NMP e termotolerantes M.D.A

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS - UFG
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BIANCA MARIA MARTINS CAETANO
ISABELA FERREIRA MORENO
MICHELLE BELTRAMINI RAMOS
RELATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS:
NMP de Coliformes Totais, Termotolerantes e E. coli 
GOIÂNIA
2017
INTRODUÇÃO
Coliformes totais é a denominação dada ao grupo de bactérias Gram negativas na forma de bastonetes, não esporogênicas, aeróbios ou aeróbios facultativos, que realizam a fermentação da lactose em período de 24 à 48h em temperatura de 35ºC. Dentre estas, há o subgrupo de bactérias denominadas coliformes fecais, capazes de realizar a fermentação da lactose num período de 24h a temperatura de 44,5ºC a 45,5ºC. Devido a sua capacidade de realizar a fermentação nestas temperaturas, também são chamadas de termotolerantes.
Estas bactérias vivem no trato intestinal de animais de sangue quente, incluso o homem. Por serem elimi/nadas em grande quantidade nas fezes, o valor de coliformes fecais serve como indicador de qualidade da água ou de alimentos, pois sinaliza o quanto, ou se houve, contato com fezes humanas ou de algum outro animal. Estas bactérias por si só não representam grande risco na maioria das vezes, mas indicam a presença de alimento de má qualidade que pode conter agentes nocivos.
Os coliformes termotolerantes vivem em simbiose com o homem, agindo na degradação da lactose no intestino e gerando dióxido de carbono, entre outros gases que compõem o flato. Só irão apresentar risco à saúde quando presentes em outras regiões do corpo. Cada organismo já apresenta resistência necessária para a convivência com seus coliformes fecais, podendo apenas ser intoxicado por coliformes fecais de estirpe diferente, estirpe essa determinada principalmente pelo fator geográfico.
A técnica utilizada se divide em três etapas, uma prova presuntiva para coliformes totais, seguida de uma prova confirmativa para coliformes totais e outra confirmativa para coliformes termotolerantes e E. coli. A prova presuntiva é realizada em caldo de lauril sulfato de sódio, contendo lactose. A presença do surfactante inibe o crescimento da membrana citoplasmática de bactérias Gram positivas e a presença da lactose viabiliza a fermentação, que libera gás carbônico, evidente no tubo de Durham.
Os tubos que apresentarem turvação e formação gasosa são inoculados em caldo verde brilhante bile lactose 2% e incubados à 36ºC ± 1ºC. A confirmação vem com nova formação de dióxido de carbono. A seletividade do meio vem da presença de bile bovina e de um corante derivado do trifenilmetano, que inibe as bactérias Gram positivas.
A prova confirmativa para coliformes termotolerantes é realizada com a inoculação dos tubos positivos da prova presuntiva em caldo EC e incubação a cerca de 45ºC. Este caldo possui uma mistura de fosfatos, que mantém o pH do meio em valor adequado. A seletividade do meio se deve aos sais biliares, que inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos. Se houve formação gasosa nestas condições, há a confirmação de coliformes termotolerantes.
OBJETIVO
Determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e coliformes termotolerantes em amostra de frango cozido. 
REAGENTES E MATERIAIS
- Vidrarias e demais insumos básicos obrigatórios em laboratório de microbiologia de alimentos (alça, pipeta eletrônica, tubos de ensaio, tubos de Durham, placas de Petri....).
- Caldo Lauril sulfato de sódio concentração simples;
- Caldo verde brilhante bile lactose (VBBL) 2%;
- Caldo EC: Seletivo para E.Coli
- Solução salina peptonada 0,1%.
PROCEDIMENTOS
Foram pesados 25g de frango cozido e adicionados em 225mL de água salina peptonada 0,1% e homogeneizados por cerca de 1 minuto em “BagMixer”, obtendo-se a diluição 10-1 .
Prova presuntiva: Inocular 1mL da diluição inicial em uma série de 3 tubos contendo caldo de lauril sulfato de sódio. Obter a solução 10-2 por diluição em água peptonada 0,1% e, da mesma forma, obter a solução 10-3 a partir desta. Estas duas diluições devem ser inoculadas em séries de três tubos de ensaio contendo caldo de lauril sulfato de sódio, uma série para cada. Os tubos deverão ser incubados a 36ºC ± 1ºC por um período de 24 à 48h.
Prova confirmativa para coliformes totais: Repicar cada tubo de resultado positivo para tubo com caldo verde brilhante bile 2% lactose e incubar à 36ºC ± 1ºC por um período de 24 à 48h.
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: Repicar cada tubo de resultado positivo para tubo com caldo EC e incubar à 45ºC por 24 à 48h.
Forma de leitura: Após 24h podem ser realizadas as leituras. Os positivos serão validados e os negativos ficarão incubados por mais 24h.
Através de tabela, chega-se ao valor do Número Mais Provável por grama.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos no teste estão descritos na tabela abaixo:
	Diluição
	T. Presuntivo
	Coliformes Totais
	Coliformes Termotolerantes
	E. Coli
	10-1
	1 positivo (1/3)
	1 positivo (1/3)
	Ausentes (0/3)
	1 positivo (1/3)
	10-2
	3 positivos (3/3)
	2 positivos (2/3)
	2 positivos (2/3)
	Ausentes (0/3)
	10-3
	3 positivos (3/3)
	1 positivo (1/3)
	3 positivos (3/3)
	3 positivos (3/3)
Através de tabela de NMP adequada, chegou-se ao valor de 1,5 x 102NMP/g de coliformes totais; 1,6 x 102NMP/g de coliformes termotolerantes, e 1,5 x 102NMP/g de E.coli, para a amostra de frango cozido analisado. A legislação vigente pelo Ministério da Saúde impõem um valor máximo de 1x105NMP/g para coliformes termotolerantes, logo, o frango analisado está fora dos padrões para consumo, neste aspecto.
Concluiu-se sobre a técnica a importância relativa ao conhecimento das estruturas e mecanismos metabólicos das bactérias, como a fermentação da lactose, que permite a utilização de meios seletivos, permitindo a análise dos alimentos no critério microbiológico.
BIBLIOGRAFIA
COLIMETRIA – Técnica do Número Mais Provável. Disponível em: http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/colimetria.htm. Acesso: 28/09/2017
DOWNES, F. P., ITO, H. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4. ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. 676p.
MICROBIOLOGIA ALIMENTAR - Aulas Práticas - Coleção Ciências Rurais- Departamento de Tecnologia e Ciência dos alimentos- UFSM - setembro 2009.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 1997. 296p.