Aula Recombinação 2017

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RECOMBINAÇÃO BACTERIANA
Genética microbiana
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Variabilidade genética: 
variações que conduzem à formação de clones com propriedades distintas do clone “selvagem” original. 
 Mutação e Recombinação
Transferência gênica vertical
Transferência gênica horizontal
X
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Variabilidade genética
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Variabilidade genética permanente resultante de Recombinação Genética
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Genoma bacteriano
Maioria: 1 cromossomo circular.
Exceção: 
Streptomyces lividans, Rhodococcus faciens e espiroquetas do gênero Borrelia : lineares
 algumas espécies de bactérias do gênero Brucella: 2 cromossomos. 
Tamanho: ~600.000 pb (Mycoplasma genitalium) a ~9.500.000 pb (Myxococcus xanthus)
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Plasmídeos
Elementos genéticos que formam mecanismos adicionais para alteração genética.
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DNA fita dupla e circulares
entre 1.500 a 400.000pb (1 a 5% do tamanho do cromossomo)
Autoduplicante
Carregam informação não essencial a célula, mas podem prover vantagem seletiva para as bactérias que os possuem.
Ex.: plasmídeo de dissimilação, fator R, plasmídeo F, bacteriocinas, toxinas.
Plasmídeos
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Processo de recombinação em Bactérias
Mecanismos de transferência de DNA – troca de genes entre duas moléculas de DNA (formar novas combinações de genes em cromossomo). 
Três processos:
Conjugação Transformação Transdução
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 Mecanismo de transferência genética que envolve uma célula doadora (que contém um plasmídeo) e uma receptora ( que não contém o plasmídeo)
Usada para mapear a localização de genes em um cromossomo bacteriano
 É necessário o contato entre as células
 Depende da presença do fator F de fertilidade (plasmídeo conjugativo)
Conjugação
 Molécula de DNA circular 
 Contém cerca de 40 genes
 Contém genes responsáveis pela formação do pilus e pela sua transferência (região tra)
 Replicação autônoma e pode se integrar no 
 cromossomo 
Características do fator F
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Tipo de plasmideo: Fator R: Fator de resistência – transportam genes que conferem à célula hospedeira resistência a antibióticos (cloranfenicol), metais pesados (mercúrio) ou toxinas
FTR (Fator de transferência de resistência): Gene de replicação do plasmídeo e conjugação
r-determinante: gene de resistência (codifica a produção de enzimas que inativam drogas e toxinas)
DIAGRAMA DO FATOR R: FTR e R-determinantes: Quando presentes na mesma célula – recombinam-se para produzir fator R com novas combinações de genes
90 pares de kpb (quilobases) = bases de DNA ou RNA 
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Etapas da Conjugação
- Formação de pares específicos e Conexão celular -O pilus estabelece contato entre uma célula doadora (F+) e uma receptora (F-)
- Replicação e Transferência do fator F (Fator de fertilidade) – Ao ser transferido o plasmídeo também é replicado
F+ x F- = F+ + F+
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Gene responsável pela formação do pilus sexual
Fator de fertilidade
Helicase
Sintese por
DNA polimerase
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Hfr (Alta Frequência de Recombinação)
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- Quando o plasmídeo tem a capacidade de integrar-se no cromossomo bacteriano ele é chamado de epissomo 
- A célula F+ passa a ser chamada de célula Hfr
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Hfr x F- = Hfr + F- recombinante
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Quando uma célula Hfr conjuga com uma F- ocorre a transferência de genes cromossomais da bactéria Hfr para a F-.
c
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Exemplo de detecção da conjugação
Hfr x F- = Hfr + F- recombinante
Doadora Hfr: Sensível à Str e selvagem em relação à síntese de Thr e Leu e à utilização de Lac
Receptora F-: Incapaz de sintetizar os aminoacidos e de utilizar Lactose, porém resistente à Str
Meio mínimo seletivo – contém Str em que apenas células recombinantes são capazes de crescer.
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Transformação
- Frederick Griffith (1928)
Linhagens de Streptococcus pneumoniae
Colônia rugosa
Colônia lisa
Linhagem R  não é virulenta
(Falta a cápsula de polissacarídeos, então ela é reconhecida e destruída pelo sistema imunológico do hospedeiro)
Linhagem S  virulenta
(A cápsula de polissacarídeos impede
a detecção pelo sistema imunológico
do hospedeiro – previne a fagocitose)
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- Genes transferidos de uma bactéria para outra – transferência em que DNA livre é incorporado em uma célula receptora (promove alteração genética)
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Experimento de Griffith (1928)
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Genes (mat. hereditário) bactérias mortas penetraram nas cél. Vivas não encapsuladas e alterado seus genes
Progênie encapsulada (células recombinantes)
Oswald Avery, Clin McLeod e Maclyn McCarty (1944 ) - Descobriram que componente responsável pela transformação foi DNA (transportador das informações genéticas) – tubo de ensaios
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Transformação
Bactérias após a morte e lise cellular – liberam DNA no ambiente:
A tranferência genética a partir da qual o DNA livre é incorporado em uma célula receptora, podendo promover alterações genética. 
Quando uma célula é lisada, o DNA é extravasado e quebrado
Algumas células são capazes de captar estes fragmentos de DNA do meio (células competentes)
Estes fragmentos podem então se integrar ao seu cromossomo 
Portanto teremos uma célula recombinante
Célula recombinante ou hibrida
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Competência: Alterações na parede celular tornando-a permeável a moléculas grandes de DNA
Final da fase logarítmica
Fatores de competência: Proteínas específicas (proteínas especiais que desempenham papéis na captação e no processamento do DNA)
Características da transformação
Competência
Célula receptora em estado fisiológico que pode captar o DNA doador
Ex: Bacillus subtilis, Streptococcus
- Presença de DNA livre no meio
Entrada do DNA:
Proteína de ligação, autolisina na parede celular e várias nucleases
- Integração e replicação do DNA
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Proteína de ligação ou Nuclease
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Transdução 
 Um vírus bacteriano (bacteriófago) transfere DNA de uma célula doadora para uma uma célula receptora
Tipos de ciclos
Ciclo lítico - adsorção, penetração, replicação, montagem e liberação
Fagos virulentos (citoplasma)
Ex: bacteriófago T4
Ciclo lisogênico - adsorção, penetração, integração e replicação
Fago temperados (dormente) – núcleo
Ex: Bacteriófago lambda
Tipos de transdução
Generalizada 
 Qualquer fragmento do 
cromossomo da bactéria pode ser transferido
Especializada 
Transferência de genes 
 adjacentes ao prófago (DNA viral + DNA bacteriano) 
13
Ex: Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas entre outras
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Ciclo Lítico e Lisogênico
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Transdução generalizada – fago virulento
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Fago fixa à parede celular da bactéria doadora e injeta DNA
...também dirige a síntese do revestimento proteico dos fagos
DNA do fago age como molde para síntese de novos DNA’s de fago... 
fragmento poderá ser transferido
Linhagem portadora
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Transdução especializada – Fago temperado 
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Ciclo lisogênico
Ciclo lítico
Transferência de pequena região de cromossomo bacteriano
Replicação em sincronia com hospedeiro – podendo reverter à via lítica em determinadas condições
Siontomas tardios / incurável Ex: AIDS e Herpes
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Próxima aula:
 
Vírus
Genética microbiana – São características hereditárias dos microrganismos que proporcionam formas e estruturas, seu metabolismo, capacidade de locomoção e de interagir com outros microrganismos, talvez causando doenças. Organismos individuais transmitem essas características aos descendentes através de genes.
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Linhagem R – colônias com aspecto rugoso 
Linhagem S – colônias lisa (smooth)
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