no UV-Vis Análise Quantitativa
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