Relatório 1 - Coliformes totais e fecais

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INTRODUÇÃO
A presença de microrganismos em alimentos não significa necessariamente um risco para o consumidor ou uma qualidade inferior destes produtos. Diferentes alimentos podem conter bolores, leveduras, bactérias e outros microrganismos, e muitos alimentos tornam-se potencialmente perigosos ao consumidor somente quando os princípios de sanitização e higiene são violados. Se o alimento tem estado sujeito a condições que poderiam permitir a entrada e/ou crescimento de agentes infecciosos ou toxigênicos, pode se tornar um veículo de transmissão de doenças (ICMSF, 1984).
A prática de analisar os alimentos e a presença de bactérias, cuja esta indica a possibilidade da presença de bactérias produtoras de toxinfecções alimentares. Estas bactérias são denominadas microrganismos indicadores e são geralmente considerados como sendo de grande significância quando a avaliação da segurança e qualidade microbiológicas de alimentos (HAYES, 1995).
Segundo Franco (2003), microrganismos indicadores incluem espécies que quando presentes em um alimento ou na água podem indicar contaminação de origem fecal, possibilidade da presença de patógenos ou deterioração do alimento, bem como indicar falhas nas condições sanitárias, que podem ocorrer desde o processamento até o armazenamento. Afirma ainda que tais microrganismos indicadores são bastantes empregados como avaliadores da qualidade microbiológica da água, já que são facilmente detectáveis e sua presença pode indicar contaminação.
Como exemplos de microrganismos indicadores segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods), podem ser agrupados em:
1. Microrganismos que não oferecem um risco direto à saúde: contagem padrão de mesófilos, contagem de psicrotróficos e termófilos, contagem de bolores e leveduras.
2. Microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto à saúde: coliformes totais, coliformes fecais, enterococos, enterobactérias totais, Escherichia coli.
De acordo com Silva et al., (2000); Franco; Landgraf, (2003) coliformes termotolerantes, são as bactérias pertencentes ao grupo dos coliformes totais que apresentam a capacidade de fermentar lactose e produzir gás, quando incubadas à temperatura de 44,5-45,5ºC. Nessas condições, ao redor de 90% das culturas de Escherichia coli são positivas, enquanto entre os demais gêneros, apenas algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella mantêm essa característica.
Atualmente, para avaliar a potabilidade da água quanto suas características biológicas, podemos fazer uso de inúmeras técnicas, procurando detectar a presença de organismos patogênicos. O parâmetro mais empregado para tal é o número mais provável de coliformes, que é um importante indicador de comprovação do contato desta água com os microrganismos presentes nas fezes humanas, de forma que sua detecção seja uma boa indicação de que resíduos humanos estão sendo despejados na água. (TORTORA, 2002).
A técnica do Número Mais Provável, também chamada técnica dos tubos múltiplos, é outra maneira bastante utilizada pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes totais, coliformes fecais, E. coli e Staphylococcus aureus (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
Segundo Peeler et al. (1992) o NMP é estimado de respostas onde resultados são relatados como positivo ou negativo em uma ou mais diluições decimais da amostra. Por exemplo, cinco tubos de meio para cada uma de três diluições são inoculados e incubados, e produção de gás é observada para cada tubo. Diferentemente da contagem de aeróbios em placas, o NMP não fornece uma medida direta da contagem bacteriana.
O número de microrganismos na amostra original é determinado pelo uso de tabelas de NMP, como a da ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas, 1991). O método é estatístico na natureza e os resultados de NMP são geralmente maiores que os resultados da contagem padrão em placas (JAY, 1998).
Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais) (SIQUEIRA, 1995).
Muitos métodos têm sido utilizados para detectar coliformes. A fermentação da lactose em um meio é o primeiro requerimento para um microrganismo ser considerado um coliforme. O procedimento sugerido pela Food and Drug Administration consiste do uso do método NMP pela inoculação de tubos com caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), sendo a técnica mais utilizada para contagem de bactérias do grupo coliformes. A avaliação dos resultados dá-se via utilização da tabela de NMP com intervalo de confiança ao nível de 95% de probabilidade, para as diversas combinações de tubos positivos nas séries de três ou cinco tubos (BANWART, 1989; SILVA et al. 1997).
Coliformes totais, coliformes fecais e E. coli são determinados por três passos sucessivos na metodologia determinativa (ICMSF, 1984).
Pertencem ao grupo de coliformes totais os gêneros bacterianos Escherichia, Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter, incluindo cerca de 20 espécies, dentre as quais encontram-se tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal de humanos e outros animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias não entéricas. Por isso, sua enumeração em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração de coliformes fecais ou E. coli (SILVA et al., 1997).
A principal razão para que sejam agrupados deve-se às suas muitas características comuns. São todos Gram negativos, não formadores de esporos, anaeróbios facultativos, resistentes a muitos agentes surfactantes e fermentam lactose produzindo ácido e gás em 48h a 32°C (leite) ou 35-37°C (RAY, 1996).
Teste presuntivo para coliformes totais é feito por um meio de cultura que permite um enriquecimento seletivo dos coliformes, recuperando células injuriadas. Crescimento com produção de gás no tubo de Durhan evidenciam um teste positivo (HAJDENWURCEL, 1998).
Teste confirmativo para coliformes totais feito por meio de cultura que apresenta sais biliares que inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos e a lactose é utilizada como substrato para produção de gás pelos coliformes. Crescimento com produção de gás no tubo de Durhan evidenciam um teste positivo (HAJDENWURCEL, 1998).
A definição de coliformes fecais é a mesma de coliformes totais, porém restringindo-se aos membros capazes de fermentar lactose com produção de gás em 24-48h a 44,5-45,5°C (SILVA et al. 1997; SIQUEIRA, 1995).
Nesta análise busca-se a determinação de coliformes de origem gastrintestinal, porém sabe-se que cepas de Enterobacter e Klebsiella incluídas neste grupo podem apresentar origem não fecal (água, solo e vegetais) (SILVA et al. 1997).
Dentre as bactérias de habitat reconhecidamente fecal, dentro do grupo dos coliformes fecais, a E. coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos membros não fecais. Todos os demais membros do grupo têm uma associação duvidosa com a contaminação fecal e E. coli, embora também possa ser introduzida nos alimentos a partir de fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o momento (SILVA et al. 1997).
Sua presença em alimentos crus é considerada um indicador de contaminação fecal, direta ou indireta. A contaminação fecal direta ocorre durante o processamento de matérias-primas de origem animal e devido à falta de higiene pessoal dos manipuladores. A contaminação indireta pode ocorrer através de águas poluídas e de esgoto. Em alimentos processados pelo calor sua presença é vista com grande preocupação (RAY, 1996).
O teste para coliformes fecais é feito com um meio de cultura seletivo para microrganismos Gram negativos em função da presença de sais biliares. A temperatura de incubação (44,5-45,5°C) permite evidenciar a presença de coliformes fecais, pois eles apresentam a capacidade de fermentação da lactose com produção de gás atemperaturas mais elevadas. A produção de gás ocorre nos tubos de fermentação (HAJDENWURCEL, 1998).
Diante das dificuldades para identificação de todos os microrganismos patogênicos na água e alimentos, dá-se preferência a técnicas que permitam a identificação de bactérias indicadoras, como os coliformes, cuja presença indica a possível existência de patógenos (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
OBJETIVO
Pesquisar a presença de coliformes totais e fecais em amostras de água e couve processada e avalia-la como própria ou impropria para consumo.
MATERIAL E MÉTODOS
Preparo dos meios de cultura
Foram utilizados os seguintes produtos na prática realizada:
Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); Caldo Verde brilhante Lactose Bile 2% (Caldo VB); Caldo E. coli (Caldo EC); Ágar TSA; Ágar EMB; Ágar VP/VM; Ágar citrato; Água peptonada; Nacl; Triptona.
A partir das proporções estabelecidas pelo fabricante, o soluto foi diluído em água destilada e levados ao bico de Bunsen, autoclavados à 121°C por 15 minutos.
ÁGUA: Para realizar a análise de coliformes totais e fecais em água foi coletada 100 mL de água do bebedouro com auxílio de um saco estéril, imediatamente após a chegada da amostra no laboratório foi adicionado 0,1 mL de tiossulfato de sódio 3% e homogeneizada a amostra.
Para a 1° etapa foi o meio de cultura empregado foi o Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), foram utilizados tubos contendo 10mL do meio de cultura e tubos de Duhan e autoclavados a 121°C por 15 minutos. Após resfriado o meio foi inoculado 10mL da amostra e levados a estufa por 24 a 48 horas na temperatura de 35°C. Os tubos considerados positivos passaram para a 2° etapa onde foram utilizados 10 tubos contendo 10mL do meio de cultura Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2% (Caldo VB) e tubos de Duhan e autoclavados a 121°C por 15 minutos. Após resfriado o meio foi inoculado uma alçada da amostra com o auxílio de uma alça de platina e levados a estufa por 24 a 48 horas na temperatura de 35°C. 
A 3° etapa foi realizada com os tubos considerados positivos do caldo VB e foram utilizados tubos contendo 10mL do meio de cultura caldo E. coli (Caldo EC) e tubos de Duhan e autoclavados a 121°C por 15 minutos. Após resfriado o meio foi inoculado 1 alçada da amostra com o auxílio da alça de platina e levados a banho maria por 24 horas na temperatura de 45°C. 
COUVE: No laboratório foi pesado 10 gramas de couve picada, adicionados 90mL do diluente (água peptonada 0,1% esterilizada) e homogeneizadas, obtendo-se assim a diluição 10-1. A partir da diluição 10-1 foram feitas diluições decimais seriadas, a diluição 10-2 foi obtida retirando-se 1mL da diluição 10-1 e adicionando-os a 9mL de água peptonada 0,1% em tubo estéril. Para a diluição 10-3 foi obtida retirando-se 1mL da diluição 10-2 e adicionando-os a 9mL de água peptonada 0,1% em tubo estéril.
Foram preparados tubos contendo o Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Duhan e levado a autoclave por 15 minutos a 121°C, após resfriado o meio foi pipetado 1mL da amostra 10-1, da mesma forma foi feita as amostras 10-2 e 10-3 em seguida os 9 tubos foram levados a estufa por 24-48 horas na temperatura de 35°C. Para a segunda etapa foram preparados tubos contendo o Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2% (Caldo VB) e tubos de Duhan e levado a autoclave por 15 minutos a 121°C, após resfriado o meio foram inoculados com o auxílio de uma alça de platina as amostras consideradas positivas, os tubos foram levados a estufa por 24-48 horas na temperatura de 35°C. Os tubos considerados positivos foram separados e foi preparado o Caldo E. coli (Caldo EC) com tubos de Duhan e levado a autoclave por 15 minutos a 121°C, após resfriado o meio foi inoculado com o auxílio da alça de platina uma alçada do tudo positivo para o caldo EC, e incubados em banho-maria por 24 horas na temperatura de 45°C. Os tubos que apresentaram crescimento (10-1 1 e 10-1 2) foram semeados em meio EMB pela técnica de esgotamento sendo transferida uma alçada das amostras positivas nos caldos EC para o meio. As placas contendo colônias características para E.coli foram semeadas uma estria simples em ágar TSA para a obtenção somente da colônia em questão para a realização das provas bioquímicas.
A colônia característica com o crescimento em TSA foi semeada nos meios de cultura: Indol, citrato, VP e VM. 
O indol foi preparado o meio pesando Triptona e NaCl e hidratando em bico de bulsen e autoclavado por 15 minutos a 121°C, após resfriado foi semeada 1 alçada da colônia no meio de cultura e levado a estufa por 48h a 37°C. 
Para o VM foi preparado o meio pesando o ágar VP/VM e semeada uma alçada da colônia e incubado por 5 dias a 37°C, VP semeada uma alçada da colônia e incubado por 48 horas a 37°C. Citrato foi semeado com o fio de platina uma colônia no meio e incubado por 48 horas a 37°C.
Resultado e Discussão
O teste presuntivo para detectar bactérias fermentadoras de lactose foi negativo para as contagens de coliformes totais na amostra da água do bebedouro. Segundo Laubusch (1971), isto é, devido à desinfecção da água que pode ser obtida pela utilização de diversos meios. Durante os processos numa estação de tratamento de água (ETA) convencional, as etapas de sedimentação, coagulação e filtração removem a maior parte dos organismos patogênicos e outros presentes na água.
Os resultados analisados para água de bebedouro estão de acordo com a portaria 2914 de 2011, que dispões sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade (BRASIL, 2011).
Na contagem feita para as amostras de água, houve a presença de coliformes totais no caldo LST. A positividade foi indicada através dos tubos de Durhan, observando os gases produzidos pelo metabolismo bacteriano, representados por uma bolha dentro do vidro e turvação do meio. A presença de coliformes totais no teste presuntivo das amostras de água, não determina que há contaminação fecal recente ou ocorrência de patógenos do trato intestinal (enteropatógenos), uma vez que bactérias desse grupo podem estar presentes não só em fezes, mas em outros ambientes, como vegetais e solo (FRANCO&LANDGRAF, 2003).
Se confirma a presença de coliformes totais no caldo Verde Brilhante, podendo estar presentes bactérias comuns em animais, como a Escherichia coli e algumas espécies Klebsiella sp., além de citrobacter sp. e Enterobacter sp., que são bactérias de outros ambientes (FRANCO&LANDGRAF, 2003). A positividade também foi indicada pela captação de gases pelos tubos de Durhan. Comparando os resultados da prova confirmatória para produção de gás e turvação do meio em caldo VB 
A contagem feita no caldo Escherichia coli, não houve presença de coliformes termotolerantes em todas as diluições da água analisada, assim encontrando valores aceitáveis nas concentrações de coliformes, classificando a água segundo resolução CONAMA nº 357, de 17 de março de 2005, destinadas ao consumo humano, após tratamento convencional.
Para a couve o teste presuntivo para detectar bactérias fermentadoras de lactose foi positivo para os nove tubos, isto é, devido à contaminação dos alimentos através de água ou manipulação. A positividade foi indicada através dos tubos de Durhan, observando os gases produzidos pelo metabolismo bacteriano, representados por uma bolha dentro do vidro e turvação do meio. A presença de coliformes totais no teste presuntivo das amostras de couve, não determina se há contaminação fecal recente ou ocorrência de patógenos do trato intestinal, uma vez que estas bactérias podem estar em ambientes, como vegetais e solo (FRANCO&LANDGRAF, 2003).
A presença de coliformes totais foi confirmada na positividade no caldo Verde Brilhante (VB), onde foi indicada pela captação de gases pelos tubos de Durhan e turvação do meio. Comparando os resultados da prova confirmatória para produção de gás e turvação do meio em caldo VB com a tabela do número mais provável, NMP/g ou ml (tabela 3), o valor encontrado foi 2400 NMP/ml para coliformes totais.
Na contagem feita nocaldo Escherichia coli, confirmou a presença de coliformes termotolerantes nas diluições 10-1 1 e 10-1 2. Nas provas bioquímicas realizadas para os tubos positivados no caldo E. coli o indol da diluição 10-1 1 e 10-1 2 foi positivo, apresentando um halo purpura após acrescido o reagente de kovacs. O VM da diluição 10-1 1 foi positivo apresentando um halo vermelho e 10-1 2 apresentou-se negativo com um halo amarelo após acrescido o reagente vermelho de metila. VP para ambas diluições se apresentaram negativos após adição de α-Naftol e KOH 40%, o citrato apresentou-se positivo 10-1 1 e negativo para 10-1 2. Visto os resultados das provas bioquímicas foi caracterizado que ambas as diluições não se tratavam de Escherichia coli, visto que para que estas fossem E. coli a prova de indol poderia se apresentar positiva ou negativa, VP obrigatoriamente negativa, VM positivo e citrato negativo.
CONCLUSÃO
No teste presuntivo os dados demonstram que a águas do bebedouro não apresentou contaminação por coliformes totais ou termotolerantes, indicando que os tratamentos feitos na água são eficientes no ponto de vista microbiológico. No teste confirmativo houve indícios da presença de coliformes totais na contagem feita em caldo VB, enquanto que na contagem em caldo E. coli, não houve indicativo da presença de coliformes termotolerantes. Segundo a legislação, a presença de coliformes totais já reprova a água para consumo humano. Tal resultado pode ser de fato negativo, indicando que as águas analisadas estão livres de contaminação ou podem indicar um falso negativo, com possibilidade de alterações na inoculação, na temperatura de incubação das amostras ou no tempo de incubação.
Para a couve os testes presuntivos e confirmativos demonstraram-se positivos indicando contaminação por coliformes totais ou termotolerantes, com possibilidade de contaminação condições de higiene. Mesmo após as provas bioquímicas demonstrarem que não se tratava de E. coli a contagem do NMP apresentou-se maior que as estabelecidas na legislação do RDC para couve, considerando-a imprópria para consumo.
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