Biotecnologia Vegetal

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* Contato: LaurienyEloina de Castro, Curso de Bioquímica, Universidade Federal de São João Del-Rei 
(UFSJ), CEP:35.501-296 ,Divinópolis, MG, Brasil, e-mail: laurieny.castro@hotmail.com 
 
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Estabelecimento de culturas in vitro 
 
Gabriella Conquista Rodrigues¹, Juliana Maria Campos Palumbo¹,LaurienyEloina deCastro¹ *, 
Pauliane Sidney OliveiraLobato¹ 
¹Curso de Bioquímica , Universidade Federal de São João Del-Rei (UFSJ),Campus Centro Oeste Dona Lindu Rua 
Sebastiao Goncalves Coelho 400, Chanadour, 35.501-296, Divinópolis, MG, Brasil 
 
RESUMO 
A hipótese da totipotênciaformulada por Schleiden&Schivann em 1838 (VASIL et AL., 1979), afirma 
que todas as células de planta possuem a capacidade de gerar um novo indivíduo. Partindo desta 
premissa torna-se viável o estabelecimento de culturas de tecido vegetais a partir de células isoladas 
não diferenciadas, ou a partir de órgãos e tecidos vegetais como semente e folhas de plantas, sob 
condições controlas (temperatura, fotoperíodo e umidade) e assépticas. Para realização dos cultivos 
in vitro se faz necessário o uso de meios de cultivo que devem suprir todas as necessidades 
nutricionais de tecidos e órgãos(Torres, 1998). As dosagens ou formulações de meio de cultivo 
variam de acordo com as condições das espécies em cultivo para cada fase de desenvolvimento in 
vitro.Pode-se ainda fazer uso dos reguladores de crescimento que são substâncias sintéticas as 
quais, quando aplicados nas plantas, produzem efeitos similares aos dos hormônios, e são fatores 
importantes no padrão de desenvolvimento e no crescimento, na maioria dos sistemas de culturas de 
tecidos. Dentre os reguladores de crescimento os mais utilizados são as auxinas, citocininas e 
giberelinas. 
PALAVRAS CHAVE: Cultura de tecidos vegetais, Reguladores de crescimento, Auxinas, Citocininas, 
Giberelinas.
INTRODUÇÃO 
A possibilidade de manipulação de células, tecidos e orgãosin vitro está fundamentada na capacidade 
de as células vegetais, mesmo separadas da planta-mãe, continuarem a crescer quando cultivadas 
em condições apropriadas. A técnica da cultura de tecido vegetal parte da premissa de que todas as 
células da planta apresentam capacidade de gerar um indivíduo, conhecida como hipótese da 
totipotencialidade das plantas, formulada por Schleiden&Schivann em 1838 (VASIL et AL., 1979). 
Nesse contexto, o artigo foi elaborado com intuito de realizar o estabelecimento de cultura in vitroa 
partir de sementes de cebola cuja espécie é Allium cepa (Figura 1). 
Alliumcepa L. (cebola) é uma espécie da família Alliaceae que possui 31 gêneros. Estes gêneros 
herbáceos são amplamente distribuídos no mundo. Acebola é uma planta bianual, que completa o 
seu ciclo vegetativo em dois anos. No primeiro ano desenvolve a parte vegetativa e no segundo, 
floresce e frutifica. É uma fonte alimentícia importante da dieta da população brasileira, uma das 
 
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hortaliças mais usadas e um condimento muito requisitado. Além disso, é rica em flavonóides, 
elemento com propriedades anti-inflamatória e anti-oxidante. 
 
Fig. 1 Imagem ilustrativa de Alliumcepa L 
A cultura de tecidos vegetais compreende a regeneração de plantas a partir de células isoladas não 
diferenciadas, ou a partir de órgãos e tecidos vegetais, em ambiente artificial, sob condições controlas 
(temperatura, fotoperíodo e umidade) e assépticas. Tais células, quando colocas em um meio de 
cultura apropriado podem dividir-se indefinidamente ou diferenciar-se, o que irá propiciar a 
regeneração de parte da planta ou a planta inteira sendo, desta forma, produzidos milhares de 
indivíduos clonais a partir de uma ou algumas células (RAMALHO et al., 2000). 
Para o cultivo in vitro da semente de cebola, há a necessidade da utilização de meios de cultivo. 
Desse modo o meio de cultura deve suprir tecidos e órgãos cultivados in vitro com nutrientes visando 
atender as necessidades do explante no seu crescimento. As dosagens ou formulações de meio de 
cultivo variam de acordo com as condições das espécies em cultivo para cada fase de 
desenvolvimento in vitro. 
Basicamente, os meios de cultivo consistem de uma mistura balanceada de macronutrientes e 
micronutrientes, fontes orgânicas de nitrogênio, carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento. 
Os meios de cultivo ser utilizados na forma sólida (adicionando-se ágar ou outro agente para 
geleificação) ou líquida, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos 
utilizados para as culturas fornecem as substâncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e 
controlam, em grande parte, o padrão do desenvolvimento in vitro (Torres, 1998). A constituição do 
meio é baseada nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas 
modificações para atender em necessidades específicas. Um dos primeiros meios de cultura 
desenvolvidos foi o de White, 1942. Esse meio apresenta baixo nível de nitrogênio e de potássio, 
 
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restringindo o seu uso para muitas células; entretanto, esta formulação com baixa concentração em 
sais, é usada em muitas situações. O meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi uma das primeiras 
formulações melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos níveis de 
nitrato, potássio e amônio. 
Os reguladores de crescimento são substâncias sintéticas as quais, quando aplicados nas plantas, 
produzem efeitos similares aos dos hormônios, e são fatores importantes no padrão de 
desenvolvimento e no crescimento, na maioria dos sistemas de culturas de tecidos. Dentre os 
reguladores de crescimento os mais utilizados são as auxinas, citocininas e giberelinas. 
As auxinas são sintetizadas nas plantas nas regiões de crescimento ativo, como exemplo, os 
meristemas apicais, as gemas axilares, as folhas jovens. De uma maneira geral, na maioria dos 
tecidos jovens das plantas, as auxinas são produzidas e posteriormente translocadas a outros 
diferentes órgãos onde atuaram no mecanismo interno do que controla o crescimento (Tagliacozzo, 
1998). As auxinas promovem o crescimento do caule, das folhas e das raízes em culturas in vitro, 
além disso, possui outras ações como aumento da friabilidade de calos, alongamento de entrenós e 
indução de embriogênese. As auxinas mais utilizadas nos meios de culturas para estimular a 
multiplicação de células são: ANA (ácido a-naftaleno acético), AIB (ácido indol-3-butírico), AIA (ácido 
3-indolilacético) e 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético). As concentrações de auxinas são abaixo de 
0,5mg/l, exceto a auxina AIA, pois ela se mantém menos estável no meio de cultura,podendo ser 
adicionada a concentrações maiores. Já a ação de 2,4-D é de mimetização dos hormônios vegetais 
como as auxinas. 
As citocininas são reguladores de crescimento e promotoras de divisão celular. Elas promovem a 
divisão celular, o alongamento das células e sua diferenciação, retarda a senescência, e também 
promove a quebra da dominância apical e pode induzir a produção de gemas axilares. Além disso, a 
citocininaé uma substância fundamental para a multiplicação da parte aérea e de indução de gemas 
adventícias. (Tagliacozzo, 1998). O BAP (6-benzilaminopurina) também é um grupo de reguladores 
de crescimento e é adicionado ao meio de cultura para melhorar a micropropagação com aumento do 
número de gemas, brotos e folhas e para levar a um acréscimo na produção de massa fresca e 
qualidade das plantas cultivadas. 
As giberelinas são substâncias que podem ter seus efeitos análogos ao das auxinas. Uma das 
diferenças é que as giberelinas têm a sua ação quando aplicadas em uma planta intacta. Já as 
auxinas possuem maior efeito em segmentos de plantas segundo Tagliacozzo(1998). Dentre os 
diversos tipos de giberelinas, o ácido giberélico (GA3)é o mais utilizado para estimulação do 
crescimento de órgãos, desenvolvimento de embriões somáticos e florescimento. E ainda, algumas 
vezes, é usado em cultura de meristemas, na recuperação de plantas livres de vírus. 
O cultivo de sementes in vitro deve ser controlado sob condições de assepsia, nutrição e fatores 
ambientais. Para a realização do cultivo in vitro há necessidade de promover a desinfestação dos 
explantes para posterior manutenção da cultura sem a presença de contaminações. A efetividade da 
desinfestação do explante é dependente do tipo e idade do material utilizado, do tipo e concentração 
 
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do desinfetante, sendo estes os mais comuns, a utilização de etanol 70% seguido de hipoclorito de 
sódio/ cálcio e do tempo de exposição do explante ao agente (SMITH 2000). Além dos cuidadoscom 
o explante, é preciso estar atento ás condições de limpeza de todas as vidrarias, esterilidades dos 
meios de cultivo e instrumentos de manipulação utilizados. 
MATERIAL E MÉTODOS 
1. Preparo de meio de cultura 
Primeiramente, foi preparado o meio de cultura que fornece as substâncias essenciais para o 
desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão do desenvolvimento in vitro. Foi 
necessário calcular o volume de solução para preparar o volume desejado (cada tubo de ensaio 
deveria conter 15 mL de meio de cultivo). Após posicionar todas as soluções estoque e sua 
respectiva pipeta na bancada, pesou-se a quantidade de Agar e sacarose devidamente calculadas. A 
quantidade de sacarose foi 2g/100 mL. Em seguida, adicionou-se um pouco de água destilada em um 
béquer apropriado para o volume final de solução a ser preparada posteriormente. Pipetaram-se as 
soluções em seguida, utilizando-se pipetas diferentes para evitar contaminação durante o 
procedimento. Feito isso, foi adicionado os reguladores do crescimentovegetal de acordo com a 
tabela 1: 
Tabela 1 - Grupos e seus respectivos reguladores de crescimento adicionados no meio de cultura: 
GRUPO REGULADOR DE CRESCIMENTO 
1 2,4D 
2 BAP 
3 GA3 
4 2,4D + BAP 
 
Após cada regulador de crescimento ser adicionado por seu respectivo grupo, adicionou-se sacarose 
e completou-se o volume com água até a metade do volume final. Foram usados 0,5 mL de 2,4D, 
0,25 mL de BAPe.....mL de GA3 ambos para preparar 100 mL de solução. Após verificar e ajustar o 
pH para 5.8, aqueceu-se, em microondas, metade do volume total de água junto com o Agar, até 
entrar em ebulição. Finalmente, a solução preparada com o Agar foi misturada e este meio de cultivo, 
ainda quente, foi dividido em tubos de ensaio. Os tubos de ensaio contendo o meio de cultivo foram 
fechados corretamente e autoclavados a 120°C por 20 min. 
2. Estabelecimento de cultura in vitro a partir de sementes 
A fim de estabelecer a cultura in vitro a partir de sementesde Alliumcepa L. e de folhas retiradas de 
árvores do campus Dona Lindu da Universidade Federal de São João Del Rei, foi realizada a 
assepsia das mãos e a limpeza da bancada com álcool 70%. Foi necessário acender a lamparina e 
trabalhar sempre próximo ao seu raio. Após flambar as pinças e bisturis, as sementes e as folhas 
foram colocadas no béquer juntamente com álcool 70% num tempo de 30 segundos. Ao retirar o 
 
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álcool, adicionou-se hipoclorito de sódio 1%, e agitou-se o béquer manualmente por um tempo. Cada 
grupo agitou o béquer contendo hipoclorito de sódio por 20, 15, 10 e 5 minutos respectivamente. 
Posteriormente, as sementes e as folhas foram lavadas três vezes em água destilada e autoclavadas. 
Feito isso, as sementes e folhas foram inoculadas nos tubos de ensaio contendo meio de cultivo. 
Para inocular, foi necessário flambar as pinças e resfriar, além de flambar também a extremidade do 
tubo de ensaio antes e depois de as sementes e folhas serem inoculadas nos tubos de ensaio. O 
material foi mantido em sala de crescimento, a 25º C durante o fotoperíodo de 16 horas. E, por fim, 
após 15 dias foi possível observar a porcentagem e o tipo de contaminação, e a porcentagem de 
germinação. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Inicialmente, foi possível observar que oexperimento realizado a partir de folhas recolhidas no 
campus Dona Lindu da Universidade Federal de São João Del Rei e inoculadas no meio de cultura foi 
completamente contaminado, dessa forma não foi possível avaliar os resultados. A contaminação 
pode ter sido provocada por falhas no manuseio durante a realização do experimento assim como a 
assepsia dos materiais e do ambiente pode não ter sido feita corretamente. Segundo, Pasqual (2001), 
a cultura de tecidos vegetais precisa ser realizada com rigorosa assepsia devido ao fato de que uma 
parte dos microrganismos, ao entrar em contato com o meio de cultura, encontrará as condições 
necessárias para se desenvolver, inviabilizando assim a cultura. O alto grau de contaminação e a 
localização sistêmica de microrganismos foram responsáveis, nesse caso, pelo insucesso da 
implantação de culturas in vitro e, por isso, os resultados estabelecidos não se apresentaram aptos 
para serem avaliados. 
No primeiro experimento, foi realizada a desinfestação das folhas. O processo de desinfestação foi 
feito em tempos diferentes de exposição das folhas ao hipoclorito de sódio 1% para cada grupo. O 
hipoclorito de sódio apresenta propriedades germicidas e é amplamente utilizado na desinfestação e 
esterilização de explantes no cultivo in vitro de tecidos vegetais principalmente. O grupo 1 realizou 
este experimento com 20 minutos de exposição das folhas ao hipoclorito de sódio; o grupo 2 fez com 
o tempo de exposição de 15 minutos; o grupo 3 com 10 minutos e, por último, o grupo 4 fez uma 
exposição das folhas ao desinfetante de apenas 5 minutos. A partir disso, podem-se observar os 
seguintes resultados expostos na tabela 2: 
Tabela 2 – Relação dos grupos e tempo de exposição ao hipoclorito de sódio 1%, bem como 
resultados em porcentagem e o tipo de contaminação. 
Grupo Tempo de exposição 
ao hipoclorito de sódio 1% 
Resultado 
1 20 minutos 30% de contaminação 
2 15 minutos 100% de contaminação –fungos 
3 10 minutos 100% de contaminação –fungos e bactérias 
 
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Ao realizar uma exposição das folhas ao hipoclorito de sódio 1% no tempo de 20 minutos foi possível 
observar que o tempo foi suficiente para tratar e desinfestar aproximadamente 70% da cultura sendo 
que, ainda assim, houve uma significativa contaminação do meio. Em contra partida, quanto menor 
tempo de exposição ao hipoclorito de sódio 1% para desinfestação, como no grupo 4 que realizou 
uma exposição no tempo de 5 minutos, maior a probabilidade de contaminação e não desinfecção do 
material. Então é possível concluir, a partir deste experimento, que a desinfestação do meio de 
cultura é dependente do tempo de exposição ao hipoclorito de sódio 1% assim como a outras 
agentes desinfetantes. Logo, quanto maior o tempo de exposição melhor é o tratamento desinfetante. 
No experimento realizado posteriormente, assementes de cebola foram inoculadas no meio de cultura 
sob ação de determinados reguladores do crescimentovegetal em tubos de ensaio e, a partir disso, 
foram obtidospara interpretaçãoos resultados expostos na tabela 3 e figura 2.
Tabela 3 – Resultado de contaminação e germinação em tubos dos grupos de 1-4 dependendo do 
regulador de crescimento adicionado no meio de cultura. 
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 
 
Regulador de 
crescimento 2,4D 
 
 
Regulador de 
crescimento BAP 
 
 
Regulador de 
crescimento GA3 
 
 
Regulador de 
crescimento 2,4D +BAP 
 
1 tubo de ensaio foi 
contaminado com 
fungos 
 
 
Não houve contaminação 
em nenhum dos 
tubos de ensaio 
 
Não houve contaminação 
em nenhum dos 
tubos de ensaio 
 
2 tubos de ensaio 
foramcontaminados 
com bactérias 
 
Em 2 tubos de ensaio as 
sementes germinaram 
 
 
Em 3 tubos de ensaio as 
sementes germinaram 
 
 
Em 4 tubos de ensaio as 
sementes germinaram 
 
 
Em 3 tubos de ensaio as 
sementes germinaram 
 
 
4 5 minutos 100% de contaminação –fungos e bactérias 
 
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Fig.2- Tubos de ensaio contendo microplantas de cebola Allium cepa tratadas com diferentes 
reguladores de crescimento ordenados em: A) 2,4D; B)BAP; C) GA3; D) 2,4D + BAP
Com base nos resultados apresentados acima (tabela 3 e figura 2), pôde-se observar que, após a inoculação, as 
plantas de cebola Allium cepa L.se desenvolveram de acordo com a ação de cada regulador de crescimento 
adicionado no meio de cultura. De acordo com Santos (2003), a escolha do fitorregulador a ser utilizado na cultura 
in vitro depende do tipo de morfogênese desejada; de seu nível endógeno no explante no momento da excisão; da 
capacidade do tecido sintetizar o regulador durante o período de cultura; e da possível interação entre os 
hormônios vegetais endógenos e aqueles adicionados ao meio. Os principais hormônios utilizados na 
organogênese são as auxinas e citocininas. Outras classes de hormônios vegetais, como as giberelinas, muitas 
vezes, são utilizadas em processos de regeneração organogenética (Peres,2002). 
Ao analisar os resultados, pôde-se perceber que no tubo de ensaio do grupo 1, que adicionou o regulador de 
crescimento 2,4D no meio de cultura, não houve desenvolvimento de parte aérea. Como a auxina é um dos 
principais reguladores envolvidos no processo de enraizamento in vitro, foi possível observar neste experimento a 
formação de raiz. Então, o uso de auxinas favoreceu a indução e a iniciação radicular e inibiu o alongamento da 
planta de cebola. Baixos níveis de auxina são também necessários para o alongamento da raiz, embora altas 
concentrações atuem inibindo o crescimento desse órgão (TAIZ e ZEIGER, 2004). Fatores ambientais, tais como 
tamanho dos tubos de inoculação, meio de cultura, luz, temperatura e o próprio explante, também afetam a 
formação de raízes. O tamanho dos frascos onde os explantes são colocados ajuda ou dificulta a formação e o 
crescimento das raízes, no momento em que se tornam uma barreira física. Dessa forma, frascos maiores 
facilitam o enraizamento. 
Já no experimento realizado pelo grupo 2, com BAP no meio de cultura, foi possível observar que a planta 
resultante da semente de cebola desenvolveu mais parte aérea do que raiz. Segundo Santiago (2001), as 
citocininas são derivadas da adenina (aminopurina) e têm um papel fundamental na diferenciação e regeneração 
 
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de plantas na maioria das espécies, induzem a divisão celular, proliferação e morfogênese da parte aérea. Por 
isso, neste experimento observou-se o crescimento e desenvolvimento do caule da planta. 
Em contrapartida, ao observar os tubos do grupo 3, com GA3 no meio de cultura, é possível avaliar que houve um 
alongamento de caule e indução de germinação de sementes.O regulador giberelina induz o alongamento do 
caule. Dessa forma, foi possível observar claramente um marcante aumento na altura da planta, como mostrado 
na figura 2. 
Por último, no experimento realizado pelo grupo 4, com balanço de 2,4D e BAP no meio de cultura, foi possível 
observar que houve uma pequena formação de calo e raiz, e teve crescimento de parte aérea da planta.A relação 
auxina/citocinina regula a morfogênese em cultura de tecidos. De modo geral, na ausência de citocinina 
praticamente não se observa a ocorrência de divisão celular. Altos níveis de auxina em relação aos de citocinina 
promovem a formação de raízes, enquanto altos níveis de citocinina em relação aos de auxina estimulam a 
formação da parte aérea. E, uma relação intermediária auxina/citocinina favorece o crescimento do tecido não 
diferenciado, comumente referido como callus, ou seja, a proliferação do grupo de células novas originadas a 
partir de um explante (TAKAHASHI, 2002). 
CONCLUSÕES 
Através dos procedimentos realizados pode-se concluir que é possível realizar a cultura de tecidos vegetais in vitro 
respeitando-se todas as medidas cabíveis para manter as condições de assepsia durante o experimento, evitando 
possíveis contaminações por fungos ou bactérias. Conclui-se ainda que a escolha do regulador de crescimento a 
ser aplicado deve estar fundamentada no objetivo que o pesquisador tem com a cultura de tecidos realizada por 
ele, pois a ação dos reguladores na a obtenção de respostas organogenéticas relaciona-se aos padrões 
apontados por Skoog e Miller (1957), isto é, balanços favoráveis as citocininas tendem a induzir organogênese 
aérea enquanto que balanços favoráveis as auxinas favorecem a rizogênese. Para a ativação/indução da 
embriogênese somática a adição de auxinas fortes ao meio de cultura primário parece ser uma condição essencial 
para o desencadeamento de reações metabólicas associadas com esta rota, apesar de que o balanço entre fontes 
nitrogenadas orgânicas e inorgânicas, oxidadadas e reduzidas parece exercer considerável influência. O uso de 
giberelina por sua vez irá trazer a cultura um marcante aumento da plântula por meio do alongamento de seu 
caule. Pode-se ainda fazer o uso combinado dos reguladores auxina/citocina induzindo assim a formação de 
massas celulares indiferenciada, os callus. A mistura de dois ou mais reguladores vegetais pode dependendo da 
composição, concentração e proporção das substâncias, interferir diferentemente no desenvolvimento vegetal, 
estimulando a divisão, a diferenciação e o alongamento celular. Verifica-se que os reguladores influenciam a 
resposta de muitos órgãos da planta, e que esta resposta é dependente da espécie, do estádio de 
desenvolvimento, da concentração de regulador aplicado, da interação entre reguladores e ainda vários fatores 
ambientais como assepsia e temperatura de armazenamento do material. 
AGRADECIMENTOS 
Os autores agradecem a Prof. Dra. Vanessa C. Stein pelo amplo auxílio didático fornecido para a realização 
tanto dos processos práticos, quantos nos aspectos teóricos envolvidos nesta publicação. Agradecem ainda 
à Universidade Federal de São Jõao Del Rei por nos possibilitar a execução deste trabalho. 
 
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CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES 
LE, PS e JM realizou a preparação dos meios de culturas, GC realizou a desinfestaçãode folhas retiradas 
de árvores do campus Dona Lindu da Universidade Federal de São João Del Rei. Todos os autores 
contribuíram com os outros procedimentos, leram e aprovaram o manuscrito final. 
 
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