Técnicas em Biologia Celular: Microscopias e Cultura Celular

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Bases Estruturais da Matéria Viva – boco 1 – Aula 1 
Microscopia Óptica 
Microscopia Óptica 
“As ferramentas a nossa disposição determinam o que podemos aprender sobre as células.” 
- The Cell 
A LUZ: A formação de uma imagem em um microscópio óptico depende da interação da luz com a 
amostra e dos efeitos de difração óptica causados por essa interação. Se duas ondas estão em fase, a onda 
resultante é maior e, portanto, de maior luminosidade. Por outro lado, se duas ondas estão fora de fase, 
acontece um fenômeno em que elas se anulam total ou parcialmente, diminuindo a luminosidade. Quando 
a luz da fonte luminosa de um microscópio passa pela amostra, isso gera mudanças nas relações de fase 
das ondas luminosas. A luz visível e invisível fazem parte do espectro eletromagnético com diversos 
comprimentos de onda. Quando maior o comprimento de onda, menor será o nível de energia 
daquele tipo de radiação. 
LIMITE DE RESOLUÇÃO: É a menor distância entre dois objetos que o olho nu, um microscópio ou um 
aparelho qualquer é capaz de distinguir sem interpretar esses dois objetos como apenas um. O limite de 
resolução é definido por alguns parâmetros, como: 
 Comprimento de onda da fonte luminosa: Um certo tipo de radiação não consegue discernir 
bem objetos menores que seu próprio comprimento de onda. Como os microscópios ópticos 
lidam com a luz visível, que vai de comprimentos de onda de 0,4μm a 07 μm, os menores objetos 
que esses aparelhos conseguem resolver bem são bactérias e mitocôndrias, que medem cerca de 
0,5 μm. 
 Distância de Trabalho: Espaço entre a amostra e a lente objetiva. Quando menor a distância de 
trabalho, maior é a abertura numérica da lente. 
 
 Abertura Numérica ( : corresponde ao seno da metade do ângulo formado pelo cone de 
luz que a lente objetiva consegue captar, multiplicado pelo índice de refração do meio entre a 
amostra e a objetiva. 
 Largura angular do cone de luz que as lentes objetivas coletam: Quanto maior for, maior se 
tornará a resolução e mais clara será a imagem. O ângulo theta, da fórmula abaixo, corresponde à 
metade desta angulação. 
 Índice de refração(n) do meio em que a distância de trabalho está compreendida. 
Esses parâmetros e sua relação com o limite de resolução são expressos pela fórmula 
 
 
 
 
 é uma expressão que corresponde à abertura numérica,. Em lentes secas, este parâmetro alcança 
um valor máximo de 1 (sin θ ≤ 1 e n do ar=1), mas quando usado um óleo de imersão, o valor da abertura 
pode chegar até 1,4. 
Como funcionam os óleos de imersão: O uso 
do óleo de imersão é necessário devido ao 
fenômeno de refração da luz. Quando a luz 
passa de um meio com índice de refração maior 
para um meio de índice de refração menor, ela 
sofre um desvio e se afasta da Normal. Quando 
pensamos no microscópio óptico, a luz que 
atravessa a amostra montada entre lâmina e 
lamínula (vidro) encontra em seguida o ar, antes 
de atingir a lente objetiva. O índice de refração 
do vidro (+/- 1,5) é maior que o do ar (1.0). 
Observe a figura abaixo: 
 
 
Em objetivas secas, a abertura numérica é 
limitada porque os raios emergindo da lamínula 
em ângulos superiores a 39 graus sofrem 
reflexão interna total (na figura abaixo, esse 
ângulo está representado pela linha pontilhada). 
Repare que os raios com ângulos superiores 
sofrem reflexão interna total na interface ar-
lamínula, não contribuindo dessa forma para a 
formação da imagem (lado esquerdo da figura). 
 
MAGNIFICAÇÃO OU AUMENTO: Corresponde ao resultado do produto entre o aumento dado pela lente 
objetiva e o aumento dado pela lente ocular. Embora ao aumentarmos o zoom sobre nossa amostra, e 
com isso obter novas informações sobre ela, nunca teremos mais informação do que o limite de resolução 
oferece. Pode-se aumentar o zoom tanto quanto as lentes permitam, mas dois objetos abaixo do limite de 
resolução serão vistos como apenas um. 
DETECÇÃO: Pode-se detectar um objeto muito menor do que o limite de resolução de um microscópio 
óptico se este emite luz própria, por exemplo. Contudo, efeitos de difração da luz farão com que este 
objeto apareça borrado e com um tamanho dentro do limite de resolução. 
 
Componentes Básicos de um Microscópio Óptico 
O CAMINHO DA LUZ: Uma fonte luminosa emite luz que será captada por uma lente condensadora. Esta, 
por sua vez, projeta o feixe de luz condensado sobre a amostra (posicionada sobre uma platina). A luz 
então interage com a amostra segue até a lente objetiva, que amplia a imagem da amostra e transmite até 
um par de lentes oculares. Estas, por sua vez, captam a imagem e realizam um aumento final antes de 
projetá-la na retina do observador ou em uma câmera digital.. 
 
 
Microscópio Reto e Invertido 
 
Atribuição Reto (up Right) Invertido 
Fonte luminosa e lente condensadora Na parte inferior, apontando para 
cima. 
Na parte superior, apontando para 
baixo. 
Lentes Objetivas Na parte superior, apontando para a 
amostra abaixo. 
Na parte inferior Apontando para a 
amostra acima. 
Aplicação Biológica Amostras em lâminas ou células em 
suspensão. 
Células vivas fixadas na parte inferior 
de uma garrafa de cultura ou placa 
de petri. 
 
 
Diferentes Tipos de Microscópios Ópticos 
MICROSCÓPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO: Microscópio simples ou microscópio padrão. Requer 
preparo de amostra (fixação e coração) para torná-la bem visível. Não é impossível visualizar células se a 
luminosidade for ajustada, mas apenas seu contorno geral será visível. O preparo de amostras para esse 
tipo de amostra é feito da seguinte maneira: 
 Fixação: Para matar, imobilizar e conservar a forma original da célula, são usados fixadores como 
o formaldeído, por exemplo. Eles se ligam covalentemente à extremidade amino livre dos 
aminoácidos e os intercruzam, estabilizando a forma da célula. 
 Desidratação e Emblocamento: Toda a água da célula é retirada e substituída por um solvente 
orgânico. Esse solvente então é removido e substituído por um meio de resina ou cera para o 
emblocamento da célula, que consiste em congelar ou polimerizar esse meio para remover a 
característica de fragilidade e moleza da célula. 
 Microtomia: Em um aparelho de nome micrótomo, a amostra enrigecida é cortada em pequenas 
fatias chamadas de secções. Isso é necessário pois um tecido ainda é muito espesso para a boa 
visualização de células em microscopia. 
 Coloração: As secções que saem do micrótomo são transparentes e quase invisíveis ao 
microscópio comum, por esse motivo são tratadas com corantes orgânicos quimicamente 
específicos a determinadas estruturas e componentes celulares. 
 
MICROSCÓPIO ÓPTICO DE CONTRASTE DE FASE: Dispensa uso de corantes, ou seja, nesse modelo é 
possível a observação de células vivas. Utiliza um sistema de filtro, chamados anéis de fase, que interferem 
no trajeto da luz e permite que haja um contorno claro-escuro nas estruturas celulares. Contudo, neste 
tipo de microscopia, obtém-se uma imagem confusa caso as células da sua amostra estejam aglomeradas 
uma sobre as outras. 
MICROSCÓPIO ÓPTICO DE CONTRASTE DE INTERFERÊNCIA DIFERENCIAL: Utiliza o mesmo princípio 
dos anéis de fase da microscopia de contraste de fase, contudo, gera uma imagem mais confortável ao 
observador. Esse aparelho secciona sua amostra em diversos cortes ópticos, de modo que, caso haja 
células sobrepostas em camadas, é possível selecionar apenas um plano. 
MICROSCÓPIO ÓPTICO DE FLUORESCÊNCIA: Utiliza o princípio das moléculas fluorescentes para a 
detecção de moléculas específicas na célula ou na matriz celular. As moléculas fluorescentes tem a 
propriedade de absorver um determinado comprimentode onda e emitir uma onda de maior 
comprimento que absorvida. Também é comum acoplar anticorpos aos corantes fluorescentes. 
 O Caminho da luz: A luz sai de uma fonte luminosa forte para então passar por um filtro(1) que 
permite apenas que o comprimento de onda que excita a molécula fluorescente passe. Essa onda 
então atravessa a amostra e depois um filtro(2) que somente permite a passagem do 
comprimento de onda emitido quando o corante fluoresce. 
 Câmeras CCD: Como o olho humano possui limitações em situações de baixa luminosidade, as 
câmeras CCD ou câmeras com um dispositivo de carga acoplado (Charge-Coupled Device), são 
muito úteis na microscopia e, em especial na microscopia de fluorescência. Elas são resfriadas a 
fim de reduzir o ruído e então permite que as células sejam observadas por um longo período de 
tempo sem sofrerem danos por exposição à luz ou ao calor. 
 
MICROSCOPIA CONFOCAL: A conjugação da ciência da computação aos microscópios de fluorescência 
trouxe uma nova dimensão à microscopia óptica. Imagens tridimensionais podem ser obtidas a partir de 
cortes ópticos da amostra capturados e analisados em computador. 
Em resumo, trata-se de visualizar, com o microscópio, os diferentes “níveis de espessura” da célula ou 
estrutura que não pode ser fatiada com uma técnica que permite que a florescência das demais partes, 
que também são iluminadas, não interfira na imagem final captada na ocular, tornando-a um borrão. A 
partir da junção dessas diferentes analises, desses diferentes cortes, sob diferentes focos, é possível obter a 
imagem tridimensional da célula ou estrutura observada. 
 
Bases Estruturais da Matéria Viva – boco 1 – Aula 2 
Microscopia Eletrônica 
Microscopia Eletrônica 
Propicia um maior poder de resolução em relação aos microscópios ópticos, pois, em vez de usarem o 
espectro da luz visível, usam elétrons, cujas ondas possuem um comprimento muito reduzindo, portanto 
capazes de resolver objetos muito menores. 
LIMITE DE RESOLUÇÃO NO MIROSCÓPIO ELETRÔNICO: Quanto mais rápido o elétron, menor seu 
comprimento de onda. Em um microscópio eletrônico os elétrons possuem uma aceleração tal que seu 
limite de resolução é, teoricamente, de 0,002nm. Contudo, as aberrações das lentes magnéticas dos 
microscópios eletrônicos são mais difíceis de corrigir que as das lentes de vidro, além de possuírem baixa 
abertura numérica, portanto o limite de resolução sobe para 0,1nm (1 angstrom). Já em amostras 
biológicas, o limite de resolução é de 1nm (10 angstroms) por causa dos métodos de preparo da amostra 
e pelos danos que ela sofre com a forte radiação que recebe no microscópio. Mas ainda assim a resolução 
pode ser melhorada com o desenvolvimento de fontes luminosas mais brilhantes e confiáveis chamadas 
de canhões de emissão. 
O CAMINHO DA LUZ NO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO: Um feixe de elétrons é emitido por um filamento 
através de uma coluna em alto vácuo, a fim de que os elétrons não colidam com moléculas presentes no 
ar. Ela então passa por um conjunto de bobinas magnéticas (lentes) análogas às encontradas em um 
microscópio óptico: primeiro uma lente condensadora do feixe de elétrons, depois esse feixe interage com 
a amostra para então ser captado por lentes objetivas e depois lentes projetoras que lançam a imagem em 
uma tela, filme fotográfico ou câmera digital. 
As amostras são coradas com material eletrodenso. Ou seja, as partes mais densas da amostra refletirão 
mais elétrons e, portanto, serão mais escuras na imagem. 
 
 
Preparo de Amostras em Microscopia Eletrônica 
Não é possível ter amostras vivas no microscópio eletrônico pela alta exposição à radiação e ao vácuo, 
portanto, um preparo especial é feito sobre a amostra: 
Primeiro a amostra é fixada com glutaraldeído, que intercruza covalentemente moléculas proteicas e seus 
vizinhos e tetróxido de ósmio, que estabiliza as bicamadas lipídicas. Após isso a amostra é desidratada e 
polimerizada por uma resina monomérica, formando um bloco sólido. É feito então o seccionamento da 
amostra com uma lâmina de diamante ou vidro, necessário, pois o poder de penetração dos elétrons é 
muito baixo. Antes ou depois do corte, a amostra é impregnada com sais de metal pesado, uma vez que 
o contraste no microscópio eletrônico depende do número atômico dos átomos na amostra. A amostra é 
então colocada em uma pequena grade de metal para ser observada. 
Microscopia Eletrônica de Varredura e de Transmissão 
MEV: Produz uma imagem detalhada da superfície de uma amostra por meio da detecção de elétrons 
emitidos e espalhados por ela. Após o preparo da amostra, ela é varrida por um feixe estreito de elétrons. 
Os elétrons emitidos e espalhados pela interação desse feixe com a amostra são mensurados e usados 
para controlar um segundo feixe que, em sincronia com o primeiro, forma a imagem em uma tela de 
televisão. A aparência tridimensional da imagem é obtida por meio das diferenças da quantidade de 
dispersão de elétrons, que depende do ângulo da superfície em relação ao feixe que ela recebe. 
MET: Possui mecanismo semelhante ao microscópio de varredura, mas neste caso é possível observar 
estruturas internas da célula e moléculas isoladas por meio de uma técnica de contraste chamada de 
sombreamento com metais. Nessa técnica o metal é aplicado em um ângulo oblíquo de maneira a 
depositar uma cobertura mais espessa em algumas áreas que em outras, formando padrões de claro e 
escuro que contribuem para a tridimensionalidade da imagem obtida. 
 
Bases Estruturais da Matéria Viva – boco 1 – Aula 3 
Cultivo de Células e Tecidos 
Cultura de Células 
IMPORTÂNCIA DA CULTURA CELULAR: Possibilita o isolamento de um tipo celular para estudo, 
população homogênea de células. É possível obter, através da cultura em larga escala, grandes 
quantidades de componentes bioquímicos e moleculares das células. É mais conveniente para se manusear 
e observar em laboratório, elimina estresse de animais em teste. Muito útil para avaliar efeitos de drogas e 
fármacos e observar interação entre dois tipos celulares. 
 
Cultura Primária e Secundária 
CULTURA PRIMÁRIA: São obtidas à partir do tecido de um organismo. Primeiramente, rompe-se a matriz 
extracelular e as junções entre células por meio de enzimas proteolíticas, como tripsina e colagenase, em 
um processo chamado de digestão enzimática. Então, por meio de agitação leve, obtém-se uma solução 
de células individualizadas, mas de vários tipos. 
Para separar um único tipo celular, usa-se a imunofluorescência, pela qual um anticorpo específico ao 
tipo celular alvo é ligado a um corante fluorescente a fim de marcar essas células. Então, as células 
marcadas são separadas das demais em um separador de células ativado por fluorescência eletrônico. 
 Senescência celular replicativa: processo pelo qual a célula para de se dividir após um número 
finito de ciclos replicativos. Relaciona-se diretamente com o encurtamento progressivo dos 
telômeros a cada divisão celular. É a grande desvantagem das culturas primárias, fazendo com 
que durem por apenas algumas semanas ou meses. 
 
CULTURA SECUNDÁRIA: Este tipo de cultura cobre a desvantagem das culturas primárias em relação à 
senescência celular replicativa. As células podem proliferar-se indefinidamente por meio da indução de um 
gene que codifica a subunidade catalítica da telomerase, mantendo, portanto, os telômeros intactos. 
Além disso, devem-se inativar mecanismos de checkpoint, que geralmente são ativados pelo próprio meio 
de cultura e param o ciclo celular. 
 Desativação de mecanismos de checkpoint: Os checkpoints são mecanismos de feedback que 
monitoram a execução do ciclo celular e inibem o início de eventos subsequentes até que os 
processos daetapa anterior sejam executados com sucesso. Eles podem ser desativados por meio 
da introdução de oncogenes derivados de adenovírus tumorais 
 Linhagens de células transformadas: Possuem diversas diferenças com relação às linhagens 
imortalizadas não transformadas (estabelecidas) porque são geradas a partir de células 
cancerosas. 
 
 
 CULTURA PRIMÁRIA CULTURA SECUNDÁRIA 
Desvantagens Pouco tempo de cultivo, a célula 
entre em senescência celular 
replicativa e depois, apoptose. 
Apresentam maior diferença em 
relação ao tecido in vivo 
Vantagens Propriedades mais semelhantes 
ao in vivo 
Uniformidade na cultura. Cultivo 
em larga escala. Mantém 
viabilidade ao serem congeladas 
e descongeladas. 
 
 
Cultura Histotípica e Organotípica 
As culturas histotípicas são culturas de células reagregadas reproduzindo característica das células no 
tecido original. Por exemplo, as neuroesferas. Já as culturas organotípicas são semelhantes às descritas 
anteriormente, com a diferença que agregam mais de um tipo celular para observação in vitro. 
 
Manutenção da Cultura Celular 
Células diferentes requerem estratégias de cultivo diferentes. Por exemplo, células aderentes, ou seja, 
ancoragem-dependentes são cultivadas em garrafas ou placas de forma a se aderirem ao fundo desses 
recipientes, são geralmente células de seres multicelulares, que formam uma matriz extracelular. Já células 
em suspensão, geralmente seres unicelulares ou sanguíneas, são conservadas em agitação leve, a fim de 
que as células não decantem para o fundo do recipiente de cultura. 
FATORES PARA A MANUTENÇÃO DA VIDA DA CÉLULA IN VITRO: 
 Estufa adequada: Deve-se manter a estufa à uma temperatura e concentração de CO2 e outros 
gazes apropriada a um determinado tipo celular em cultivo. 
 Esterilidade: Para evitar contaminação das células em cultura e preservar sua homogeneidade, é 
necessário uma série de precauções como uso do fluxo laminar vertical, equipamento de 
biossegurança, uso de garrafas, pipetas e outros instrumentos de manuseio sempre estéreis. Além 
disso, é importante o uso de antibióticos e fungicidas no meio de cultura. 
 Meio de cultura: Deve ser adequado ao tipo celular com que se trabalha, com pH e nutrientes 
específicos para a célula em questão O meio pode ser definido, ou seja, todos os componentes 
são conhecidos ou semidefinido, no qual há presença de extratos animais ou vegetais para 
fornecer nutrientes à célula. 
 Soro Fetal Bovino: É um suplemento para meios de cultura que contém uma grande 
quantidade de componentes como ácidos graxos, fatores de crescimento, aminoácidos e 
vitaminas. Seus componentes têm a finalidade de promover o crescimento das células. É 
obtido a partir de sangue coagulado. 
REPIQUE CELULAR: Faz-se necessário para que às células não entrem em inibição por contato dentro do 
meio de cultura ou morram por falta de nutrientes e excesso de componentes tóxicos, bem como acidez 
progressiva do meio de cultura. As fases do crescimento celular em cultura são mostradas a seguir:
 
Adaptação: As células estão se adaptando ao 
novo meio e ao estresse da troca de meios ou 
explante do tecido original. O crescimento é 
lento. 
Exponencial: Crescimento celular rápido 
Estacionária: O número células em apoptose é 
igual ao número de células fazendo divisão 
celular. 
Morte: Devido à acidez do meio, o aumento no 
número de excretas celulares e déficit de 
nutrientes, a população celular diminui 
rapidamente.
ESTOCAGEM DE CÉLULAS: É importante estocar linhagens celulares corretamente tanto para fins 
comerciais, quanto para fins laboratoriais, afinal, é necessário ter células em reserva para casos em que as 
células em cultura se contaminem ou fiquem inviáveis de um outra forma. 
Ao congelar a célula para estocagem, é necessário evitar a formação de cristais de gelo que podem romper 
a membrana celular. Para isso, deve-se usar um crioprotetor como DMSO e diminuir a temperatura celular 
gradualmente, colocando-a a -20°C, -80ºC, para, então colocar em nitrogênio líquido. Quando ao 
descongelamento, deve ser rápido, uma vez que o crioprotetor é tóxico para a célula. 
 
 
Cultura de Células Tronco--Embrionárias 
Esse tipo celular é muito promissor para a cultura pois podem proliferar-se indefinidamente e possuem 
potencial de diferenciação irrestrito. Suas descendentes no embrião são capazes de se integrar 
perfeitamente no tecido em que serão inseridas. As expectativas nesse tipo de tecnologia são muitas, uma 
vez que oferece janela para reparo tecidual, produção de células especializadas para terapia e, até mesmo, 
crescimento de órgãos inteiros a partir delas. 
O principal problema do uso de células tronco-embrionárias é a possível rejeição do sistema imunológico 
do paciente, mas isso pode ser solucionado se as células em cultura derivarem do próprio paciente ou por 
meio de uma estratégia chamada de clonagem terapêutica. 
CLONAGEM TERAPÊUTICA: Um clone é um grupo de indivíduos geneticamente idênticos por terem 
descendido de um único ancestral. Células em cultura são clones umas das outras, por exemplo. 
Transplante nuclear de células somáticas é um processo no qual o núcleo de uma célula ovo não fertilizada 
(haploide) é substituído por um de uma célula somática diploide comum. Essa célula híbrida pode então, 
em raros casos, dar origem a um embrião jovem. 
A clonagem terapêutica usa a técnica do transplante nuclear de células somáticas para produzir Células 
tronco embrionárias personalizadas, que serão usadas como fonte desse tipo celular em cultura para usos 
clínicos, por exemplo. As células produzidas são quase idênticas ao núcleo do doador, podendo ser usadas 
em transplantes sem risco de rejeição. Além disso, podem ser feitas células específicas para o estudo e 
testes de fármacos para uma doença quando o núcleo recebido é de um indivíduo com uma disfunção 
hereditária. 
 
Produção de Anticorpos 
Tendo em vista que a técnica de obtenção de anticorpos por meio da inoculação de animais possui 
diversas limitações, desenvolveu-se uma técnica alternativa: a produção de anticorpos monoclonais em 
linhagens de hibridomas. 
Hibridomas: Linhagem celular obtida pela fusão de linfócitos B secretores de anticorpos com células de 
um tumor linfoide. Podem fazer uma anticorpo particular e também se multiplicar indefinidamente em 
cultura. São propagados como clones individuais e produzem um único tipo de anticorpo monoclonal, 
este, por sua vez, reconhece apenas um tipo de sítio antigênico. 
Vantagem: Fonte infinita de anticorpos com uma especificidade muito maior. Mais conveniente pois não 
envolve o abatimento frequente de animais