REGULAÇÃO DA EXP. GÊNICA

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Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por: 
Ana Mafalda Valente 
Ana Teresa Cordeiro 
Andreia Santos 
Carolina Ruivo 
Pedro Faria 
Tiago Silva 
Vasco Conceição 
 
Apontamentos 
de Engenharia 
Biomolecular 
e Celular 
2013 
Apontamentos baseados nas aulas do ano letivo 2012/2013, na literatura 
sugerida e em alguns sites visitados. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
2 
Índice 
1 RNA de Interferência ............................................................................................................. 8 
1.1 Funções do RNAi ........................................................................................................... 9 
1.2 Obstáculos à Utilização de RNAi em Terapêutica ....................................................... 10 
1.3 Estratégias para Entrega de siRNAs em Terapêutica in vivo ....................................... 11 
1.4 RNAi para Estudar a Função dos Genes ...................................................................... 13 
1.5 Screening Genético Clássico vs Screening RNAi .......................................................... 14 
1.6 Biblioteca TRC .............................................................................................................. 14 
1.7 Regulação da Resposta Imunitária Através do Splicing Alternativo ........................... 15 
2 Sinalização Celular ............................................................................................................... 16 
2.1 Formas de Sinalização ................................................................................................. 17 
2.2 Alterações que Induzem o Aparecimento de Células Cancerígenas ........................... 20 
2.3 Acetilcolina .................................................................................................................. 20 
2.4 Óxido Nítrico ............................................................................................................... 21 
2.5 Moléculas Sinalizadoras Hidrofóbicas ......................................................................... 22 
2.6 Moléculas Sinalizadoras Hidrofílicas vs Hidrofóbicas .................................................. 22 
2.7 Tipos de Resposta........................................................................................................ 22 
2.8 Classes de Recetores ................................................................................................... 23 
2.9 Interruptores Moleculares .......................................................................................... 26 
2.10 Complexos Sinalizadores Intracelulares ...................................................................... 26 
2.11 Domínios de Ligação ................................................................................................... 27 
2.12 Mecanismo para o Aumento da Brusquidão de Resposta .......................................... 28 
2.13 Finalização da Resposta .............................................................................................. 30 
2.14 Recetores Acoplados à Proteína G .............................................................................. 31 
2.15 Recetores Acoplados a Enzimas .................................................................................. 33 
2.15.1 Ativação dos Recetores ....................................................................................... 34 
2.15.2 Proteína Ras ........................................................................................................ 35 
2.15.3 Proteínas Map-cinase .......................................................................................... 36 
2.15.4 Via de Sinalização que Envolve a Proteína PI 3-cinase ........................................ 37 
2.15.5 Via de Sinalização que Envolve a Proteína Cinase B ........................................... 38 
2.15.6 Via de Sinalização Jak-STAT ................................................................................. 39 
2.15.7 Via de Sinalização TGF-β...................................................................................... 40 
3 Trânsito Vesicular Intracelular ............................................................................................ 41 
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3 
3.1 Os Compartimentos Intracelulares da Célula Eucariótica e o seu Envolvimento na Via 
Biossintética Secretora e Vias Eucarióticas ............................................................................. 41 
3.2 Vesículas Revestidas .................................................................................................... 42 
3.3 Formação de Vesículas Revestidas .............................................................................. 43 
3.4 SNAREs ........................................................................................................................ 45 
3.5 Entrada de Vírus .......................................................................................................... 47 
3.6 Transporte a Partir do RE ............................................................................................ 48 
3.7 Fusão Membranar Homotípica ................................................................................... 49 
3.8 Via de Recuperação do RE ........................................................................................... 49 
3.9 Complexo de Golgi ...................................................................................................... 50 
3.10 Lisossomas ................................................................................................................... 52 
3.10.1 Vias para o Lisossoma ......................................................................................... 52 
3.11 Recetor Manose 6-Fosfato (M6P) ............................................................................... 54 
3.12 Vesículas Pinocíticas .................................................................................................... 55 
3.13 Endocitose de Macromoléculas .................................................................................. 55 
3.13.1 Possíveis Destinos para um Recetor Membranar que foi Endocitado ................ 56 
3.14 Transcitose .................................................................................................................. 58 
3.15 Domínios Celulares ...................................................................................................... 59 
3.16 Vias Secretoras ............................................................................................................ 59 
3.17 Diferença entre Domínios ........................................................................................... 60 
4 Células Estaminais ............................................................................................................... 62 
4.1 Classificação das Células Estaminais ........................................................................... 65 
4.1.1 Células Estaminais Pluripotentes ........................................................................ 67 
4.1.2 Yamanaka e os seus Estudos sobre Células Estaminais Pluripotentes Induzidas 
(iPSCs) 73 
4.1.3 Células Estaminais Multipotentes ....................................................................... 74 
5 Células Estaminais Mesenquimais/Estromais (Seminário) ................................................. 79 
5.1.1 Funções ............................................................................................................... 79 
5.1.2 Fonte ...................................................................................................................79 
5.1.3 Ensaios Clínicos ................................................................................................... 80 
5.1.4 Expansão ............................................................................................................. 80 
5.1.5 Hipoxia ................................................................................................................. 81 
5.1.6 Reatores Biológicos ............................................................................................. 83 
6 Isolação e Purificação de Produtos Biológicos .................................................................... 87 
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4 
6.1 Processo de Produção de Produtos Biológicos ........................................................... 89 
6.1.1 Matéria-Prima ..................................................................................................... 91 
6.1.2 Processamento Upstream ................................................................................... 91 
6.1.3 Processamento Downstream .............................................................................. 92 
6.1.4 Anticorpos ......................................................................................................... 102 
7 Estrutura e Função da Proteína ......................................................................................... 107 
7.1 Aminoácidos .............................................................................................................. 108 
7.2 Hierarquia Estrutural da Proteína ............................................................................. 112 
7.2.1 Outros Tipos de Proteínas ................................................................................. 117 
7.3 X-Rays Crystallography – The Tool of Structural Biology .......................................... 117 
7.4 Outras Técnicas para Determinar a Estrutura das Proteínas .................................... 119 
7.5 Enzimas ...................................................................................................................... 119 
8 Estabilidade Estrutural de Proteínas Heme Artificiais Geradas a partir de Mioglobinas e 
Moléculas Fotoelétricas (Seminário) ......................................................................................... 125 
8.1 Cromóforos ............................................................................................................... 125 
8.2 Proteína Heme .......................................................................................................... 126 
8.3 Mioglobina ................................................................................................................ 127 
8.4 Ligação do O2 à Mioglobina ....................................................................................... 127 
8.5 Dicroísmo Circular ..................................................................................................... 128 
8.5.1 Diagrama de um Espectrofotómetro de Dicroísmo Circular ............................. 129 
8.5.2 Condições Típicas .............................................................................................. 129 
8.5.3 Estudo da Estrutura Terciária e Secundária ...................................................... 130 
8.5.4 Aplicações da Técnica ........................................................................................ 130 
8.5.5 Vantagens da Técnica ........................................................................................ 130 
8.6 Fluorescência ............................................................................................................. 131 
8.6.1 Diagrama de Fluorómetro ................................................................................. 131 
8.6.2 Tipos de Fluoróforos ......................................................................................... 131 
8.6.3 Microscópio de Fluorescência ........................................................................... 131 
8.6.4 Correlação Espetroscópica de Fluorescência (FCS) ........................................... 133 
8.6.5 Desnaturação .................................................................................................... 135 
8.6.6 Vantagens da Espectroscopia Fluorescente ...................................................... 135 
8.7 Alteração de Proteínas Heme ................................................................................... 136 
8.8 Extração do Grupo Heme da Mioglobina .................................................................. 136 
8.9 Inserção do Novo Grupo Heme na Proteína ............................................................. 137 
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5 
9 Conformação e Função das Proteínas ............................................................................... 138 
9.1 Dinâmica do Folding de Proteínas ............................................................................. 140 
9.1.1 Métodos Atuais na Previsão da Estrutura das Proteínas .................................. 144 
9.2 Estabilização da Estrutura da Proteína...................................................................... 144 
9.3 Processo de Naturação/Desnaturação Cooperativo ................................................. 146 
9.3.1 Estudo da Desnaturação Térmica da Quimotripsina-α ..................................... 146 
9.4 Termodinâmica ......................................................................................................... 148 
10 Estabilidade de Proteínas .............................................................................................. 150 
10.1 Estabilidade Termodinâmica vs Estabilidade Cinética .............................................. 150 
10.2 Estratégias de Estabilização de Proteínas ................................................................. 154 
10.2.1 Engenharia do Meio .......................................................................................... 155 
10.2.2 Modificações Químicas ..................................................................................... 155 
10.2.3 Engenharia de Proteínas ................................................................................... 156 
10.2.4 Imobilização ...................................................................................................... 156 
10.2.5 Abordagens para Estabilizar a Cutinase ............................................................ 157 
11 Engenharia de Proteínas ............................................................................................... 160 
11.1 In vitro Approach ....................................................................................................... 161 
11.1.1 Site Directed Mutagenesis – Mutagénese Dirigida ........................................... 161 
11.1.2 Error prone PCR (PCR Propenso a Erros) ........................................................... 163 
11.1.3 DNA Shuffling ou Sexual PCR ............................................................................. 165 
11.2 Seleção ...................................................................................................................... 166 
11.2.1 Ribosome Display .............................................................................................. 167 
11.2.2 mRNA Display .................................................................................................... 167 
11.2.3 In vitro Compartmentalization .......................................................................... 168 
11.2.4 Cell Surface Display ........................................................................................... 169 
11.3 Protein Engineering: Approaches ..............................................................................171 
11.3.1 Design ................................................................................................................ 171 
11.3.2 Re-Design........................................................................................................... 172 
11.4 Protein Terrorism – Exemplos de Aplicação .............................................................. 173 
11.4.1 Afinidade de Hemoglobina Sintetizada ............................................................. 174 
11.4.2 Modificações na Insulina ................................................................................... 174 
11.4.3 Anticorpos para o Tratamento de Cancro ......................................................... 175 
11.4.4 Animais – Leite .................................................................................................. 176 
11.4.5 Plantas ............................................................................................................... 178 
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6 
11.4.6 Sistemas de Expressão Cell-Free ....................................................................... 179 
11.5 Proteínas Fluorescentes ............................................................................................ 180 
11.6 Proteínas Motoras ..................................................................................................... 184 
11.7 Proteína Dedos de Zinco (ZFP) .................................................................................. 186 
12 Engenharia dos Ácidos Nucleicos .................................................................................. 187 
12.1 Paradigmas da Biologia Molecular ............................................................................ 187 
12.2 Ácidos Nucleicos ........................................................................................................ 187 
12.2.1 Nomenclatura de Nucleótidos .......................................................................... 187 
12.2.2 Estrutura Primária dos Ácidos Nucleicos........................................................... 189 
12.2.3 Estrutura Secundária dos Ácidos Nucleicos ...................................................... 189 
12.2.4 Estrutura Terciária dos Ácidos Nucleicos .......................................................... 201 
12.2.5 Interação entre Proteínas e DNA ...................................................................... 203 
12.2.6 Interação entre Fármacos e DNA ...................................................................... 205 
12.2.7 RNA .................................................................................................................... 205 
12.2.8 PNA .................................................................................................................... 207 
12.2.9 Aplicações dos Ácidos Nucleicos ....................................................................... 207 
12.2.10 Síntese de Ácidos Nucleicos .......................................................................... 208 
13 Terapia Genética ........................................................................................................... 209 
13.1 Introdução ................................................................................................................. 209 
13.2 Terapia Génica ........................................................................................................... 210 
13.2.1 Alvos .................................................................................................................. 211 
13.2.2 Requerimentos .................................................................................................. 212 
13.2.3 Ensaios Clínicos ................................................................................................. 212 
13.2.4 Vetores .............................................................................................................. 213 
13.2.5 Mecanismos de Introdução dos Vetores e Genes ............................................. 213 
13.2.6 Administração ................................................................................................... 214 
13.2.7 Principais Marcos Históricos ............................................................................. 214 
13.2.8 Fases do Ensaio Clínico ...................................................................................... 214 
13.2.9 Genes na Terapia Génica ................................................................................... 215 
13.2.10 Metodologia – Síntese ................................................................................... 218 
13.2.11 Vacinas de DNA ............................................................................................. 219 
14 DNA Microarrays ........................................................................................................... 220 
14.1 Perspetiva Histórica................................................................................................... 220 
14.2 Definições e Aplicações Gerais .................................................................................. 220 
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7 
14.3 Fabricação ................................................................................................................. 222 
14.3.1 Mecanismo de Reconhecimento ....................................................................... 222 
14.3.2 Biomoléculas ..................................................................................................... 223 
14.3.3 Suportes Sólidos ................................................................................................ 224 
14.3.4 Imobilização das Sondas.................................................................................... 225 
14.3.5 Sistemas de Leitura ........................................................................................... 229 
14.4 Dispositivos Lab-on-Chip e Testes PoC ...................................................................... 238 
14.5 Desafios Futuros ........................................................................................................ 239 
15 Doenças Priónicas (Seminário) ...................................................................................... 242 
15.1 Investigação Atualmente........................................................................................... 245 
 
 
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8 
1 RNA de Interferência 
 
O RNAi, ou seja, RNA de interferência, é um processo que decorre em alguns 
organismos eucarióticos, integrando a maquinaria que controla a expressão genética através 
do silenciamento de determinados genes. 
Neste processo existem dois tipos de moléculas que são cruciais: siRNAs (small 
interfering RNAs) que derivam de cadeias duplas de RNA (dsRNA) e miRNAs (micro RNAs) que 
são produzidos no núcleo da célula. Os siRNAs são moléculas produzidas no interior da célula, 
ou são injetadas na célula experimentalmente para estudo da função genética. Os miRNAs são 
moléculas que possuem auto-complementaridade o que lhes confere a capacidade de se 
dobrarem sobre si próprias. 
Este processo inicia-se com a clivagem de dsRNA (RNA de cadeia dupla), que é levada 
a cabo pela endonuclease Dicer, culminando na formação de miRNA e siRNA. Em seguida, 
estas pequenas moléculas ligam-se à proteína argonauta (apenas uma das cadeias é 
selecionada e mantém-se ligada a esta proteína) formando, juntamente com outras proteínas, 
o complexo proteico RISC (RNA induced silencing complex). 
Tanto o siRNA como o miRNA induzem a ligação deste complexo proteico com o 
mRNA. A ligação induzidapor siRNA é muito precisa devido ao alto grau de 
complementaridade entre o siRNA e o mRNA alvo. Já a ligação induzida por miRNA não é 
muito precisa, já que apenas uma parte desta molécula se liga ao mRNA alvo. Esta 
característica possibilita a ligação de um único miRNA a vários mRNA’s. 
Após a ligação induzida por siRNA a argonauta cliva o mRNA conduzindo à degradação 
do mesmo. No caso das ligações induzidas por miRNA, além desta hipótese, pode também 
ocorrer apenas inibição temporária da tradução do mRNA alvo, sem que este seja degradado, 
impedindo a polimerase de fazer a transcrição do mRNA. 
 
 
Figura 1 - Processo de silenciamento de genes através de RNAi. 
 
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9 
1.1 Funções do RNAi 
 
Em 2006, Andrew Z. Fire e Craig C. Mello receberam o prémio Nobel da Medicina e 
Fisiologia pela descoberta do RNA de interferência. Naturalmente que a descoberta deste 
fenómeno abriu muitas portas no campo da investigação e deixou perspetivas para a sua 
utilização na cura de várias doenças genéticas congénitas ou adquiridas. 
Através do silenciar de certos genes podemos entender melhor qual a sua função na 
célula, validar relações estatísticas entre a expressão genética e os fenótipos, investigar 
modos de ação combinada, e - como já foi de resto referido - tratar várias doenças de origem 
genética. Esta perspetiva, embora prometedora, tem-se revelado algo problemática. 
Na tabela seguinte apresentam-se algumas classes de RNAi e várias informações sobre 
estas. 
 
Classe 
Tamanho 
(nucleótidos) 
Funções Mecanismos Origem 
Organismos em que 
é encontrado 
siRNAs 21 - 25 
Regula a 
expressão 
genética, fornece 
resposta antiviral 
e restringe 
transposões 
Degradação 
de RNA, 
restrição de 
transposões 
Regiões 
intergénicas, 
exões, intrões 
Caenorhabditis 
elegans, 
Drosophila 
melanogaster, 
Schizosaccharomyces 
pombe, 
Arabidopsis thaliana, 
Oryza sativa (arroz) 
Endo-
siRNAs 
21 - 25 
Restringe 
transposões, 
regula mRNAs e 
heterocromatina 
Degradação 
de RNA 
Elementos 
transposable, 
pseudogenes 
D. melanogaster, 
mamíferos 
miRNAs 21 - 25 
Regula a 
expressão 
genética após-
transcrição 
Bloqueio da 
translação, 
degradação 
de RNA 
Regiões 
intergénicas, 
intrões 
C. elegans, D. 
melanogaster, S. 
pombe, 
A. thaliana, O. sativa, 
mamíferos 
piRNAs 24 - 31 
Regula o 
desenvolvimento 
e integridade da 
linha germinativa 
Desconhecida 
Sequências 
defeituosas de 
transposões e 
outras 
repetições 
C. elegans, D. 
melanogaster, Danio 
rerio, 
mammals 
ra-
siRNAs 
23 - 28 
Remodela a 
cromatina, 
silencia genes a 
ser transcritos 
Desconhecida 
Elementos de 
repetição 
(subconjuntos 
de piRNAs) 
C. elegans, D. 
melanogaster, S. 
pombe, 
Trypanosoma brucei, 
D. rerio, A. thaliana 
ta-
siRNAs 
21 - 22 
Clivagem de 
mRNAs 
endógenos 
Degradação 
de RNA 
Transcritos 
não 
codificantes 
endógenos 
D. melanogaster, S. 
pombe, A. thaliana, 
O. sativa 
natRNAs 21 - 22 
Regula a 
expressão 
genética após 
transcrição 
Degradação 
de RNA 
Convergent 
partly 
overlapping 
transcripts 
A. thaliana 
scnRNAs 26 - 30 
Regula a 
estrutura da 
Eliminação de 
DNA 
Meiotic 
micronuclei 
Tetrahymena 
thermophila, 
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10 
cromatina Paramecium 
tetraurelia 
tncRNAs 22 Desconhecida Desconhecido 
Regiões não 
codificantes 
C. elegans 
Tabela 1 - Classes de RNAi. 
 
1.2 Obstáculos à Utilização de RNAi em Terapêutica 
 
À partida, esta parece uma técnica prática para resolver várias questões pendentes em 
medicina, contudo, ao esmiuçar bem a questão constatam-se vários problemas. 
Para começar é complicado fazer com que as moléculas de silenciamento atinjam as 
células pretendidas. Por exemplo, na doença de Huntington é necessário fazer com que estas 
moléculas atinjam o cérebro, o que é muito complicado uma vez que o cérebro tem um 
“escudo” natural contra a entrada de substâncias estranhas através do sangue. Em geral este 
facto funciona a nosso favor mas, neste caso em particular, dificulta-nos a vida. 
Por outro lado, mesmo após se atingir as células de interesse e conseguir o 
silenciamento do gene pretendido há o risco da molécula de silenciamento se ligar a genes 
cujo o silenciamento não seja do nosso interesse. Além disso, e assumindo que se silenciam 
apenas os gene de interesse, há o risco desse silenciamento ter repercussões negativas no 
doente. Por exemplo, ao silenciar o gene responsável pela produção de huntingtina corremos 
o risco de silenciar também a produção do gene natural da huntingtina, o que é perigoso. 
Os efeitos off-target ocorrem quando um siRNA é processado pelo complexo RISC e 
silencia alvos não desejados. Como estas alterações na expressão genética podem levar a 
fenótipos mensuráveis, é importante compreender o mecanismo por trás do off-targeting para 
desenvolver estratégias que minimizem os seus efeitos. Na tabela seguinte apresentam-se 
alguns dos efeitos off-target que surgem com esta técnica, quando aplicada a mamíferos, e as 
ações tomadas no sentido de minimizá-los. 
 
Efeito off-target Tipo Passos para minimizá-lo 
Saturação da maquinaria 
endógena do RNAi 
Independente da sequência 
Usar efetores na mais baixa 
concentração possível 
Usar efetores de controlo 
negativo para comparação 
Resposta imunitária Independente da sequência 
Usar efetores na mais baixa 
concentração possível 
Resposta imunitária Dependente da sequência 
Evitar motifs que se saiba 
estimularem estas respostas 
Usar efetores quimicamente 
modificados 
Usar múltiplos efetores para 
confirmar fenótipos 
Silenciamento de alvos 
indesejados através de 
complementaridade parcial 
Dependente da sequência 
Usar efetores na mais baixa 
concentração possível 
Usar múltiplos efetores para 
confirmar fenótipos 
Tabela 2 - Efeitos off-target e respetivas ações que minimizam os seus efeitos. 
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11 
 
1.3 Estratégias para Entrega de siRNAs em Terapêutica in vivo 
 
Apesar de ser difícil entregar moléculas de siRNA nas células-alvo, in vivo, 
desenvolveram-se variadas estratégias para atingir esse objetivo. Tais estratégias apresentam-
se de seguida. 
 
 
Conjugados de colesterol e siRNA 
•A conjugação entre siRNA e grupos 
lipofílicos aumenta o uptake por 
parte das células e melhora a 
farmocinética e bio distribuição dos 
oligonucleótidos pelos tecidos. 
Estes grupos lipofílicos são 
colocados na extremidade 3' da 
cadeia de sentido 5'  3' e 
aumentam a estabilidade do siRNA. 
•Desvantagem - interferência destes 
conjugados com processos celulares 
normais como o transporte de 
dipéptidos, o que implica uma 
avaliação mais detalhada da 
segurança desta técnica. 
SNALPs (Solid Nucleic Acid Lipid 
Particles) 
•Partículas compostas por lípidos no 
exterior dos quais há moléculas de 
PEG (Polietilenoglicol) 
covalentemente ligadas. No interior 
destas vesículas insere-se o siRNA a 
ser entregue. 
•A acumulação passiva de SNALPs no 
fígado tem sido aproveitada como 
um potencial tratamento de 
hepatite B e infeções pelo vírus da 
Ébola. Quanto a atingir outros 
órgãos deverá ser necessário 
anexar um ligando ou anticorpo 
específico para os mesmos. 
•Desvantagens - aumento da 
resposta imunitária contra o siRNA; 
geração de anticorpos contra 
partículas com moléculas PEG na 
sua superfície, o que gera 
hipersensibilidade em 
administrações repetidas; 
toxicidade destas partículas queacabam por atingir células que não 
são o seu alvo (devido à 
acumulação passiva no fígado). 
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12 
 
 
 
 
Partículas dinâmicas de 
policonjugados 
•São mais pequenas que as SNALPs 
mas possuem um ligante que lhes 
permite entregar o siRNA à célula-
alvo. 
Aptamer–siRNA chimeras 
•Moléculas compostas pelo siRNA e 
pelo aptamer, que é responsável 
pelo mecanismo de 
reconhecimento do alvo e é 
composto por RNA. 
•A designação de quimera deve-se 
ao facto de esta molécula 
apresentar dois tipos diferentes de 
RNA, à semelhança da quimera da 
mitologia grega (parte leão, parte 
cabra, parte cobra). 
•A molécula contém ainda algumas 
modificações que protegem o RNA 
da degradação. 
Anticorpos conjugados 
positivamente carregados 
•Permitem a entrega específica a 
células-alvo. 
•A carga positiva destes anticorpos 
provem da protamina à qual estão 
associados. 
Nanopartículas de ciclodextrina 
•Mascaram o siRNA que, assim, não 
estimula o sistema imunitário, 
mesmo que o siRNA possua 
sequências imuno-estimuladoras. 
Basicamente são constituídas por 
um núcleo de ciclodextrina ao qual 
estão anexados PEG e transferrina. 
•A transferrina confere 
especificidade a estas 
nanopartículas, que se ligam, 
através dessa molécula, aos 
recetores das células-alvo. 
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13 
1.4 RNAi para Estudar a Função dos Genes 
 
Vamos abordar dois tipos de ensaios para o estudo genético através do RNA de 
interferência. 
É possível fazer-se arrays em que reagentes de transfeção contendo shRNAs (small 
hairpin RNAs), que consistem numa sequencia de RNA que se consegue dobrar sobre si 
própria formando um “harpin” que pode depois ser utilizado para o silenciamento dos genes 
selecionados. Esses reagentes podem conter siRNAs, anteriormente descrito, em vez de 
shRNAs. Estes segmentos de RNA são desenhados recorrendo a bibliotecas de RNAi. 
Posteriormente, insere-se em cada um dos poços o material apropriado para se 
executar o RNAi e as células-alvo. Finalmente estuda-se o fenótipo tirando as conclusões de 
interesse. 
 
Outra via comum é através de ensaios realizados em caixas de petri em que se 
inserem as células de interesse que depois são infetadas por vírus contendo cassetes de 
expressão shRNA. Posteriormente há que ter duas amostras do tipo de células selecionadas: 
uma das amostras deve servir como controlo e a outra deve ser a de teste, sendo sujeita às 
condições que se pretendem estudar. Faz-se extração genómica e recupera-se o gene 
pretendido através da técnica PCR. Por fim, procede-se à análise das amostras através de 
hibridização com microarrays e retirando as conclusões de interesse. 
 
 
Figura 2 - Arrayed screens (à esquerda) e pooled screens (à direita). 
 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
14 
1.5 Screening Genético Clássico vs Screening RNAi 
 
O screening genético é uma técnica experimental usada para identificar e selecionar 
indivíduos que, numa população mutada, possuam um fenótipo de interesse. Esta técnica tem 
grande aplicabilidade na medicina pois permite procurar certos genes que possam causar 
danos nos indivíduos. Na tabela seguinte comparam-se as técnicas clássicas com a técnica do 
RNAi para o screening genético. 
 
Screening genético clássico Screening com RNAi 
Alelos gain-of-function podem ser 
isolados, o que permite descobrir 
mecanismos de regulação 
O silenciamento mediado pelo RNAi traduz-se numa 
redução do produto da estirpe selvagem 
Alelos de tecidos específicos 
podem ser recuperados 
Pode obter-se uma visão, do 
ponto de vista de mutações 
pontuais, da relação entre 
estrutura e função 
Todos os genes deveriam ser 
mutáveis através desta técnica 
Nem todos os genes estão suscetíveis ao RNAi: alguns 
tecidos são resistentes e genes que codificam proteínas 
com tempos de semi-vida longos são dificilmente 
silenciados de forma eficiente 
O passo de clonagem é trabalhoso A sequência do gene é imediatamente conhecida 
Genes de efeito materno com 
exigência zigótica são difíceis de 
identificar 
Pode introduzir RNA de cadeia dupla em diferentes 
etapas de desenvolvimento, ignorando os requisitos 
anteriores 
As mutações afetam, 
normalmente, os genes singulares 
O silenciamento é aplicável a genes múltiplos, o que 
permite revelar a redundância 
Alelos mutantes são hereditários 
O silenciamento do gene não é hereditário exceto 
quando é feito através da expressão de transgenes 
Tabela 3 - Comparação entre screening genético clássico e através de RNAi. 
 
Para realizar um screening é necessário seguir os seguintes passos: 
1. Desenvolver um ensaio (ensaio, pilot screen, ensaio refinado); 
2. Efetuar um screen primário com poços simples ou duplos; 
3. Identificar genes para os quais mais de 2 alvos de vírus originam fenótipos similares; 
4. Produzir mais vírus para os alvos positivos; 
5. Validar os alvos através de curvas dose/resposta baseadas no score do fenótipo e na 
expressão da transcrição. 
 
1.6 Biblioteca TRC 
 
A biblioteca TRC (The RNAi Consortium) é um esforço público-privado baseado no 
instituto Broad cujas missões são a criação de uma biblioteca de shRNA e a validação de 
ferramentas e métodos que irão permitir que a comunidade científica use RNAi para 
determinar a função de genes humanos e de ratos. Os reagentes são compostos por pequenas 
sequências hairpin transportadas em vetores lentivírus colocados em arrays. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
15 
 
 Estabilidade da biblioteca - nenhuma recombinação foi observada nas condições 
utilizadas para duplicação e re-crescimento de stocks de bactérias; 
 Infectividade - vetores lentivirais fazem a transdução de uma vasta gama de tipos de 
células, incluindo células que não sofrem divisão; 
 Silenciamento - demonstrou-se que os vetores lentivirais mantêm a expressão 
transgénica estável por semanas ou meses; 
 Cobertura da biblioteca - todos os genes humanos e de rato com uma média de 5 
shRNAs por gene-alvo; 
 Verificação de sequências - as sequências das bibliotecas de clones são verificadas; 
 Eficiência do silenciamento - para 90% dos genes-alvo testados a biblioteca contém 
pelo menos 1 shRNA que providencia mais de 70% de eficácia de silenciamento. 
 
1.7 Regulação da Resposta Imunitária Através do Splicing Alternativo 
 
O genoma humano possui 
muito menos genes codificantes, 
cerca de 20 000 a 25 000, do que se 
julgava inicialmente. Mais de 75% 
dos transcritos primários sofrem 
splicing alternativo. 
O splicing alternativo é um 
processo que permite a produção de 
diferentes proteínas partindo de um 
único gene. A maioria dos genes de 
genomas eucariotas são compostos 
por exões e intrões, sendo os 
segundos removidos do pré-mRNA 
através de splicing. Alguns exões podem também ser removidos do transcrito final. Este 
processo não só confere diversidade às células como lhes permite adaptar e responder a 
mudanças das condições do ambiente em que se inserem. 
 
O splicing alternativo permite ainda regular e afinar respostas imunitárias. De facto, já 
se observaram vários exemplos de splicing alternativo no sistema imunitário, onde diferentes 
isoformas são responsáveis por respostas diferentes. 
 
A interleucina-1β (IL-1β) é uma citocina e um importante mediador na resposta 
inflamatória. A importância do splicing alternativo no seu processo de produção pode ser 
estudada recorrendo ao RNAi. Após um screening baseado em RNAi identificaram-se 19 novos 
reguladores da secreção da IL-1β, 12 dos quais positivos e os restantesnegativos. Identificou-
se ainda que o SFRS3 é um regulador negativo na secreção da IL-1β e que o SFRS3 KD induz um 
aumento do mRNA de IL-1β e de Caspase-1, aumentando igualmente a atividade da Caspase-1. 
 
Figura 3 - Processo de splicing alternativo. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
16 
2 Sinalização Celular 
 
A evolução da unicelularidade para a multicelularidade decorreu de forma lenta, 
possivelmente devido à dificuldade no desenvolvimento de um mecanismo de comunicação 
celular, exigido por um organismo multicelular. 
 
Os mecanismos de 
comunicação entre células estão 
fortemente dependentes de 
moléculas sinalizadoras 
extracelulares, produzidas por células 
com o objetivo de enviar sinais para 
células vizinhas ou células mais 
afastadas. Estes mecanismos 
dependem ainda de um sistema 
elaborado de proteínas que permite à 
célula responder a cada sinal de forma 
específica. Estas proteínas podem ser 
recetores proteicos na superfície da 
célula aos quais a molécula 
sinalizadora se liga, ou podem ser 
proteínas sinalizadoras intracelulares, 
tais como cinases, fosfatases, GTP-
binding, que fazem a distribuição do 
sinal por determinadas zonas da 
célula. No final de cada via sinalizadora existem proteínas-alvo, cuja conformação se altera 
quando essa via se encontra ativa, provocando uma alteração no comportamento da célula. 
Alguns exemplos de proteínas-alvo são proteínas reguladoras de genes, canais iónicos, 
componentes de vias metabólicas, partes do citoesqueleto, entre outras. 
 
Estudos recentes sobre leveduras evidenciam que os organismos unicelulares 
possuíam mecanismos capazes de influenciar células vizinhas, mesmo antes do aparecimento 
de organismos multicelulares. Apesar de levarem, grande parte do tempo, uma vida 
independente, as leveduras podem comunicar e influenciar outras semelhantes na preparação 
do acasalamento. Estudos sobre leveduras mutantes incapazes de acasalar permitiram 
identificar muitas proteínas necessárias ao processo de sinalização. Essas proteínas formam 
uma rede sinalizadora que inclui recetores proteicos da superfície celular, proteínas GTP-
binding e cinases, havendo proteínas similares a cada uma das referidas nas células animais. 
Ainda assim, o processo de sinalização nos animais é bem mais elaborado do que aquele 
existente nas leveduras. 
 
Figura 4 - Exemplo de uma via de sinalização simples, ativada 
por uma molécula extracelular. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
17 
2.1 Formas de Sinalização 
 
As células de animais mais complexos podem comunicar através de variados tipos de 
moléculas sinalizadoras: proteínas, pequenos péptidos, aminoácidos, nucleótidos, esteroides, 
retinoides, ácidos gordos e derivados, e até gases dissolvidos, como o óxido nítrico e o 
monóxido de carbono. A maioria destas moléculas são segregadas pela célula sinalizadora 
para o espaço extracelular por exocitose, embora algumas sejam libertadas por difusão 
através da membrana plasmática. Outras são ainda expostas ao espaço extracelular enquanto 
permanecem ligadas à superfície da molécula sinalizadora. 
Independentemente da natureza do sinal, a célula-alvo responde através de um 
recetor que se liga de forma específica à molécula sinalizadora e inicia a resposta da célula. 
Normalmente a concentração das moléculas sinalizadoras é baixa (10 a 8 M) mas os recetores 
têm alta afinidade para as mesmas (K de cerca de 108 L/mol). Os recetores são normalmente 
proteínas transmembranares na superfície da célula-alvo que, quando ligados ao ligando (a 
molécula sinalizadora), ficam ativados e geram uma cascata de sinalização intracelular que 
conduz à alteração do comportamento celular. Existem também recetores intracelulares, o 
que exige que o ligando entre no interior da célula para os ativar – para tal, o ligando tem de 
ser pequeno e hidrofóbico para ser difundido através da membrana plasmática. 
 
 
Figura 5 - Tipos de recetores. 
 
Existem, essencialmente, quatro formas de sinalização: 
 Sinalização dependente do contacto – as moléculas permanecem ligadas à superfície 
da célula sinalizadora e influenciam somente células que contactem com esta. Este 
tipo de sinalização é importante durante o desenvolvimento e em respostas 
imunitárias. 
 Sinalização parácrina – há segregação de moléculas que agem como mediadores 
locais, afetando apenas células vizinhas à célula sinalizadora. Estas moléculas não se 
podem difundir por maiores distâncias para que a sua ação seja localizada, pelo que 
são muitas vezes recolhidas rapidamente pelas células vizinhas, destruídas por 
enzimas extracelulares ou imobilizadas pela matriz extracelular. 
 Sinalização endócrina – há segregação de moléculas, as hormonas, que são 
transportadas até alvos distantes pela circulação sanguínea. 
 Sinalização sináptica – comum em organismos multicelulares complexos, este tipo de 
sinalização ocorre em células especializadas, os neurónios, que contactam com outras 
células através dos seus longos axónios. Os neurónios são ativados por sinais 
exteriores ou por outras células nervosas e enviam impulsos elétricos (potenciais de 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
18 
ação) rapidamente ao longo dos axónios; ao alcançarem o fim do axónio, esses 
impulsos provocam a segregação de neurotransmissores nas sinapses químicas, que 
são junções celulares especializadas entre o neurónio e a célula-alvo pós-sináptica. 
 
 
Figura 6 - Tipos de sinalização. 
 
 Sinalização endócrina Sinalização sináptica 
Rapidez 
Lenta – as hormonas 
têm de entrar em 
circulação 
Rápida – a transmissão de impulsos dá-se a mais de 
100 m/s e a difusão dos neurotransmissores 
demora menos de 1 ms 
Precisão Baixa 
Alta – os neurotransmissores difundem-se por 
menos de 100 nm até alcançar as células-alvo 
Distância Longas distâncias Longas distâncias 
Concentração 
das moléculas 
Baixa – menor que 
10-8M já que as 
hormonas se diluem 
no sangue e líquido 
intersticial 
Alta – os neurotransmissores não se diluem tanto 
como as hormonas e conseguem atingir elevadas 
concentrações locais 
Afinidade com 
o ligando 
 
Baixa – os neurotransmissores conseguem 
dissociar-se rapidamente do recetor para finalizar a 
resposta 
Término do 
sinal 
 
Rápido – os neurotransmissores são rapidamente 
removidos da fenda sináptica por enzimas 
hidrolíticas que os destroem ou por proteínas de 
transporte membranares que os bombeiam de 
volta ao terminal do nervo ou a células gliais 
vizinhas 
Tabela 4 - Comparação entre a sinalização endócrina e sináptica. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
19 
 
A velocidade de resposta a um sinal extracelular depende não só do mecanismo de 
sinalização como também da natureza da resposta da célula-alvo: 
 
 
Para além das formas de sinalização anteriormente referidas destaca-se ainda a 
sinalização autócrina, em que a célula sinalizadora segrega sinalizadores que se ligam aos seus 
próprios recetores. Este tipo de sinalização pode dar-se, por exemplo, durante o 
desenvolvimento, em que a célula, uma vez direcionada para uma determinada via de 
diferenciação, pode enviar sinais 
autócrinos para reforçar essa 
decisão de desenvolvimento. 
A sinalização autócrina é 
mais efetiva quando é feita por 
células vizinhas do mesmo tipo e 
ocorre para encorajar grupos de 
células idênticas a seguir a mesma 
via de desenvolvimento. Pensa-se, 
portanto, que este tipo de 
sinalização seja um dos mecanismos responsáveis pelo “efeito de comunidade” que se observa 
em fases iniciais de desenvolvimento, alturaem que um grupo de células idênticas é capaz de 
responder a um sinal que induz a diferenciação, ao contrário de uma célula isolada. 
Este mecanismo é utilizado pelas células cancerígenas para superarem o controlo 
normal da proliferação celular e sobrevivência – estas células segregam sinais autócrinos que 
estimulam a sua sobrevivência e proliferação em locais onde células normais do mesmo tipo 
não o fariam. 
 
Outra forma de coordenar as atividades das células 
vizinhas ocorre através das junções celulares, mais conhecidas 
por gap junctions (GJ). As GJ são especializações da membrana 
plasmática das células que têm como função a ligação entre 
células vizinhas através de canais. Esses canais permitem a troca 
de mediadores intracelulares, isto é, pequenas moléculas que participam na sinalização 
intracelular, tais como Ca2+ e AMP cíclico, embora não seja possível trocar macromoléculas 
como proteínas e ácidos nucleicos. Através destas junções as células podem comunicar entre si 
diretamente. 
 
A resposta 
requer 
Alterações em 
proteínas já 
existentes 
Demora milissegundos 
a segundos 
Alterações na 
expressão genética e 
síntese de novas 
proteínas 
Demora horas 
independentemente 
da natureza do sinal 
Figura 7 - Sinalização autócrina. 
Figura 8 - Gap junction. 
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20 
2.2 Alterações que Induzem o Aparecimento de Células Cancerígenas 
 
Normalmente, as células de um organismo multicelular estão expostas a centenas de 
sinais diferentes, que podem ser solúveis, ligar-se à matriz extracelular ou ligar-se à superfície 
da membrana das células vizinhas. Estes sinais podem atuar através de várias combinações, 
pelo que a célula tem de ter capacidade de responder seletivamente aos mesmos, de acordo 
com a especialização que obteve no processo de desenvolvimento. Uma célula pode estar 
programada para, perante uma combinação de sinais, diferenciar-se, e perante outra, 
multiplicar-se, contrair-se, segregar, ou mesmo sobreviver ou morrer. Por exemplo, na 
ausência de sinais que estimulem a sua sobrevivência, a célula pode ativar os mecanismos da 
morte celular programada, ou apoptose. Como células de tipos diferentes requerem 
diferentes combinações de sinais para sobreviver, cada tipo de célula encontra-se restrito a 
um meio ambiente diferente no corpo. 
 
Quando uma célula não responde a 
certos sinais de forma correta e se acumular 
seis alterações fisiológicas vitais – evita a 
apoptose, é autossuficiente na produção de 
sinais de crescimento, é insensível a sinais de 
anti crescimento, é capaz de invadir outros 
tecidos e criar metástases, tem um potencial 
replicativo ilimitado e é capaz de fazer 
angiogénese – então essa célula passa a ter um 
desenvolvimento maligno, podendo dar 
origem a cancro. Quando há uma célula 
maligna no seio de células normais, estas 
podem parar de enviar sinais de sobrevivência 
a essa célula, na tentativa de induzir a 
apoptose da mesma e evitar danos mais 
graves, como proliferação dessa célula. 
 
2.3 Acetilcolina 
 
A forma como uma célula reage ao seu ambiente depende de um conjunto de fatores: 
dos recetores proteicos da célula (que determinam a que conjunto de sinais a célula pode 
responder) e da maquinaria intracelular através da qual a célula integra e interpreta o sinal 
recebido. Assim, é natural que um mesmo sinal provoque diferentes ações em células-alvo 
distintas. Veja-se o exemplo da acetilcolina, que provoca contração nas células do músculo-
esquelético e induz a redução da força e número de contrações nas células musculares do 
coração. Neste caso, a disparidade da resposta é provocada pela ligação da acetilcolina a 
diferentes recetores nos dois tipos de células. 
 
Figura 9 - Alterações fisiológicas que tornam uma célula 
normal numa célula maligna. 
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21 
 
Figura 10 - Respostas induzidas pela acetilcolina em diferentes tipos de células. 
 
2.4 Óxido Nítrico 
 
Outro sinal extracelular importante é o óxido nítrico (NO), que atua tanto em animais 
como em plantas, atravessando diretamente a membrana ou parede celular, por ser pequeno 
e lipossolúvel. Nos mamíferos, este mediador regula a contração muscular. A acetilcolina é 
libertada pelos nervos autónomos nas paredes dos vasos sanguíneos, provocando o 
relaxamento destes e induzindo as células endoteliais a produzir e libertar NO, que também 
provoca relaxação dos vasos. 
Quando libertado pelos nervos autónomos no pénis, o NO estimula a ereção ao induzir 
a dilatação dos vasos sanguíneos. Quando é produzido por macrófagos e neutrófilos, o NO é 
utilizado para matar microrganismos invasores. Já nas plantas, este gás participa em respostas 
defensivas em danos ou infeções. 
O NO é produzido pela desaminação da arginina, catalisada pela NO sintetase, e passa 
rapidamente pela membrana, difundindo-se pelas células vizinhas. Como tem um tempo de 
vida curto, entre 5 a 10 segundos, age apenas localmente antes de ser convertido em nitrato e 
nitrito pelo oxigénio e água. Nas células-alvo, como as células endoteliais, o NO liga-se ao ferro 
no centro ativo da guanil ciclase e estimula esta enzima a converter GMP em GMP cíclico, que 
é um pequeno mediador intracelular, responsável pela relaxação muscular. 
 
 
Figura 11 - Ação do NO na relaxação do músculo de um vaso sanguíneo. 
 
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22 
2.5 Moléculas Sinalizadoras Hidrofóbicas 
 
Existe um conjunto de pequenas moléculas sinalizadoras hidrofóbicas que se 
difundem diretamente através da membrana celular das células-alvo e se ligam aos seus 
recetores proteicos. Deste grupo fazem parte as hormonas esteroides e tiroideias, retinoides e 
vitamina D. Apesar de terem uma estrutura química e uma função bastante diferente entre si, 
todas estas moléculas atuam através de um mecanismo similar: quando se ligam ao recetor 
proteico, ativam-no e este induz a dissociação de proteínas inibidoras; o domínio de ligação ao 
DNA fica livre, e a proteína liga-se então ao DNA para regular a transcrição de genes 
específicos. Os recetores estão todos estruturalmente relacionados, fazendo parte da 
superfamília de recetores nucleares, da qual fazem parte somente cerca de 50 proteínas. Esta 
família inclui ainda alguns recetores proteicos que são ativados por metabolitos intracelulares 
em vez de moléculas sinalizadoras segregadas, e tem grande importância já que regula todas 
as vias metabólicas e regula os vários ciclos biológicos, como o circadiano e o reprodutivo. 
 
2.6 Moléculas Sinalizadoras Hidrofílicas vs Hidrofóbicas 
 
As diferenças entre as moléculas sinalizadoras hidrofílicas e hidrofóbicas encontram-se 
sintetizadas da tabela seguinte. 
 
Moléculas Hidrofílicas Hidrofóbicas 
Solubilidade em 
água 
Solúveis 
Tornam-se temporariamente solúveis 
(ligando-se a proteínas transportadoras) para 
poderem ser transportadas na corrente 
sanguínea ou outros fluidos extracelulares até 
alcançar o alvo 
Tempo de vida 
na corrente 
sanguínea 
Curto porque são 
removidas ou divididas 
poucos minutos após 
entrarem em circulação 
Longo (podendo alcançar horas, como no 
caso das hormonas esteroides, ou dias, como 
no caso das tiroideias) 
Tipo de resposta 
em que são 
utilizadas 
Curta duração Longa duração 
Tabela 5 - Diferenças entre as moléculas sinalizadoras hidrofílicas e hidrofóbicas 
 
2.7 Tipos de Resposta 
 
É possível obter dois tipos de resposta: 
 Resposta primária – ocorre uma ativação direta de alguns genes específicos dentro de 
cerca de 30 minutos; 
 Respostasecundária – as proteínas provenientes da resposta primária ativam, por sua 
vez, outros genes. 
 
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23 
 
Figura 12 - Resposta primária e secundária. 
 
A identificação de respostas primárias ou secundárias pode ser feita através de 
microarrays: hibridiza-se uma amostra com o recetor da hormona em estudo e trata-se outra 
amostra com inibidores de síntese proteica. Na segunda amostra, dado que a resposta 
secundária depende das proteínas provenientes da resposta primária, os inibidores de síntese 
proteica impedem a tradução dos transcritos primários, pelo que não haverá ativação dos 
genes da resposta secundária. Assim, na segunda amostra evidenciam-se os genes ativados 
pela resposta primária. 
 
A resposta produzida a hormonas esteroides, tiroideias, retinoides ou vitamina D 
dependem da natureza da célula-alvo e da natureza da molécula sinalizadora. Muitas células 
possuem o mesmo recetor intracelular mas os genes por ele regulados podem ser diferentes, 
visto que a ativação de um dado gene depende da combinação certa de proteínas reguladoras 
de genes, que podem ser específicas de cada célula. 
 
2.8 Classes de Recetores 
 
Como já referido anteriormente, as moléculas sinalizadoras solúveis em água (como 
neurotransmissores e proteínas sinalizadoras) ligam-se a recetores proteicos específicos 
localizados na superfície da célula-alvo. Estes recetores funcionam como transdutores de 
sinais que convertem um evento extracelular de ligação do ligando em sinais intracelulares que 
alteram o comportamento da célula. Estes recetores pertencem a uma de três classes: 
 Recetores de canais iónicos – estão envolvidos na sinalização sináptica rápida entre 
células eletricamente excitáveis. Esta sinalização é mediada por um pequeno número 
de neurotransmissores que transitoriamente abrem e fecham um canal iónico 
formado pela proteína à qual se ligam, alterando brevemente a permeabilidade iónica 
da membrana plasmática e, portanto, modificando a excitabilidade da célula pós-
sináptica. 
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24 
 Recetores acoplados à proteína G – são compostos por um recetor transmembranar 
(a verde escuro na figura seguinte) e por um complexo trimérico que possui uma 
unidade alfa, beta e gama. Quando o recetor recebe o sinal, há acoplamento do 
recetor e do complexo, seguido de uma mudança de conformação da proteína G, 
então completa, com separação entre o componente alfa e o componente beta-gama. 
 Recetores enzimáticos – quando ativados podem funcionar diretamente como 
enzimas ou podem estar associados a enzimas por eles ativados. São formados por 
proteínas transmembranares que possuem um local de ligação no exterior da célula e 
um local catalítico ou de ligação a uma enzima no interior celular. Apesar de serem 
estruturalmente heterogéneos, a maioria destes recetores são proteínas cinases ou 
estão associados a cinases que, uma vez ligados ao ligando, provocam a fosforilação de 
conjuntos específicos de proteínas na célula alvo. 
 
 
Figura 13 - As 3 classes de recetores da superfície celular. 
 
Sinais recebidos por recetores enzimáticos ou recetores acoplados à proteína G são 
transmitidos para o interior da célula por uma combinação de moléculas sinalizadoras 
intracelulares. O resultado da cadeia de sinalização intracelular é a alteração de proteínas alvo 
que modificam o comportamento da célula. 
Os mediadores intracelulares pequenos ou mensageiros secundários (os primários 
são os extracelulares) são gerados em grande quantidade em resposta à ativação do recetor e 
difundem-se rapidamente, afastando-se da fonte e difundindo o sinal a outras zonas da célula. 
De entre estes mediadores destacam-se o AMP e o Ca2+ (que são solúveis em água e se 
difundem no citosol) e o diacilglicerol (que é solúvel em lípidos e se difunde na membrana 
plasmática). Estes mediadores transmitem o sinal ligando-se e alterando o comportamento de 
proteínas sinalizadoras ou proteínas alvo. 
As moléculas intracelulares grandes são proteínas sinalizadoras intracelulares. Estas 
transmitem o sinal ativando a próxima proteína sinalizadora na cadeia ou gerando mediadores 
intracelulares pequenos. Estas proteínas podem ser classificadas de acordo com a sua função: 
1. Proteínas transmissoras – passam o sinal ao componente seguinte da cadeia; 
2. Proteínas mensageiras – levam o sinal de uma parte da célula para outra (p.e. do 
citosol para o núcleo); 
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25 
3. Proteínas adaptadoras – ligam duas proteínas sinalizadoras sem que estas transmitam 
o sinal; 
4. Proteínas amplificadoras – normalmente enzimas ou canais iónicos, amplificam o sinal 
recebido produzindo uma grande quantidade de mediadores intracelulares pequenos 
ou ativando um grande número de proteínas sinalizadoras intracelulares. Quando há 
muitos passos de amplificação numa cadeia de transmissão tem-se uma cascata de 
sinalização; 
5. Proteínas transdutoras – convertem o sinal; 
6. Proteínas bifurcadoras – espalham o sinal por mais que uma via de sinalização; 
7. Proteínas 
integradoras – 
recebem sinais de 
duas ou mais vias de 
sinalização e integram-
nos antes de 
transmitirem outro 
sinal avante; 
8. Proteínas reguladoras 
de genes latentes – 
ativam-se na superfície 
celular por recetores 
ativados e migram 
para o núcleo para 
estimular a transcrição 
genética. 
 
Existem ainda 
proteínas moduladoras que 
modificam a atividade de uma 
proteína sinalizadora e, 
portanto, regulam a força da 
sinalização ao longo da via; 
proteínas ancoradouras que 
mantêm uma proteína 
sinalizadora num local 
específico da célula; e 
proteínas esqueleto (scaffold) 
que são proteínas adaptadoras 
que ligam várias proteínas 
sinalizadoras umas às outras 
num complexo funcional e mantêm esse complexo numa zona específica da célula. 
 
Figura 14 - Classificação de proteínas sinalizadoras intracelulares. 
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26 
2.9 Interruptores Moleculares 
 
Muitas das proteínas sinalizadoras intracelulares comportam-se como interruptores 
moleculares: a receção de um sinal faz passar o estado de inativo para ativo até que outro 
sinal reverta esse estado. É importante que a proteína regresse ao estado inativo para que seja 
capaz de responder a novo estímulo de ativação. 
Existem principalmente duas classes de interruptores moleculares que operam de 
forma diferente embora o ganho ou perda de um grupo fosfato determine, em ambas, se a 
proteína está ativa ou inativa. Uma delas é composta por proteínas cuja ativação ou inativação 
resulta de fosforilação. Neste caso o interruptor fica ligado devido uma cinase que adiciona 
um ou mais grupos fosfato à proteína sinalizadora, ou fica desligado se uma fosfatase remove 
esses grupos fosfato. Muitas vezes a proteína fosforilada é ela própria uma cinase e pode 
pertencer a uma cascata de fosforilação, em que uma cinase, ativada por forforilação, fosforila 
a próxima cinase e por aí adiante, propagando, amplificando e por vezes transmitindo o sinal 
para outras vias. 
A outra classe de interruptores moleculares são as proteínas GTPbinding. Neste caso, 
um interruptor está ligado quando uma molécula de GTP se associa a este, e desligado quando 
a associação ocorre com GDP. Uma vez ativados, os interruptores têm uma atividade 
intrínseca de GTPase e desligam-se a si próprios, através da hidrólise de GTP em GDP. 
 
Comportamentos celulares 
complexos, como a sobrevivência e a 
proliferação celulares, são normalmenteestimulados por uma combinação específica 
de sinais extracelulares. Assim, a célula tem 
de integrar a informação proveniente de 
sinais diferentes para que possa produzir a 
resposta correta. Essa integração depende 
de proteínas integradoras, cujo 
funcionamento se ilustra na figura à direita. 
 
Na situação A, a proteína que propaga o sinal só o faz quando recebe informação dos 
dois recetores, em simultâneo. Por exemplo, a proteína pode ficar ativada apenas quando é 
fosforilada em dois locais diferentes, por duas enzimas diferentes. Na situação B há duas 
proteínas diferentes, cada uma ativada pela sua enzima, e só há propagação do sinal quando 
ambas se juntam. 
 
2.10 Complexos Sinalizadores Intracelulares 
 
Um único sinal que estimule um recetor enzimático ou um recetor acoplado à proteína 
G pode ativar múltiplas vias de sinalização paralelas e, portanto, influenciar vários aspetos do 
comportamento celular. De facto, estas classes de recetores ativam, por vezes, a mesma via 
sinalizadora, não havendo nenhuma razão óbvia para a ativação de um recetor ao invés do 
outro. 
Figura 15 – Integração de um sinal externo. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
27 
Uma das estratégias utilizadas pela célula para responder de forma específica aos 
vários sinais externos envolve proteínas scaffold, que organizam grupos de proteínas 
sinalizadoras em complexos de sinalização. Estas proteínas scaffold guiam a interação entre 
componentes sucessivos de um complexo, permitindo que o sinal seja transmitido de forma 
precisa, rápida e eficiente. Deste modo evitam-se ainda interferências entre vias sinalizadoras. 
Para que se dê a amplificação e difusão do sinal por outras partes da célula, alguns 
componentes da via sinalizadora encontram-se livres pela célula. 
Noutros casos há 
formação transitória de 
complexos sinalizadores, como 
no caso em que as proteínas 
sinalizadoras se reúnem em 
torno de um recetor ativado por 
sinais externos. Esse recetor 
pode ter uma cauda 
citoplasmática fosforilada 
durante a fase ativa, e os 
aminoácidos fosforilados dessa 
cauda funcionam como locais de 
ligação para as proteínas 
sinalizadoras. Estes complexos 
permitem uma resposta mais 
variada porque aos locais de 
ligação podem ligar-se diversas 
proteínas. 
Existem ainda outros 
casos em que a ativação do 
recetor conduz à produção de 
fosfolípidos modificados na 
membrana plasmática adjacente. 
Estes lípidos recrutam proteínas 
sinalizadoras intracelulares específicas para esse local. Estes complexos formam-se apenas 
transitoriamente e dissociam-se rapidamente quando o ligando se dissocia do recetor. 
 
2.11 Domínios de Ligação 
 
A formação de complexos sinalizadores estáveis ou transientes depende de uma 
variedade de pequenos domínios de ligação altamente conservados que se encontram em 
muitas proteínas sinalizadoras intracelulares. Cada um dos módulos compactos proteicos liga-
se a um motif estrutural específico na proteína (ou lípido) com a qual a proteína sinalizadora 
interage. Devido a estes domínios modulares as proteínas ligam-se umas às outras em variadas 
combinações formando, por vezes, uma rede de interações tridimensional que determina o 
percurso seguido pela via de sinalização. Juntando domínios já existentes em novas 
combinações facilitou-se a rápida evolução de novas vias de sinalização. 
Figura 16 - Dois tipos de complexos intracelulares sinalizadores. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
28 
Aos domínios SH2 (Src Homology 2) e PTB (PhosphoTyrosine-Binding) ligam-se 
tirosinas fosforiladas de uma certa sequência de péptidos de um recetor ativado ou de uma 
proteína sinalizadora intracelular. Já aos domínios SH3 (Src Homology 3) e PH (Pleckstrin 
Homology) ligam-se, respetivamente, pequenas sequências de aminoácidos ricas em prolina e 
grupos carregados de fosfolípidos de inositol fosforilados (produzidos pela membrana 
plasmática em resposta a um sinal extracelular). Este último domínio permite que a proteína 
do qual faz parte se ligue à membrana e interaja com outras proteínas recrutadas. Algumas 
proteínas sinalizadoras funcionam somente como adaptadores para ligar outras duas proteínas 
entre si numa via sinalizadora, sendo constituídas por apenas mais dois domínios de ligação. 
Estes domínios são de grande importância, por exemplo, na polarização de uma célula. 
 
 
Figura 17 - Via sinalizadora hipotética que utiliza domínios modulares de ligação. 
 
2.12 Mecanismo para o Aumento da 
Brusquidão de Resposta 
 
Algumas respostas a sinais extracelulares 
intensificam-se levemente em relação à proporção 
da concentração do sinal. É o caso da resposta 
primária a hormonas esteroides, já que a proteína 
recetora destas hormonas, localizada no núcleo, liga-
se a uma única molécula de hormona. Com o 
aumento da concentração da hormona aumenta 
proporcionalmente a concentração do complexo 
recetor-hormona ativado, tal como aumenta o 
número de complexos ligados a uma sequência 
reconhecida do gene-alvo, pelo que a resposta da 
Figura 18 - Mecanismo de sinalização cuja 
resposta se espera ser do tipo “em degrau”. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
29 
célula é, assim, gradual e linear. Outras respostas começam mais abruptamente à medida que 
a concentração das moléculas aumenta. Algumas respostas ocorrem no forma semelhante ao 
tudo ou nada, sendo indetetáveis abaixo de um certo nível de concentração da molécula e 
atingindo um máximo assim que a concentração é excedida. 
Um mecanismo para tornar a resposta mais abrupta baseia-se no facto de ser 
necessário mais do que uma molécula efetora intracelular ou complexo ligados a uma 
macromolécula-alvo para induzir a resposta. Por exemplo, no caso de respostas induzidas por 
hormonas esteroides, parece ser necessário a ligação simultânea de mais do que um complexo 
hormona-recetor ao respetivo gene para ativá-lo. Deste modo, com o aumento da 
concentração da hormona, a ativação do gene começa mais abruptamente do que começaria 
caso fosse ativado quando a ele se ligasse um único complexo. Algo similar acontece em 
cascatas de sinalização ativadas por recetores na superfície celular. Por exemplo, a cinase 
dependente de AMP cíclico só é ativada quando a ela se ligam quatro AMP cíclicos. Esta 
resposta fica mais abrupta à medida que aumenta a concentração de AMP cíclico, de tal forma 
que se a concentração for elevada a resposta aproxima-se de uma resposta de tudo ou nada. 
Este mecanismo é do género cooperativo. 
Uma resposta torna-se 
igualmente mais abrupta se 
uma molécula sinalizadora 
ativar uma dada enzima e 
inibir a enzima que catalisa a 
reação oposta, como acontece 
com a adrenalina nas células do 
músculo-esquelético. A 
adrenalina liga-se a um recetor 
acoplado à proteína G e isso 
induz o aumento da 
concentração de AMP cíclico, 
que ativa a enzima que 
promove a degradação de 
glicogénio e inibe a enzima que 
promove a síntese do mesmo. 
 
Estes mecanismos 
respondem, de forma geral, 
gradualmente com o aumento 
da concentração do sinal 
extracelular. Contudo, no 
mecanismo do tudo-ou-nada há um limiar acima do qual passa a haver resposta por parte da 
célula (abaixo deste não se regista qualquer resposta). Respostas deste tipo dependem 
normalmente de feedback positivo. Este mecanismo é utilizado pelos nervos e músculos para 
gerar potenciais de ação em resposta a neurotransmissores. 
Um mecanismo de feedback positivo acelerado também pode operar através de 
proteínas sinalizadoras que sejam enzimas e não canais iónicos. Nestemecanismo, o ligando 
Figura 19 - Curvas de ativação como função da concentração da 
molécula sinalizadora. As curvas tornam-se mais abruptas à medida que 
se aumenta o número de moléculas efetoras necessárias para ativar a 
molécula alvo. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
30 
sinalizador intracelular ativa uma enzima da via de sinalização e duas ou três moléculas 
produzidas pela reação enzimática ligam-se também à enzima para a ativar mais adiante. 
Como consequência tem-se um nível de produção do produto bastante baixo na ausência do 
ligando que aumenta devagar com a concentração do mesmo. Ao atingir um certo limiar de 
ligando, há produção de produto suficiente para ativar a enzima num processo de auto 
aceleração. A concentração do produto aumenta de repente, o que faz com que este 
mecanismo permita à célula traduzir uma variação gradual de concentração do ligando numa 
variação do tipo interrutor, criando-se assim uma resposta de tudo-ou-nada. 
 
2.13 Finalização da Resposta 
 
Por vezes, o término de um sinal ou a sua atenuação são mais importantes do que o 
seu início, dado que estes têm de ocorrer para que um novo sinal possa ser originado. Além 
disso, um sinal demasiado prolongado ou intenso pode ser deletério para o ser vivo. Por 
exemplo, quando se desencadeia uma reação de defesa contra um microrganismo, uma vez 
que este seja eliminado é importante terminar a resposta de defesa ou corre-se o risco de 
originar uma doença autoimune ou mesmo cancro. Alguns mecanismos para terminar um sinal 
(desensitization to a signal) são os que se seguem: 
 
 
 
Uma das vantagens da primeira estratégia é a possibilidade da célula dar uma resposta 
rápida a um novo estímulo. Esta estratégia é adotada no metabolismo da glucose, pois se não 
fosse levar-se-ia muito tempo na produção dos recetores. 
 
Indução da 
sua própria 
endocitose e 
sequestração 
temporária 
em 
endossomas. 
Indução da 
sua própria 
endocitose e 
destruição em 
lisossomas 
(receptor 
down-
regulation). 
Inativação por 
fosforilação, 
atrasada em 
relação à sua 
ativação. 
Alteração de 
uma proteína 
envolvida na 
transdução 
do sinal. 
Produção de 
um inibidor 
que bloqueia 
o processo de 
transdução. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
31 
2.14 Recetores Acoplados à Proteína G 
 
Uma das maiores famílias de recetores proteicos 
é a dos recetores acoplados à proteína G e está 
envolvida na visão, olfato e paladar. Estes recetores 
participam em respostas a moléculas como hormonas, 
neurotransmissores e mediadores locais. Quase metade 
das drogas conhecidas atuam nos recetores de proteína 
G. Em geral, estes recetores são constituídos por uma 
cadeia polipeptídica que atravessa a membrana celular 7 
vezes (o que lhes confere o nome de recetores 
serpentina) com um domínio extracelular ao qual o ligando se liga. Quando isto ocorre há uma 
alteração na conformação do recetor que permite a ativação das proteínas G (trimeric GTP-
binding proteins). Estas proteínas encontram-se ancoradas na face citoplasmática da 
membrana celular e permitem o acoplamento entre o recetor e enzimas ou canais iónicos da 
membrana. 
As proteínas G são constituídas por 3 subunidades, a α (uma GTPase), β e γ. No estado 
não estimulado a subunidade α está ligada a GDP, pelo que a proteína G está desativada. 
Quando estimulada pelo recetor ativado, esta subunidade liberta a molécula de GDP e, no 
lugar desta, liga-se GTP. Este evento leva à ativação da subunidade α e do complexo βγ: a 
primeira sofre uma alteração de conformação, enquanto o complexo fica livre para interagir 
com proteínas alvo. 
Quando a subunidade α hidrolisa a sua ligação ao GTP, tornando este último em GDP, 
torna a reassociar-se ao complexo βγ, inativando a proteína G. 
 
O AMP cíclico (AMPc) é um dos segundos mensageiros mais comuns que se forma na 
ativação dos recetores acoplados à proteína G. A sua concentração normal intracelular ronda 
os 10-7 M, podendo ascender a mais de 20 vezes este valor perante um sinal extracelular. Esta 
molécula é sintetizada a partir de ATP pela enzima adenilato ciclase, que remove dois 
fosfatos do grupo pirofosfato do ATP, e é rápida e continuamente destruída pela 
fosfodiesterase, que a hidrolisa, transformando-a em 5-AMP. Muitos sinais extracelulares 
atuam através do aumento dos níveis de AMPc, preferencialmente aumentando a atividade da 
adenilato ciclase. A cafeína é um contraexemplo pois inibe a fosfodiesterase, o que provoca o 
aumento dos níveis de AMPc que, entre outras funções, ativa os neurónios. 
 
Embora o AMPc possa ativar diretamente certos tipos de canais iónicos na membrana 
plasmática de algumas células especializadas, esta molécula atua através da ativação da 
proteína cinase dependente de AMPc (PKA). Esta enzima catalisa a transferência do grupo 
fosfato terminal do ATP para serinas ou treoninas específicas de proteínas alvo, regulando, 
assim, a atividade destas proteínas. No estado inativo, a PKA é composta por um complexo de 
duas subunidades catalíticas e duas subunidades reguladoras. Quando o AMPc se liga às 
subunidades reguladoras, promove a alteração de conformação e causa a dissociação do 
complexo. 
 
Figura 20 - Recetor acoplado à proteína G. 
Apontamentos de Engenharia Biomolecular e Celular 2013 
 
32 
Na imagem à direita apresenta-se uma 
via sinalizadora que começa com a ligação da 
molécula sinalizadora extracelular ao recetor 
acoplado à proteína G, ativando a adenilato 
ciclase e aumentando a concentração de 
AMPc. Este aumento de AMPc ativa as PKA 
que se encontram no citosol. As subunidades 
catalisadoras libertadas dirigem-se para o 
núcleo, onde fosforilam CREB (cAMP 
Response Element-Binding protein). Esta 
proteína, uma vez fosforilada, recruta o 
coativador CBP (CREB-Binding Protein), que 
estimula a transcrição de genes alvo. Esta via 
sinalizadora controla, por exemplo, a síntese 
de hormonas em células endócrinas e a 
produção de proteínas necessárias para a 
memória de longo-prazo no cérebro. 
 
Muitos recetores acoplados à proteína 
G exercem o seu efeito através das proteínas 
G que ativam a fosfolipase C-β. Esta enzima 
atua no fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, um 
fosfolípido presente na camada interior da 
membrana plasmática, clivando-o e dando 
origem a dois produtos, o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e o diacilglicerol. 
O IP3 é uma molécula pequena e solúvel em água que deixa a membrana plasmática e 
se difunde no citosol. Ao atingir o retículo endoplasmático, o IP3 induz a abertura de canais 
específicos que deixam passar o Ca2+ que estava armazenado no retículo, aumentando, assim, 
a concentração deste ião no citosol. 
O diacilglicerol permanece ancorado na membrana onde desempenha dois papeis 
importantes. Primeiro pode ser clivado para libertar ácido araquidónico, que tanto pode ser 
ele próprio um mensageiro como participar na síntese de pequenos lípidos mensageiros, os 
chamados eicosanóides (como por exemplo as prostaglandinas). O outro papel é a ativação da 
proteína cinase C (PKC), dependente de Ca2+. A subida drástica dos níveis de Ca2+, provocada 
pelo IP3, altera a PKC, que se desloca para a face citoplasmática da membrana plasmática e 
sofre aí a sua ativação pela combinação de Ca2+, diacilglicerol e fosfatidilserina (presente na 
membrana fosfolipídica). Quando ativada, a PKC fosforila proteínas alvo que variam consoante 
o tipo de célula. 
 
Existem diversos mecanismos pelos quais as células fazem a manutenção dos baixos 
níveis de Ca2+ no citosol. Esses mecanismos estão ilustrados no esquema abaixo. 
 
Figura