Aula 5 Sistemas Alternativos De Expressão Na Produção De Biofármacos

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Aula 5 - Sistemas Alternativos De Expressão Na Produção De Biofármacos
OBJETIVOS DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS NA PRODUÇÃO INDUSTRIAL
Produção segura e controlada: homogeneidade do que se está produzindo;
Produção barata: simplificar o processo;
Alto Nível de Produção recombinante (escala de g/L e não de mg/L): isso reduz o custo do processo, visto que o custo de um biorreator é calculado pelo tempo de processamento;
Fácil recuperação das proteínas expressas;
Não degradação da proteína expressa: Na produção industrial utilizamos microrganismos modificados geneticamente com a intenção de nocautear a produção de proteases, que é comum em moo.
A ESCOLHA DO SISTEMA DE EXPRESSÃO
Bactérias
Leveduras
Fungos filamentosos
Cultura de Células Animais
Plantas Transgênicas
As três primeiras são mais fáceis de trabalhar, menos complexas. No caso das duas últimas, irão funcionar como biorreator do biofármaco.
DIFERENÇAS NA EXPRESSÃO DE PROCARIOTOS E EUCARIOTOS
O ambiente químico pode determinar o enovelamento de proteínas e a maquinaria enzimática. Eucariotos possuem núcleo. Procariotos tem DNA circular que é transcrito em uma única fita de RNAm (policistrônico). Na célula eucariótica é transcrito primeiro um pré-RNAm que depois sofre um processo de splicing sendo transportado para o citoplasma onde será traduzido em uma ptn.
Na célula procariota, a proteína está pronta assim que termina de ser traduzida. 
Em eucariotos as ptns sofrem modificações e uma das principais modificações pós-traducionais e que está envolvida na atividade da ptn é a glicosilação. Isso é muito importante para o endereçamento da ptn dentro da célula e na atividade que ela terá. Os padrões de glicosilação de diferentes organismos serão diferentes. As plantas, por ex., possuem um padrão de glicosilação muito parecido com a de um mamífero o que as torna uma boa alternativa para produção de biofármacos.
OBJETIVOS DA PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Melhoramento das características agronômicas e/ou as qualidades nutricionais. Logo, não tem a ver com tecnologia farmacêutica, mas sim com biotecnologia.
Modificações de padrões de expressão gênica podem aumentar a produção de determinado nutriente em determinada planta, por exemplo.
Pensando na produção farmacêutica, as plantas podem funcionar como reatores biológicos sendo usadas para produzir uma ptn ou outras moléculas de interesse.
Uso de plantas como reatores biológicos para produção de biomoléculas:
Carboidratos
Ácidos Graxos
Polipeptídeos e Proteínas (Biofármacos)
Enzimas de uso industrial
Plástico Biodegradável
SISTEMA DE EXPRESSÃO EM PLANTAS TRANSGÊNICAS
Custo de produção reduzido (desenvolver a planta é caro (assim como toda produção de transgênicos) , mas o uso dela como produto é de baixo custo) – grande vantagem;
Os produtos podem ser purificados ou o tecido pode ser processado e formulado para ser usado por via oral;
Biorreatores e fermentadores podem ser substituídos por estufas ou áreas abertas (confinamento biológico apropriado de genes estranhos, tais como herança materna ou esterilidade masculina ou a expressão em tecidos vegetativos com colheita antes do aparecimento de qualquer estrutura reprodutiva);
Permite modificações pós-traducionais como as células de mamíferos;
Modificações lipídicas em antígenos (para vacinas) também são executadas no cloroplasto;
Enovelamento proteico e formação de ligações de enxofre (necessárias para a atividade da ptn) podem ocorrer no cloroplasto ou no retículo endoplasmático;
Não formam agregados insolúveis (facilita a purificação);
Variação da expressão depende da fase de desenvolvimento da planta, da hora do dia e das sequências reguladoras usadas;
Alcançar consistência de expressão do transgene em diferentes lotes é um importante desafio. As folhas colhidas devem ser homogeneizadas e a quantidade do produto deve ser determinado para cada lote colhido.
TÉCNICAS DE PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Transgênese nuclear
Expressão transiente com vetores virais
Tecnologia transplastômica do cloroplasto
Assim como animais e mamíferos, plantas também podem ser infectadas por vírus. Posso inserir a ptn que quero produzir em um vetor viral e infectar a planta. O vírus usa a maquinaria de replicação e tradução da própria célula, logo, irá traduzir a ptn inserida. Com isso, a planta infectada juntamente com outros vírus que a infectaram irá produzir aquela ptn.
Ou posso fazer a inserção em outro vetor de transformação e transformar uma única célula da planta que será chamada de célula-tronco da planta. Com essa transformação feita na planta, podemos fazer com que se regenere e se torne uma nova planta dando origem a uma planta totalmente transformada e todas as células dessa nova planta irão possuir o gene adicionado, mas não necessariamente sendo expresso em todas.
TRANSGENES NUCLEARES ESTAVELMENTE INTEGRADOS
Inicialmente entrega do gene feita por agrobactérias;
Agrobactérias: patógenos de plantas transmitidos através do solo;
Estes microrganismos contêm grandes plasmídeos: Ti (A. tumefaciens) ou Ri (A. rhizogenes), que integram uma parte de seu DNA ao DNA genômico;
Usa-se agrobactérias que já estão presentes na natureza e ela é engenheirada de forma que contenha o plasmídeo com o gene de interesse. O plasmídeo também é produzido em laboratório de forma que tenha a característica de inserir aquele fragmento no genoma da planta.
Infecta-se uma única célula com a bactéria contendo o plasmídeo e assim o gene será inserido no genoma da planta. Coloca-se a célula em cultura e lá serão dados estímulos necessário para que ela cresça. Depois, isso será recuperado em uma nova planta: a célula transformada foi desdiferenciada ao receber os hormônios necessários e gerando o chamado calo que é um conjunto de células indiferenciadas, sem parede celular e que não fazem parte de nenhum tecido da planta, isto é, com perfil de células-tronco. Retira-se uma célula do calo e dá novos estímulos para que ela se torne um calo novamente. Ao colocar esse calo em um meio de cultura semissólido com os estímulos necessários, ele irá se diferenciar em qualquer tecido que se quer bastando estimulá-lo com a combinação de moléculas necessárias para a formação daquele tecido. Com os tecidos desenvolvidos, essa planta é devolvida aos poucos para a terra e vai crescer normalmente.
VANTAGENS
Capacidade de produção de grandes quantidades de proteína a partir de estoques de sementes transgênicas;
Possibilidade de expressão em frutas ou outros órgãos vegetais comestíveis, permitindo a entrega por via oral de materiais minimamente processados (Posso selecionar o órgão que eu quero que a planta expresse o gene. TODAS AS CÉLULAS POSSUEM O GENE, mas nem todas expressam).
 
DESVANTAGENS
Risco de vazamento gênico;
Transgenes nucleares estavelmente integrados rendem tipicamente baixos níveis de expressão;
Grande variação de planta para planta e de geração para geração (silenciamento de genes, pois não há vantagens no gene inserido para a sobrevivência da planta).
A beta-glucocerebrosidase é uma ptn humana que está sendo produzida em plantas. Quando essa ptn produzida é usada nas células Caco (mimetizam a absorção do trato gastrointestinal), ela é melhor absorvida. 
Essa técnica pode ser usada também para a produção de vacinas comestíveis.
EXPRESSÃO TRANSIENTE COM VETORES VIRAIS
Transiente: não é para sempre. É expressa só por um tempo.
Sistema vetor viral para expressão transiente permite a expressão rápida de proteínas recombinante em níveis mais elevados que a metodologia de transgenes nucleares estavelmente integrados;
Sistema de apresentação de epítopos (vacinas): o peptídeo é exposto na superfície da partícula viral;
Sistema de expressão de polipeptídios: proteína recombinante expressa se acumula na planta.
Para o vírus infectar a planta, basta haver uma injúria. Se infectar a folha, por ex., essa folha pode ser retirada e o restante da planta não iráconter essa modificação. Essa informação não será passada para as próximas gerações da planta.
Essa planta não é considerada transgênica, pois a transgênese significa que é possível passar as informações alteradas para as próximas gerações, mas é um sistema de produção de proteínas recombinante.
VANTAGENS
Modificação de partes específicas da planta;
Modelos de fácil manipulação;
Maiores níveis de expressão em relação à integração do DNA exógeno ao genoma (o vírus não é integrado ao genoma);
Alto número de cópias do gene de interesse;
Rápida produção de proteínas recombinantes, sem um longo ciclo de produção ou várias gerações de regeneração.
DESVANTAGENS
O gene exógeno não é herdado pelas próximas gerações;
Limitação do tamanho dos genes e da complexidade das sequências inseridas;
Perigo de introdução de vírus modificados geneticamente no ambiente.
Esse sistema é especificamente importante para a produção de vacinas recombinantes para utilização veterinária. A vacina pode ser tanto pela inserção do vírus na planta e o animal, por ex., comer a planta, ou, pode ser usado em um organismo carreador já que é possível retirar a ptn.
TECNOLOGIA TRANSPLASTÔMICA DO CLOROPLASTO
Obs.: Cloroplasto é a organela responsável pela fotossíntese – mitocôndria. Vem da célula sexual vegetal feminina.
A biologia de um cloroplasto é semelhante à de um procarioto. Pode-se produzir ptns no cloroplasto desde que não necessite de glicosilação.
Procariotos não têm sistema de silenciamento, logo ao integrar uma informação no cloroplasto, ela não será silenciada.
Em geral, as células de pólen de plantas com flores não contêm plastídios. Se um gene estranho está presente apenas no plastoma não será repassado durante a propagação – Células que tem potencial de propagação da planta, em geral, não tem cloroplasto (pólen, semente), logo, não há risco de vazamento gênico.
Genes heterólogos podem ser integrados ao genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga.
Introdução do DNA exógeno ao cloroplasto pode ser feita por microinjeção, uso de agrobactéria ou biobalística.
Biobalística: inserção de DNA exógeno através de micropartículas (em geral de ouro) que carregam esse DNA exógeno. Entretanto, no “bombardeamento” o DNA exógeno pode parar no cloroplasto ou não.
VANTAGENS
Minimiza o risco de transferência de genes externos, já que o pólen não irá carrear o gene;
A expressão nas folhas permite a colheita antes do aparecimento de estruturas reprodutoras;
DESVANTAGENS
Cloroplastos não são capazes de realizar glicosilação;
Nem sempre é possível alcançar altos níveis de expressão;
A taxa de eficiência de transformação é mais baixa;
Os níveis de expressão muito elevados estão limitados a tecido foliar.
Modelo ideal para expressão de proteínas tóxicas para células humanas – não tem sensibilidade a essas proteínas.
E quando a molécula de interesse não é uma proteína?
Precisa garantir a presença do precursor e transformar a planta de forma que todas as enzimas estejam presentes.
SISTEMAS DE EXPRESSÃO EM ANIMAIS TRANSGÊNICOS
A ideia é que se tenha um animal que produza a ptn de interesse. 
Linha básica: Insere-se o DNA exógeno no DNA genômico do animal. Em geral, essa informação é inserida em uma das células do estágio embrionário do animal. A fêmea carregando a modificação genética dará origem a uma prole a qual pode não ser 100% transgênica, necessitando identificar quais animais da prole carregam a transgênese para, então, selecionar a população transgênica.
Por que a prole não é 100% transgênica?
Os métodos tradicionais não preveem a proliferação in vitro no que diz respeito a seleção. 
O método tradicional pega uma célula no estágio inicial da embriogênese (início da fecundação) e microinjeta o DNA exógeno nessa célula, entretanto, não se verifica se esse DNA foi realmente integrado e repete-se esse procedimento para outras células. Após, essas células são reinjetadas em uma fêmea pseudo-grávida. Desses vários embriões reinjetados, muitos não conseguirão se fixar no útero das fêmeas e em alguns embriões reinjetados, o DNA exógeno não irá se integrar. Logo, quando a prole nascer haverá animais transgênicos, mas haverá também animais sem a transgênese.
Se for possível pegar uma célula, modificar geneticamente in vitro, pegar o núcleo dessa célula e colocar em um óvulo sem o núcleo, irá gerar um embrião em que toda a informação genética que ele está carregando vem do núcleo da célula modificada in vitro. Ou seja, a integração já foi feita na cultura de células, e com isso, todos os animais que receberam esses embriões serão 100% transgênicos. Esse tipo de abordagem é a da ovelha Dolly, entretanto essa tecnologia foi usada em uma célula somática e, por isso, ela morreu logo.
Fêmea pseudo-grávida: passou pelo processo de acasalamento, mas com um macho vasectomizado. 
Técnicas de expressão em animais transgênicos:
1) Microinjeção de DNA
2) Transgênese mediada por células ES
3) Transferência nuclear de célula somática
1) MICROINJEÇÃO DE DNA
Tenho um óvulo que foi fecundado. Antes dos núcleos do espermatozoide e do óvulo se fundirem, eles são divididos em 2 pró-núcleos (masculino e feminino). Nesses pró-núcleos faz-se uma microinjeção para inserir o gene que se quer. A chance de dar certo é baixa, mas só é possível saber disso depois que o animal nascer.
Exemplo: 
Faz-se uma injeção de hormônio em um camundongo fêmea fazendo com que ela super ovule. Ao cruzá-la com um camundongo macho, os óvulos serão fecundados. Com isso, retiro os óvulos fecundados, faço a microinjeção, e reintroduzo na fêmea. Os ratos têm uma característica importante: o coito é necessário para que a gravidez vá para a frente, então, não adianta pegar os óvulos modificados e reinserir na fêmea se ela não tiver feito o ato sexual. O que temos, então, é uma fêmea pseudo-grávida, logo, reintroduzo os óvulos que darão a origem aos camundongos modificados.
2) TRANSGÊNESE MEDIADA POR CÉLULAS ES
 
Pode ser feita de duas maneiras diferentes:
1 – Pego o camundongo e retiro as células espermatogoniais (precursoras dos sptz). Coloco em cultura. Faço uma infecção viral nas células com um vírus que contenha o gene de interesse. Deixo as células crescerem na cultura. Reintroduzo no testículo do camundongo. Aquele camundongo terá, então, células transformadas e não-transformadas (perfil de sptz mistos). Ele irá cruzar com uma fêmea que não recebeu modificação. No fim, teremos camundongos modificados e não-modificados.
2 – Retiro as células ES, coloco em cultura e adiciono o gene que quero (pode ser por infecção viral também). Seleciono as células que quero e introduzo em um blastocisto já formado. A fêmea dará origem, então, a um animal quimera, pois parte dos tecidos dele são de células transformadas e outra parte não. Esse animal gerado também terá células reprodutoras modificadas e não modificadas e dará origem também a animais modificados e não modificados. Só terei um animal com a transformação completa na geração desse próximo animal formado. O animal totalmente transformado só virá na terceira geração.
3) TRANSFERÊNCIA DE NÚCLEO DE CÉLULA SOMÁTICA
Pego uma célula somática qualquer e faço a transformação do genoma inserindo o gene de interesse. Retiro o núcleo da célula e introduzo em um ovulo fecundado. Retiro o núcleo do ovulo fecundado e coloco no núcleo transformado da célula somática. Coloco na fêmea pseudo-grávida e na primeira geração haverá o camundongo com a transformação.
Desvantagem: o núcleo adicionado já é “idoso” e o animal que será gerado já estará com os telômeros degradados.
Vantagens e desvantagens gerais
Vantagens
Grande capacidade de escalonamento;
Baixo investimento em infraestrutura;
Alto rendimento (> 5g/L);
Purificação facilitada (ausência de restos celulares, proteases e DNA);
Desvantagens
Custo alto para criação do rebanho transgênico;
Baixo nível de incorporação de DNA exógeno (especialmente em ruminantes);
Técnica de microinjeçãoapresenta baixo rendimento (5,0 a 3% de embriões transformados produzem animais transgênicos);
Possibilidade de contaminação (vírus e príons)
Obtenção da Proteína Recombinante
Em qual fluido iremos produzir a ptn? Leite. Muito mais fácil de se trabalhar, além de apresentar maior rendimento do que o sangue, por exemplo, já que não se pode tirar altas quantidades de sangue do animal de uma só vez. É possível fazer em clara de ovo, entretanto a manipulação é complicada não sendo uma escolha viável.
Como faço para a proteína ser expressa no leite? O gene deve ser regulado também pelo promotor da produção de leite (beta-caseína, ptn do leite).
Qual a desvantagem? O boi não produz leite, então, eu não posso garantir que na nova geração só haverá vacas.
A PROTEÍNA PRECISA ESTAR ATIVA!
O que determina qual animal será escolhido para a produção de proteína? Principalmente, o quanto irei precisar da proteína.
O tempo de gestação de ovelhas e cabras são de 5 meses enquanto que da vaca é de 9 meses. O tempo de demora para a maturidade sexual também é alto. Uma vaca produz muito mais leite do que um coelho e a quantidade de DNA recombinante que se consegue produzir é proporcional a quantidade de litros de leite produzida pelo animal.