isolamento de genes clonados

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Isolamento de genes clonados
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Por que clonar?
Pesquisa básica
Diagnóstico
Produção de vacinas
Produção de substâncias biologicamente ativas
Alteração das características animais e vegetais destinados à produção ou pesquisa
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Descobertas e desenvolvimentos importantes para a clonagem molecular
Sistemas de restrição-modificação.
Vetores de clonagem.
Enzimas que moficam o DNA: ligases, polimerases, polinucleotídeo quinase.
Métodos de transformação de células procarióticas e eucarióticas.
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Biblioteca de genes
Coleção randômica de fragmentos de DNA, ligados a moléculas de um vetor, que abrangem, em seu conjunto, toda a informação genética de uma espécie. 
Podem ser de dois tipos: 
Genômica - o DNA do organismo é fragmentado e ligado diretamente ao vetor.
 cDNA - o mRNA purificado do organismo é utilizado como molde para a síntese de um DNA de dupla fita, denominado DNA complementar ou cDNA, o qual é ligado ao vetor.
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Exemplo 01- Plasmídeos
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Exemplo 02- Bacteriófagos
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Exemplo 03- Cosmídeos
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Exemplo 4- YACs
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Biblioteca genômica
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Biblioteca de cDNA/ expressão
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Bibliotecas de subtração
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Clonagem por PCR
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Clonagem do gene da urato oxidase usando PCR e primers degenerados
Exemplo de clonagem por PCR
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Como encontrar um gene clonado?
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Seleção dos clones de interesse (“screening”)
Seleção de clones contendo o gene de interesse:
Utilização de anticorpos (SELEÇÃO BASEADA NA EXPRESSÃO DO PRODUTO PROTÉICO)
As colônias bacterianas são replicadas, transferidas para membranas de nitrocelulose, lisadas e os filtros são incubados com soros para a detecção das colônias produtoras da proteína de interesse. 
Utilização de sondas de DNA (SELEÇÃO BASEADA NA SEQÜÊNCIA DO FRAGMENTO CLONADO)
As colônias bacterianas são replicadas, transferidas para membranas de nitrocelulose, lisadas e os filtros são incubados com sondas de DNA marcadas com radioisótopos ou com substâncias quimioluminescentes.
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Exemplo 01- Rastreamento imunológico
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Exemplo 02- Rastreamento radioativo
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Exemplo 03- Eletroforese e Blotting na identificação de genes específicos
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Exemplo 03- Complementação Funcional
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Southern X Northern X Western blot
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Caracterização do gene
Determinação do número de cópias 
Determinação do arranjo genômico
Seqüenciamento do gene
Caracterização dos transcritos
Caracterização do produto protéico
Determinação da função
Regulação da expressão gênica
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Vetor de expressão
Produção de proteínas recombinantes
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pET - polylinker
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Controle da expressão - Operon lac
isopropil tiogalactosídio (IPTG) 
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 O IPTG é um indutor da transcrição genética que aumenta a quantidade da enzima T7 RNA polimerase, a qual se liga ao promotor T7, iniciando a transcrição do cDNA de interesse.
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Microarray
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Microarray
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Microarranjos de DNA
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Proteoma