Imunogenética - Aula

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IMUNOGENETICA
Sergio Crovella
Departamento de Genética
UFPE
crovelser@gmail.com
Slides e material didático no site
http://www.sergiocrovella.org
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Defesa Natural contra Doenças
Difusão da Variola nas tropas
Auto-vacinas
Variola auto-inoculação
Células e moléculas do sistema imune
Células de Memória
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Sistema de Defesa dos Animais
Os Animais se defendem dos patógenos através de sistema inespecífico (inato) e específico
Defesa Inata: pele, barreira muito eficiente contra patógenos
Defesa Específica: proteínas (anticorpos) capazes de reconhecer, ligar-se e destruir o patógeno
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Muitas das nossas defesas são implementadas por células e proteínas transportadas na corrente sanguínea e no sistema linfático
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As células brancas do sangue, incluindo os linfócitos (células B e T) e fagócitos (tais como neutófilos e macrófagos), desempenham muitos papéis de defesa
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As defesas inespecíficas de um animal, incluem barreiras físicas, microorganismos da flora normal e agentes locais, tais como secreções que contêm uma enzima antibacteriana. 
A resposta inflamatória utiliza muitas células e proteínas. Mastócitos ativados liberam histamina que causam inflamação nos vasos capilares. Proteínas do COMPLEMENTO atraem macrófagos para o local da inflamação, onde englobam bactérias e células mortas.
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Célula sinalizando uma via envolvida na estimulação do receptor toll, estimulando uma resposta de defesa
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A Resposta Imune
Quatro peculiaridades caracterizam a resposta imune:
Especificidade
Habilidade em responder a uma grande variedade de antígenos
Habilidade de destinguir próprio de não-próprio
Memória.
A resposta imune é direcionada contra antígenos que escapam das defesas inespecíficas. 
Cada anticorpo ou células T é direcionado contra um determinante antigênico.
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Existem dois tipos de resposta imune: a resposta imune humoral e a resposta imune celular.
 A resposta imune humoral emprega anticorpos secretados pelas células B para combater os antígenos nos fluidos corporais.
 A resposta imune celular emprega células T para atacar células corporais previamente alteradas por infecções virais ou mutações, ou combater antígenos que invadiram as células.
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Seleções clonais apresentam rapidez, especificidade e diversidade tanto para a resposta imune, quanto para a memória imunológica e tolerância.
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	A memória imunológica desempenha um papel tanto na imunidade natural, quanto na artificial, baseada na vacinação. 
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A Resposta Imune Humoral
Células B ativadas sintetizam e secretam anticorpos específicos. 
A unidade básica de um anticorpo, ou imunoglobulina, é um tetrâmero: duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas também idênticas, cada uma consistindo em uma região conservada e outra variável.
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	As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas colaboram para formar o sítio ligador de antígeno de um anticorpo específico. Cada antígeno geralmente tem diferentes determinantes antigênicos (sítios de ligação para anticorpos específicos). As regiões variáveis determinam a especificidade de cada anticorpo por um determinante. A região constante determina o destino e função do anticorpo.
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	Existem cinco classes de imunoglobulinas. A IgM, primeira a ser formada, é um receptor de membrananas células B, assim como a IgD. IgG é a classe de anticorpo mais abundante e desempenham muitas funções de defesa. A IgE participa na inflamação e reações alérgicas. IgA está presente in vários secreções corporais.
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	Anticorpos Monoclonais consistem em moléculas de imunoglobulinas idênticas direcionadas contra um único determinante antigênico
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A Resposta Imune Celular
Receptor de célula T 
A resposta imune celular é direcionada contra células alteradas ou infectadas.
As células TC atacam células infectadas por vírus ou tumorais, promovendo a lise dessas células.
As células TH ativam as células B e influenciam no desenvolvimento de outras células T e macrófagos.
 Os receptores de células T, na resposta imune celular, são análogos das imunoglobulinas na resposta imune humoral
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	O complexo de histocompatibilidade principal (MHC) codifica muitas proteínas de membrana. As moléculas do MHC nos macrófagos, células B, ou células corporais, ligam-se aos antígenos e apresentam-nos às células T.
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Na resposta imune celular, as moléculas do MHC classe I, células TC,CD8, e citocinas colaboram na ativação das células TC com a especificidade apropriada.
Células T em desenvolvimento são submetidas a dois testes: Elas tem que ser capazes de reconhecer suas moléculas MHC, e não devem se ligar ao mesmo tempo às moléculas do MHC e aos antígenos do próprio corpo As células T que falharem a esses testes, morrem.
A rejeição a transplantes de órgãos resultam de diversidades genéticas das moléculas do MHC.
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TAP 1
TAP 2
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RESPOSTA
HUMORAL
RESPOSTA 
CELLULAR
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O locus MHC (HLA)
	O locus humano MHC mede aproximadamente 4 Mb no braço curto do cromossomo 6 (6p21). Este locus compreende três regiões: um grupo com aproximadamente 20 genes classe I (telomérico), um grupo com aproximadamente 15 genes classe II (centromérico), e um grupo heterogêneo com aproximadamente 30 genes classe III localizados entre os cluster classes I e II.
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MHC desempenha um papel essencial na resposta imune: permite os Linfócitos T reconhecerem o antígeno. 
MHC trabalha junto com TCR e influencia o repertório dos antígenos T capazes de reconhecer o antígeno. 
Essa é a razão porque o complexo MHC desempenha um papel fundamental na susceptibilidade a muitas doenças complexas e auto-imunidade. 	
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Estrutura MHC I 
Expressa na superfície celular
Reconhecida por TCR de linfócitos T CD8 (citotóxicos)
CD8 liga o complexo peptídeo-MHC I
MHC I são requisitados para reconhecimento de antígenos endógenos (via citosólica)
Constituído por duas cadeias: a alfa codificada por genes MHC e a microglobulina beta, codificada por um gene externo ao cluster MHC
A cadeia alfa possui 3 domínios externos, 1 transmembrânico, juntos com o alfa 3 ligam as moléculas à membrana e a uma cauda citoplasmática
Gene no cromossomo 15
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Estrutura MHC II
MHC II são heterodímeros constituídos de duas cadeias alfa e duas beta, ambas codificadas por genes do cluster MHC. 
Ambas as cadeias apresentam dois domínios extracelulares e uma cauda citoplasmática
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Estrutura MHC III
As proteínas codificadas pelo MHC III não são receptores de membrana e não estão envolvidos na apresentação de antígenos 
Foi proposto que as alterações das proteínas do MHC III estão envolvidas em doenças auto-imunes.
As proteínas do MHC III têm funções e sequências diferentes: algumas delas são proteínas do complemento, outras são enzimas (i.e. 21- hidrolase), citocinas inflamatórias, fator de necrose tumoral e proteínas heat hock.
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Genes MHC I e MHC II
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Locus MHC
421 loci, 252 deles são classificaods como genes expressos
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Localização das proteínas do MHC
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PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DO LOCUS DO MHC
MULTIGÊNICO: muitos genes codificadores de diferentes moléculas classes I e II, cada uma com diferentes especificidades por vários peptídeos. 
POLIMORFISMOS ALÉLICOS: um grande número de alelos estão presentes em cada gene. 
CODOMINANTE: produtos de ambos os alelos de cada gene são produzidos.
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A região classe III é rica em genes (um gene a cada 15 kb) e incluem genes de fatores do complemento (C2, C4 e fator B), a proteína heat shock HSP70 e os genes de TNF-alfa e beta
Existem três produtos polimórficos de genes classe I (definido em humanos como HLA-A, HLA-B e HLA-C) envolvidos na apresentação de antígenos para as células T citotóxicas. Entre os outro genes classe I existem alguns pseudo-genes, contudo também são funcionais. 
A função desses outros genes necessita ser investigada. Eles são menos polimórficos que os
genes A, B e C, e dois são expressos de forma tecido-específica. Em ratos, no mínimo um gene está envolvido na apresentação de peptídeos bacterianos formil-metionil para as células do sistema imune.
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	Existem três produtos polimórficos de genes classe II (HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP) e muitos pseudogenes classe II (por exemplo os genes DPA2 e DPB2)
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A base molecular dos polimrfismos gênicos classes I e II consiste na substituição de aminoácidos e no fato de que a maioria dos alelos estão presentes na população em frequências significantes. Isto argumenta contra mutações neutras e sugere seleção sobredominante (vantagem do heterozigoto) ou seleção dependente da frequência.
A sugestão feita por H Zinkernagel e P Doherty, que diz que o polimorfismorifsmo é mantido por vírus, é plausível. Recombinação dentro do locus ocorrem em sítios determinados.
Isto lida com o desequilibrio do linkage (i.e. A ocorrência de alelos de dois genes juntos em uma frequência maior que a frequência esperada de um único alelo; os loci são, portanto, classificados como em desequelíbrio de linkage )
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Polimorfismos alélicos do MHC em cada gene: possibilidade de recombinação
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Doença Celíaca
Doença celíaca é uma intolerância hereditária ao glúten, uma proteína encontrada no trigo e em menor escala, na cevada, no centeio e na aveia. Enquanto a intolerância ao glúten é permanente, os sintomas podem ser aliviados evitando esta proteína na dieta. A inflamação ocorre quando a gliadina, um peptídeo derivado do glúten.Esta inflamação causa danos aos tecidos das mucosas do intestino pequeno, especialmente nas vilosidades que absorvem nutrientes, resultando em uma má absorção dos nutrientes.
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A Doença Celíaca afeta até uma pessoa em 300 na Itália e no sudoeste da Irlanda, mas é extremamente raro na África, Japão e China ( Not et al., 1988). De acordo com um estudo nos EUA, em 2003, existe uma chance de 1 em cada 133 pessoas, sem fatores de risco ou histórico familiar, de ter a doença celíaca. Adicionalmente, esse risco aumenta para 1 em cada 22 se a pessoa tem um parente de primeiro grau com doença celíaca e para 1 em cada 39 se o parente for de segundo grau (Fasano, 2002). Em torno de 60.000 americanos são diagnosticados com doença celíaca anualmente e um total de 2 milhões têm a doença, tornando-a possivelmente a doença genética mais comum nos Estados Unidos(Westerberg, et al., 2006). A doença celíaca pode ocorrer em qualquer idade e mulheres são mais comumente afetadas que os homens. Das mulheres durante os anos férteis, a relação com os homens é de quase 3 para 1 (Feighery et al., 1998).
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Fatores de risco genéticos
A doença celíaca está fortemente associada ao leucócito antigênico humano (HLA) haplótipos DQ2 e DQ8. Os genes HLA fazem parte do complexo de histocompatibilidade principal (MHC)
A função das moléculas do MHC é ligar-se a fragmentos protéicos derivados dos patógenos e apresentá-los na superfície celular para reconhecimento pelas células T. Muitas proteínas envolvidas no processamento e apresentação do antígeno são codificadas por genes dentro do MHC (Janeway, 2005).
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Os sintomas da doença celíaca são causados por um peptídeo rico em glutamina e prolina encontrado no glúten, iniciando a resposta inflamatória ao ligar-se aos haplótipos HLA.
A associação primária do HLA, na maioria dos pacientes com doença celíaca, é com DQ2 (DQA*05/DQB1*02) e uma minoria com DQ8 (DQA1*03/DQB1*0302). Aproximadamente 97% dos indivíduos com doença celíaca possuem HLA-D2Q ou HLA-DQ8, em comparação aos 40% da população geral (NIH, 2006).
A associação do HLA em doença celíaca pode ser explicada por uma maior habilidade do DQ2 de ligar-se a um grande repertório de peptídeos ricos em prolina do glúten, que sobrevivem à digestão gastrointestinal e são deaminadas pela trasglutaminase dos tecidos.
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A doença celíaca é diagnosticada em aproximadamente 10% dos parentes de primeiro grau de um indivíduo com esta doença (Logan, 1992). Embora os fatores hereditários desempenhem um papel significante, eles sozinhos não explicam o desenvolvimento da doença, já que ela é encontrada em apenas 60 – 70% dos gêmeos idênticos. Todas as pessoas com HLA DQ2 e DQ8 não desenvolvem a doença, mas outros sem esses alelos podem desenvolver a doença celíaca, evidenciando que muitos genes estão envolvidos. Fatores adicionais, como hormônios e agentes infecciosos também podem estar envolvidos na ligação do glúten com reações inflamatórias crônicas no intestino de pessoas predispostas geneticamente (Fasano,1996).
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Loci dos anticorpos, receptores de células T e MHC
De acordo com a teoria da linha germinativa, cada anticorpo é codificado por um gene herdado, não sendo modificado durante o desenvolvimento somático e por isso, precisa haver um grande número de genes codificadores de anticorpos.
De acordo com a teoria somática existem apenas um pequeno número de genes codificadores de anticorpos, mas apresentando bastante diversidade nas células somáticas devido a mutações e/ou recombinações.
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Atualmente, é conhecido o número de segmentos de genes codificadores de anticorpos em humanos. Sabe-se detalhadamente como estes segmentos são somaticamente modificados por recombinação e mutação e qual é a contribuição desses genes e processos somáticos para a especificidade e afinidade das respostas dos anticorpos.
Sabe-se também que certas estratégias utilizam tanto os genes codificadores de anticorpos, quanto os que codificam os receptores de células T (recombinação gênica), outras utilizam os genes codificadores de anticorpos mas não os de receptores de células T (hipermodulação gênica) e que a estratégia fundamentada na habilidade das proteínas do MHC de interagirem com diferentes antígenos é o polimorfismo gênico. Desse modo, a genética do sistema imune tem sido revelada nesses últimos anos. 
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Evidências de recombinações somáticas (rearranjos) dos anticorpos e os genes TCR
A hipótese que os genes dos anticorpos resultantes da “fusão” de dois genes diferentes (um gene V e um gene C) foi postulada em 1965 por W Dreyer e J Bennett. Esta hipótese propõe uma explicação sobre os dados da sequência da proteína que se acumularem ao longo do tempo e sobre as observações sorológicas e genéticas, indicando que o mesmo idiotipo pode ser encontrado em associação em diferentes isotipos. 
A “dois genes – um polipeptídeo”, hipótese comprovada nos anos 70 por N Hozumi, que demonstrou que as sondas para as cadeias leves C ou C+V do mRNA hibridizam com diferentes fragmentos de restrição de DNA genômico embrionário mas hibridizam com o mesmo fragmento de restrição de DNA de mielomas. Este esperimento confirmou que um processo de rearranjo somático ocorreu na célula produtora de anticorpos. 
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A localização cromossômica do anticorpo, receptor de células T e MHC em humanos
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Loci da cadeia pesada e das cadeias leves “k” e “l” do anticorpo
O locus humano VH está localizado no fim telomérico (i.e dentro de poucas bases teloméricas) no braço longo do cromossomo 14 (14q32-33).
Esta posição foi confirmada por uma variedade de técnicas de hibridização e citogenéticas.
O locus compreende os segmentos 123-129 V, esta variação existe devido a polimorfismos de inserção. O locus mede > 1Mb
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O locus humano Vk está localizado perto do centrômero no braço curto do cromossomo 2 (2p12). Ele compreende 76 segmentos Vk, 5 segmentos Jk e um único segmento Ck. Esse locus mede ~ 1.8 Mb e uma grande porção (440 kb) é duplicado. 
A duplicação é um evento recente, pois mais de 96% da sequência é idêntica à original. 40 genes localizam-se na metade proximal e 36 na metade distal (duplicada). 34 genes são funcionais, 16 possuem defeitos menores (um ou dois nucleotídeos variam) e 25 são claramente pseudogenes. 
Seis genes duplicados possuem o mesmo produto transcricional e dois outros apresentam o mesmo produtom de tradução. A orientação transcricional difere entre os grupos
gênicos. Aproximadamente metade dos genes apresenta rearranjos por um mecanismo de deleção e a outra metade, por um mecanismo envolvendo o tamanho do DNA (Mb).
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Os loci dos receptores de Células T (TCR) a/d,b e g
Embora existam quatro tipos de cadeias de receptores de células T (a, b, g e d), e existem apenas três loci porque o locus “d” é interdispersado em um locus “a” .
O locus humano a-d é complexo e incluem 54 segmentos do gene Va, dos quais 45 são funcionais. O locus também contém um notável número (61) de segmentos Ja, dos quais a maioria é funcional.O locus humano “b” foi o primeiro a ser descoberto ao ser totalmente mapeado e sequenciado.
Esse locus mede ~0.6 Mb e contém 62-65 genes V, dos quais 39-41 são funcionais. O locus humano “g’ é muito mais simples, medindo ~ 0.1 Mb e contendos 12-15 genes V, dos quais 4 -6 são funcionais.
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Base Genética da Diversidade dos Anticorpos
Os supergenes da cadeia pesada das Imunoglobulinas são construídos a partir de cada um dos numeros segmentos V, D,J e C. Os segmentos V,D e J combinam-se por rearranjos do DNA, e a transcrição produz uma molécula de RNA que é processada para formar um mRNA traduzível. Outra família de genes dão origem às cadeias leves.
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Como resultado desses rearranjos do DNA, existem milhões de possíveis anticorpos. Rearranjos imprecisos de DNA, mutações e adições aleatórias de bases no fim do DNA contribuem para uma maior diveridade.
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Mudança de classe após produção inicial de imunoglobulina resulta em anticorpos com a mesma especificidade ao antígeno, mas com uma função diferente. Isso é realizado por cortes e rearranjos dos genes que codificam a região constante.
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Desordens do Sistema Imune
Alergias resultam de uma reação exagerada do sistema imune a um antígeno.
Doenças autoimunes resultam de uma falha no reconhecimento das próprias células do indivíduo, com o aparecimento de células T e B que vão atacar as células do próprio corpo.
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Desordens imunodeficientes resultam de falhas de uma ou outra parte do sistema imune. AIDS é uma imunodeficiência decorrente da depleção de células TH do corpo devido à infecção pelo HIV. Essas depleções enfraquecem e eventualmente destróem o sistema imune, deixando o hospedeiro sem defesa contra infecções “oportunistas”.
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O HIV insere uma cópia do seu genoma em um cromossomo de um macrófago ou de uma célula TH, podendo permanecer latente por anos. Quando o genoma viral é transcrito e traduzido, novos vírus são formados. Normalmente, as drogas mais eficazes para o tratamento de infecções pelo HIV, são direcionadas contra a transcriptase reversa e protease. Alguns tratamentos podem promover uma redução dramática nos níveis de HIV, mas não existem ainda vacinas que evitem a infecção. A única estratégia disponível para a população é evitar comportamentos de risco.
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