1-transcricao

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transcrição
Gene
Definição Molecular
Seqüência de DNA que codifica uma proteína
Não acredito que vocês 
estejam satisfeitos com esta 
definição!!!
Alguns genomas são constituídos de RNA e não de 
DNA.
Alguns genes produzem RNA (tRNA, RNAi e rRNA) e 
não proteínas.
Algumas regiões não-codantes são importantes para 
produção de RNA e proteínas.
Gene
Falhas da definição molecular
Toda seqüência de nucleotídeos necessária para
a síntese de uma cadeia polipeptídica ou de RNA
funcionais.
Gene
Definição molecular atual
Regulatórias
Sítios de ligação da RNA polimerase
Sítios de ligação dos fatores transcricionais
Íntrons (RNAi)
Sítios de Poliadenilação - poliA
Gene
Regiões não-codantes
Promotor E1 I1 E2 I2 E3 PoliA
Interruptor do gene
Fatores transcricionais
RNA polimerase
Seqüência codante
ATG
Seqüência não-codante
Splicing
Cauda de poliadenina
Gene
Dogma Central da Biologia
5´
5´
3´
3´
DNA
Replicação do DNA
Reparo de DNA
Recombinação genética
5´ 3´
RNA
Síntese de RNA
Transcrição
Síntese protéica
Tradução
ProteínaH2N COOH
 O Dogma Central da Biologia esta correto?
Estrutura química do RNA
A Unidade de transcrição
- Como a RNA pol encontra os promotores no DNA? 
- Como as proteínas regulatórias interagem com o RNA pol para ativar ou reprimir a 
replicação? 
Sínteses de RNA: variável ( estado fisiológico)
A transcrição é o primeiro e principal nível da expressão gênica !.
Sínteses de DNA: precisa, uniforme e invariável
 A síntesis de RNA começa numa "bolha de transcrição”
12-20 pb, híbrido 3-9 bases 
 Diferentes RNApol diferentes Tamanhos mas estruturas similares.
• Fenda: 25 A, 16pb ( bact.)
25pb ( lev)
A cadeia de RNA é sintetizada 5‟- 3‟
Propriedades da RNApol:
 Desenrolar o DNA, 
 Manter as fitas separadas 
 Segurar o produto de RNA, 
 Catalisar a adição de ribionucleotídeos à cadeia de RNA nascente 
 Ajustar-se as dificuldades na progressão clivando o RNA e reiniciando a sua sínteses
( genes GreA e B E.coli; TFIIS eucariotes)
Modelo da “lagarta mede-palmo”, 
Índice de erro: 10-5
* Nenhum mecanismo de correção
Etapas da Transcrição (procariotos)
A. Reconhecimento:
 Reconhecimento do DNA na região promotora pela RNA polimerase (complexo fechado )
 Separação das fitas de DNA (complexo aberto) a "bolhas de transcrição“
 A seqüência de DNA necessária para ligação da enzima é definida pelo promotor
B- Iniciação:
Sínteses dos primeiros nucleotídeos, a RNApol permanece ligada no Promotor
Eventos abortivos sínteses de curtos segmentos de <9 bases.
A fase de iniciação termina quando a enzima estende com sucesso a cadeia e escapa do promotor.
C- Elongação:
 Sínteses da fita de RNA, os nucleotídeos são ligados covalentemente ao 3' do RNA da cadeia
 Híbrido de RNA-DNA de 12 pb. superenovelamento positivo a frente e negativos atrás da bolha
 A cada a ribonucleotideo acrescentado acontecem as seguintes reações:
1- Um nucleotídeo do RNA deve ser liberado da bolha de transcrição
2- Um par de bases a frente deve ser desnaturada
3- Um par de bases atrás deve ser re-naturadas.
4- A RNA pol deve se mover um nucleotideo a frente
D- Terminação:
 Reconhecimento da seqüência de terminação
 A bolha colapsa; híbrido RNA-DNA é desfeito e o DNA é reformado no seu estado de dúplex.
A transcrição gera superenrolamento
Os diferentes estágios da transcrição
A RNApol consiste de várias subunidades
Velocidade transcrição: ~ 40 nt/seg RNA pol bacteriana,
- seq. ricas em G-C mais lenta
- Seq. Repetidas-invert. Pausa 10‟‟-30‟‟ prot. NusA
Velocidade de tradução: 15 aa/seg,
Velocidade da replicação: 800 bp/seg.
O fator controla a ligação ao DNA
 Três complexos diferentes em forma e tamanho são identificados 
durante a transcrição.
A reação holoenzima-promotor gera o “complexo binário fechado”, o DNA permanece duplex.
.
Formação de um “complexo aberto” pela desnaturação da região do DNA “ligação apertada”.
Incorporação dos 2 primeiros nucleotídeos “complexo ternário”. Mais 9nt são adicionados sem
qualquer movimento da enzima.
Probabilidade de que a enzima libere a cadeia, “iniciação abortiva” .
A enzima libera o fator transição para o “complexo ternário de alongamento”.
A RNApol se liga a uma das fitas do DNA
Como a RNApol esta distribuída na célula e encontra os promotores ? 
• Existe um excesso de núcleos da enzima como “complexos fechados frouxos”,forman-se 
rapidamente e dissociam-se deles lentamente. Poucos núcleos enzimáticos livres.
• Há fatores suficientes para aproximadamente um terço das polimerases presentes como holoenzimas.
• Aproximadamente metade das RNApol consiste de núcleos engajados na transcrição.
O dilema de reconciliar seus requerimentos da iniciação e da elongação!
 O fator esta envolvido apenas com a iniciação e 
é liberado quando a e sínteses é iniciada exitosamente.
* Fator é liberado em conseqüência da superação 
da iniciação abortiva 
ou
É a liberação do fator sigma
determina o final da iniciação abortiva?
 A liberação do fator sigma deixa o núcleo da enzima 
no DNA, assim no complexo ternário.
 O fator sigma reduz a estabilidade dos complexos 
frouxos, permitindo que o processo ocorra muito 
mais rapidamente, levando irreversivelmente para 
a formação de complexos abertos
 A enzima libera o fator sigma voltando a ter 
apenas uma afinidade geral pelo DNA
 associação reversível do fator 
 O que determina a capacidade de ligação especifica da holoenzima a 
promotores . 
O fator sigma possui domínios que reconhecem promotores.
O fator sigma é capaz de ligar-se ao DNA, só quando forma um complexo com a enzima 
“ligação apertada”.
O fator contata o DNA na região a montante do sitio de iniciação, após sofrer uma mudança 
no extremo amino como conseqüência da interação com o núcleo da enzima. 
O reconhecimento do promotor depende de seqüências consensuais
1- O primeiro nucleotídeo a ser transcrito (+1) geralmente é uma purina (A ou G) 
pode coincidir com a base central da seqüência CAT.
2- Dois hexameros região –10 ou TATA box (TATAAT) e na região –35 (TTGACA).
3- Estas regiões são separadas por 17 1 nucleotídeos.
Freqüência de ocorrência das bases nas 
seqüências conservadas
T80 A95 T45 A60 A50 T96
T82 T84 G78 A65 C54 A45
•Seqüência –35 sinal de reconhecimento para a RNApol (domínio de reconhecimento)
•Sequencia –10 complexo fechado passa para uma aberto (domínio de desenrolamento)
A substituição de fatores sigma pode controlar a iniciação
fator 32: expressão induzida pelo acumulo de proteínas desenoveladas por 
aumento de temperatura codificado pelo gene rpoH.
fator E: responde a temperaturas extremas, acumulo de proteínas desenovela
das no espaço peri-plasmático ou memb. externa.
fator 54: expresso quando falta nitrogênio.
fator F: leva a transcrição de genes envolvidos com quimiotaxia e estrutura 
flagelar. 
Duas curtas regiões do fator (2.2 e 4.2) que possuem estrutura de -hélice 
envolvidas no reconhecimento das seq. –10 e -35.
O fator 70 faz contato com bases da fita codante.
Nas estruturas helicoidais aminoácidos separados por 3-4 posições são usados 
para contatar nucleotídeos adjacentes nas seqüências de DNA
RNA Polimerases de Eucariótos
3 RNA polimerases que podem ser diferenciadas pela sensibilidade à -
amanitina. Cada uma transcreve um tipo de RNA. 
Enzima Localização Produto Atividade 
Relativa
Sensibilidade à 
-amanitina
RNA pol I Nucléolo rRNA 50-70% Insensível
RNA pol II Nucleoplasma mRNA 20-40% Sensível
RNA pol
III
Nucleoplasma tRNA; rRNA 5S e peq. 
RNAs nucleares 
~10% Pouco sensível
RNApol II vs RNApol bact.
a) A RNApol bact. maiso fator inicia a transcrição “in vitro” sem adicionais proteínas.
RNApol euct. precisa um grande set de proteínas “fatores gerais de transcrição”(TFIIs).
“TFIIs funções equivalentes ao fator ”.
b) Iniciação em eucariotos deve lidar com o empacotamento do DNA em nucleossomos e 
organização da cromatina, mas a polimerase bacteriana não.
RNApol euct. 12 subindades ~500.000 daltons
RNApol bact. 5 subunidades
Zn
Mg
RNApol II: repeats Tyr-Ser*-Thr*-Ser*-Pro-Ser (26 lev. 50 mam.) 
Iniciação da transcrição de genes eucariotos pela RNApol II 
A seqüência TATA não é a única seqüência que sinaliza o inicio da transcrição
mais é mais importante
 Promotores para RNApol II sem TATA box tem uma forte seqüência INR.
 A maioria das seqüências estão localizadas “upstream”, poucas downstrem ex.DPE 
O “binding” da TBP causa uma grande distorção 
do DNA na região do TATA Box “sinalização”
A transcrição em eucariotes dirigida pela RNApol II
* TFIID contata por médio do TBP a seq. TATA
box ( 25 nt. A-T).
* TFIIB e TFIIA interagem com TFIID.
* TFIIE e TFIIH ( helicase) acesso da RNApol II
ao start point.
 Fosforilação da calda da RNApol II TFIIH ( kinase)
A RNApol II requer também ativadores, mediadores e modificadores da cromatina. 
A-“ativadores da transcrição” se ligam a seqüências especificas e ajudam a atrair a RNApol II
e fatores para o “strat point”, (vencer a dificuldade oferecida pelo empacotamento do DNA)
B- Presença do “complexo mediador” permite que as proteínas ativadoras se comuniquem com a 
RNAPol II e com os fatores gerais de transcrição.
C- Finalmente, a iniciação da transcrição requer que o recrutamento de enzimas que modificam a 
cromatina (complexo de remodelação da cromatina e acetilases de histonas).
* A ordem de ensamble provavelmente é diferente para diferentes genes
A terminação
 Ocorre quando a RNA pol encontra uma região de terminação. A cadeia nascente é
liberada e o complexo se desfaz.
Terminação vs. Iniicação
Ruptura das pontes de hidrogênio (DNA-DNA e DNA-RNA).
Requerimento de proteínas que interajam com o core da enzima.
Requerimento de ligações fracas (A-T)
 Dois modos de terminação.
 Terminadores intrínsecos não requerem fatores.
 Terminadores Ro dependentes 
Terminadores intrínsecos:
• Um grampo na estrutura secundária (pausa~1 min/
desaceleração,longitude variada, seqüência rica G-C).
• Uma seqüência de aproximadamente 6 uridinas na
base do grampo, as vezes, interrompida ( dissociação do híbrido)
Terminação rô dependente?
Reconhece uma seq. De 50-90 bases “upstream” do sítio de terminação
A RNA polimerase transcreve o DNA
Rô (hexâmero 275KD) ATPase, liga-se ao sítio de 
reconhecimento no RNA, ativo a uma conc.10% da 
RNApol
Rô move-se ao longo do RNA seguindo a RNApol
A RNApol faz uma pausa no terminador e é 
alcançada por Rô
Mecanismo: Rô desenrola o híbrido RNA-DNA na bolha de transcrição ( hidrolises de ATP) ou 
interação com a RNApol;
A RNA polimerase, Rô e o RNA são liberados
Ação do fator rô
Ligação entre tradução e transcrição pelo fator rô
 rRNAs transcritos pela RNApol I são transcritos como unidades e são extensivamente 
processados. A terminação acontece >1000 pb “downstream” do extremo 3' por
clivagem numa região de 18 bp por um fator.
 Em transcritos da RNA pol III a terminação acontece na segunda “U” de uma seqüência 
de 4 presentes dentro de uma seq.rica em GC. A seqüência de uridinas não é suficiente
já que seqüências de 4 bases também estão presentes dentro do transcrito, pelo que 
o contexto deve ser importante.
 Na RNA pol II similares sítios de terminação, significado não é claro, algumas terminações
acontecem a >1000 pb “downstream” do extremo 3', em outros terminadores específicos
múltiplos sítios localizados em regiões mais distantes.
Terminação em Eucariotos
As mesmas estruturas utilizadas pela RNApol bacteriana na terminação
intrínseca também ocorrem em eucariotos.
Extremos 3' são gerados por terminação e reações de clivagem.
Como a reação de terminação acontece? 
 A terminação parece ser função da própria enzima, mas não está claro como reconhece um 
tão curto sinal.
* Seq. AAUAAA 11-30 nt “upstrem” do sítio de poliadenilação.
Antiterminação
• Mecanismo controla a capacidade da enzima de ler genes posicionados alem do terminador.
• Usado por circuitos regulatórios de fagos e bactérias.
Aniterminação vs Terminação
Interrupção da expressão de genes iniciais 
Reconhecimento do mesmo ou diferentes promotores.
Síntese de um novo fator ou nova RNApol
•Antiterminação no fago 
Sitio nutL: perto do promotor 
Sitio nutR: perto do terminador 
Proteínas pN: interage com o núcleo ( ) na elongação
Proteina pQ: interagem a holoenzima na iniciação.
O sitio nut: boxA e boxB
nusA: aumenta a eficiência da terminação,
aumentando a pausa do RNApol. 
nusB e S10: formam um dímero e se ligam ao 
RNA na seqüência da tipo boxA.
nusG: ensamble de todos os fatores dentro
de um complexo com o RNApol
•NusA se liga ao core da enzima mas não a holoenzima, o fator desplaza a nusA,reconstituindo a
holoenzima 2 ' .
• NusA é suficiente para que a proteína pN evite a terminação em terminadores intrínsecos, mas outros
fatores são requeridos nos terminadores rô dependentes.
* RNApol existiria em 2 formas alternativas, para iniciar ( 2 ' ) e uma para terminar ( 2 „nusA).
•A ligação da proteína pN muda a conformação do terminador, mas não pode se ligar a RNApol em
ausência de NusA.
• pN se liga ao complexo de transcrição depois que este passe pelo boxB, mas também estabelece uma
ligação proteína-proteína com o RNApol.
Como ocorre a anti-terminação