Microrganismos Indicadores uso e interpretações

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MICRORGANISMOS INDICADORES – uso e interpretações 
 
INTRODUÇÃO 
 
A qualidade de um alimento, segundo KRAMER & TWIGG (1970), é o conjunto de 
características das diferentes unidades individuais de um produto que determina o seu 
grau de aceitabilidade (EIROA, 1977). 
 Embora se utilize geralmente o termo “qualidade” no singular para se referir a 
determinado alimento, é preciso levar em conta que essa qualidade é resultante de uma 
soma de certo número de atributos, alguns deles positivos e desejáveis, outros negativos, 
indesejáveis e, às vezes até perigosos. 
 Dentre esses atributos alguns são óbvios ao consumidor, tais como a cor, o odor, 
a textura, o sabor: são geralmente, as qualidades pelas quais o comprador julga se 
comprará ou não determinado alimento. 
 Existem porém, outros atributos não tão óbvios, como valor nutricional, presença 
de aditivos químicos, resíduos de pesticidas, traços de metais, microrganismos, toxinas, 
que constituem geralmente objeto de legislações e regulamentos e aos quais o 
comprador não tem acesso com facilidade (GOMEZ RUIZ, 1973). 
 Dentro dos atributos indesejáveis, pode-se estabelecer certa escala de prioridade 
quanto aos riscos que apresentam ao consumidor, da seguinte maneira: 
• Riscos microbiológicos; 
• Riscos de uma nutrição deficiente; 
• Riscos pela presença de tóxicos ambientais 
• Riscos ocasionados por tóxicos naturais (compostos tóxicos naturalmente presentes 
em plantas e animais); 
• Riscos provocados por resíduos de pesticidas; 
• Riscos devidos a aditivos químicos. 
 
TRUSWELL e cols. (1978) consideram que o risco de um indivíduo adquirir uma 
enfermidade de origem microbiana através de um alimento e 1.000 vezes maior do que 
por poluentes ambientais, como metais pesados, por exemplo, e 100.000 vezes maior do 
que por pesticidas. Isto demonstra que a qualidade microbiológica de um alimento, 
portanto, é o atributo mais importante, devendo ser controlada adequadamente por duas 
razões fundamentais: 
 
• Para prevenir as toxinfecções de origem alimentar; 
• Para retardar ou inibir a contaminação e a multiplicação microbiana, causadora da 
deterioração dos produtos, melhorando-os, assim, quanto à qualidade e conservação. 
 
 
O controle de qualidade microbiológica dos alimentos surgiu, inicialmente, como 
uma necessidade para prevenir e controlar surtos de toxinfecções produzidos pela 
ingestão de alimentos contaminados com patógenos. Nos últimos anos, uma série de 
fatores têm contribuído ao aumento das doenças de origem alimentar, como: 
• produção de alimentos em grande escala; 
• transporte dos alimentos a grandes distâncias do seu lugar de fabricação; 
• uso crescente de alimentos instantâneos, semipreparados, em pó e congelados; 
• manutenção incorreta dos alimentos em estabelecimentos comerciais; 
• colocação dos produtos por períodos prolongados a temperaturas ideais ao 
desenvolvimento de patógenos; 
• novas práticas de cria e abate; 
• fabricação de alimentos mediante processos tecnológicos novos e uso de embalagens 
em tipos de recipientes, às vezes, insuficientemente avaliados quanto aos riscos que 
apresentam. 
 
Segundo dados encontrados na literatura, desde aproximadamente 1880 é 
conhecida a contaminação dos alimentos por microrganismos produtores de 
enfermidades (JAY, 1973; APHA, 1992). A partir dessa época, já são relatados casos de 
doenças transmitidas por alimentos, entre elas as toxinfecções alimentares. 
- Antes do desenvolvimento dos métodos de pasteurização era freqüente a 
transmissão através do leite de enfermidades como brucelose, escarlatina, 
febre tifóide, difteria e outras. 
- Antes da obrigatoriedade da inspeção dos animais de açougue também era 
freqüente a transmissão através da carne, de enfermidades dos animais 
transmissíveis ao homem como a brucelose, tuberculose, etc. 
- A contaminação dos alimentos durante a elaboração, quer seja por 
manipuladores, por equipamentos e etc., constitui a outra fonte de 
transmissão de enfermidades, sendo, atualmente, uma das mais importantes 
no desenvolvimento de surtos de toxinfecções, especialmente com 
determinados alimentos. 
 
O ideal, para assegurar a qualidade microbiológica de um alimento, seria a 
análise completa de todas suas unidades, no sentido de demonstrar a ausência de 
microrganismos patogênicos e baixo nível de deteriorantes. Em geral, não é 
possível examinar cada produto (por isso se faz amostragem) ou alimento e, muito 
menos, investigar a presença dos patogênicos mais importantes (a pesquisa 
desses implica em diferentes problemas), o que traz uma série de dificuldades. 
 
 
Fatores que dificultam a pesquisa de patogênicos (MARTINEZ-MANZANARES e 
cols., 1991): 
 
1. Alto custo dos materiais e equipamentos utilizados nas técnicas de isolamento; 
2. Técnicas muito sofisticadas → demoradas; 
3. Quais patogênicos pesquisar ?; 
4. Seria demorada a emissão de laudos → alimento não pode esperar. 
 Na prática utiliza-se da pesquisa de microrganismos indicadores e somente 
alguns patogênicos ou, quando ocorre um surto, dos prováveis agentes envolvidos. 
 Os microrganismos indicadores foram inicialmente utilizados com o propósito de 
determinar o grau de contaminação fecal de águas naturais e, só mais recentemente, na 
análise de alimentos (MARTINEZ-MANZANARES e cols., 1991) 
 Atualmente, os microrganismos indicadores são utilizados tanto na avaliação das 
condições higiênico-sanitárias da produção de determinado tipo de alimento, realizado em 
nível industrial por serviços de controle de qualidade, como na avaliação de sua 
microbiologia como um todo, no sentido de comparar com padrões oficiais, realizado por 
órgãos oficiais. 
 Microrganismos indicadores são microrganismos ou grupos cuja identificação 
qualitativa e quantitativa pode proporcionar informações sobre as condições higiênico-
sanitárias do produto em análise. Através da utilização desses microrganismos existe a 
possibilidade da verificação da qualidade do alimento, como foi produzido e qual a 
perspectiva de sua vida comercial. 
 
 Segundo SANTIAGO (1972) o objetivo da determinação de alguns grupos de 
indicadores, em particular no leite, não é o de determinar quantos 
microrganismos de um determinado tipo existe em uma amostra, mas identificar 
o produtor que está fazendo um trabalho inferior com as ferramentas de que 
dispõe. 
 
Com a utilização dos indicadores: 
- se analisa o alimento com vistas a risco → se verifica o aspecto sanitário; 
- se verifica as condições da produção do alimento → aspecto higiênico → 
controle de qualidade. 
Os INDICADORES são considerados ainda como determinados microrganismos 
ou grupos de microrganismos, através dos quais pode-se determinar: 
 - qualidade da matéria prima; 
 - condições de trabalho das etapas tecnológicas; 
 
 - potencial de risco, dependendo do grupo utilizado e do momento de sua 
determinação dentro do fluxograma de produção de determinado tipo de alimento. 
 
 Como características os indicadores devem: 
 
� Ser de fácil determinação através de processos rápidos e seguros; 
� Ser determinados através de processos não muito caros; 
� Apresentar resultados reprodutíveis; 
� Apresentar resistência igual ou maior que a dos patogênicos mais importantes no 
alimento em estudo. 
 
PRINCIPAIS GRUPOS DE INDICADORES 
 
1. Microrganismos heterotróficos aeróbios ou facultativos, psicrotróficos, mesófilos e 
termófilos viáveis. (muito usados para verificar aspectos higiênicos) 
2. Bactérias anaeróbias. 
3. Indicadores de contaminação fecal (aspectos sanitários) 
3.1 Coliformes totais: pode conter mais de 20 espécies 
 3.2 Coliformes fecais: predominantemente E. coli 
 3.3 Escherichia coli 
3.4 Família Enterobacteriaceae: importante como indicadores da contaminação de 
ovos por salmonelas. 
3.5 Enterococos(indicambasicamente contaminação fecal de origem animal). 
3.6 Clostridium perfringens: utilizado como indicador de contaminação fecal em 
água. 
 
4. Outros indicadores: Streptococcus salivarum; S. aureus; Bactérias mesófilas 
produtoras de esporos; clostrídios sulfito redutores; bolores e leveduras; microrganismos 
halófilos, proteolíticos, lipolíticos e osmofílicos. 
 O grupo a ser escolhido dependerá da característica do alimento. 
 
 
MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO E SIGNIFICADO DOS INDICADORES DE USO 
CORRENTE. 
 
1. Preparo da amostra: diluições (Apresentado no capítulo de amostragem) 
 
2. Quantificação de microrganismos heterotróficos, psicrotróficos, mesófilos e 
termófilos viáveis, através do método da contagem padrão em placas. 
 
 
 Meio utilizado: Ágar padrão para contagem (PCA) 
 Técnica “pour plate”, em duplicata, das diluições que mais se adequarão, de forma 
a se ter no final da incubação placas com números entre 25 e 250 colônias. 
Temperatura e tempo de incubação: 
 psicrotróficos: 7oC / 10 dias 
 mesófilos: 35-37oC / 24 a 48 horas. Para produtos lácteos a temperatura deve ser 
de 32oC. 
 termófilos: 55oC / 48 horas. 
Contar placas que apresentem entre 25 e 250 colônias 
 
Possibilidade quanto ao número de colônias em placas (Utilizando contador de 
Quebec): 
 
a. Número de col. entre 25 e 250 (duplicata) 
 a.1 Mesma diluição – Calcular a média das contagens das duas placas e 
multiplicar pelo inverso da diluição inoculada. Resultado em UFC/g ou mL. 
 a.2 Diluições diferentes – Contar cada placa individualmente, multiplicar os 
resultados pelo inverso da diluição de cada placa utilizada e calcular a média para a 
obtenção do resultado final. 
b. Todas as placas com mais de 250 colônias 
 b.1 Com número ≤ 10 col./ cm2 – Contar 12 quadrados de 1cm2 cada 
(quadriculado na superfície de vidro do aparelho) sendo 6 quadrados consecutivos na 
horizontal e 6 na vertical, tirar a média e multiplicar o resultado por 65 (65 cm2 = área total 
da placa). O resultado final é obtido após a multiplicação pelo inverso da diluição da placa 
utilizada. 
 b.2 Com número > 10 col./ cm2. Contar as colônias em 4 quadrados, tirar a 
média e multiplicar o resultado por 65. O resultado final é obtido conforme item b.1. 
c. Todas as placas com menos de 25 colônias 
 Contar a placa de menor diluição. 
d. Nenhuma placa entre 25 e 250 colônias 
 Registrar o número mais próximo de 250. 
e. Todas as placas sem colônias 
 Considerar a menor diluição 
f. Placas com colônias invasoras (crescimento difuso) 
 Contar as colônias em uma parte da placa quando: 
 f.1 Bem distribuídas em áreas livres de invasão; 
f.2 A área coberta por invasoras não exceda metade da placa; 
 
 obs. Se a área inibida exceder a ¼ da área total, expressar o resultado como 
inibidores do crescimento. 
 
Interpretação: 
 
Contagem alta de mesófilos 
1. Matéria prima contaminada; 
2. Condições inadequadas de higiene durante a produção; 
3. Condições de tempo e temperatura inadequadas durante o processamento; 
4. Ação conjunta dessas circunstancias. 
 
Números altos de bactérias mesófilas indicam que houve possibilidade de 
multiplicação, inclusive de patogênicos. A medida que aumenta o número de 
microrganismos se incrementa a possibilidade de existir microrganismos patogênicos e a 
presença de produtos tóxicos, resultantes do metabolismo microbiano. Assim sendo, os 
mesófilos são indicadores também voltados aos aspectos sanitários do produto. 
 A quantificação de microrganismos psicrotróficos tem valor na avaliação dos 
aspectos higiênicos da produção de determinado alimento, tendo em vista que são, na 
sua maioria, microrganismos deteriorantes. 
Quanto maior o número de microrganismos maior é o risco de decomposição 
(FEHLHABER & JANETSCHKE, 1992). Populações entre 106 e 108/grama ou mililitro 
indicam alteração evidente. Assim, a avaliação da população microbiano de determinado 
alimento pode dar idéia da forma higiênico-sanitária da elaboração deste produto, bem 
como da perspectiva de seu futuro em termos de “vida de prateleira” (TOMPKIN, 1983). 
 
Limitações da contagem de mesófilos 
1. Alimentos tratados pelo calor, frio ou dessecados, onde ela subestima a população 
ativa antes do processo; 
2. Alimentos refrigerados → mais indicado psicrotróficos; 
3. Alimentos fermentados ou maturados, como salame, queijos, etc. → sem significado 
pela impossibilidade de se diferenciar os possíveis deteriorantes ou patogênicos, 
daqueles fermentadores. 
 
3. Coliformes totais, fecais e Escherichia coli. 
 
Dentre os indicadores, os coliformes são os mais utilizados quando se visa 
aspectos sanitários e isso se deve a algumas características necessárias a indicadores 
e que eles atendem com facilidade. 
 
Em 1887, Escherich descreveu um microrganismo ubiqüitário, isolado de fezes 
humanas (Bacillus coli), que atualmente recebe o nome de Escherichia coli e que, em 
1892, foi proposta por Shardinger de ser utilizada como indicadora de contaminação fecal 
por ser mais facilmente isolada que a Salmonella (APHA, 1992). 
 Mais tarde esse microrganismo foi englobado em um grupo denominado 
coliformes. O grupo caracterizado como coliformes totais, compreende bactérias na 
forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios 
facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 
35oC. Assim, segundo a definição, o grupo pode incluir cerca de 20 espécies, dentro as 
quais encontram-se tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal do homem e outros 
animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias não 
entéricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por essa razão, sua enumeração 
em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do 
que a enumeração de coliformes fecais ou E. coli (APHA, 1992). 
 Os grupo dos coliformes fecais recebe a mesma definição dos totais, porém, 
restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 
24 horas a 44,5±0,2 ou 45,5oC±0,2 (termotolerantes). Esta definição objetivou, em 
princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato gastrintestinal. Atualmente 
sabe-se, entretanto, que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros, 
Escherichia, Enterobacter (cloacae) e Klebsiella (pneumoniae), dos quais os dois últimos 
podem incluir cepas de origem não fecal. Por esse motivo a presença de coliformes 
fecais em alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do 
que a enumeração direta de E. coli, porém, muito mais significativa do que a presença de 
coliformes totais, dada a alta incidência de E. coli dentro do grupo fecal (APHA, 1992; 
SILVA e cols., 1997). 
 Dentre as bactérias de “habitat” reconhecidamente fecal, dentro do grupo dos 
coliformes fecais, E. coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos 
membros não fecais. Todos os demais membros do grupo têm uma associação duvidosa 
com a contaminação fecal e E. coli, embora também possa ser introduzida nos alimentos 
a partir de fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o 
momento (SILVA e cols., 1997). 
 
E.coli → tem seu habitat no intestino do homem e animais. 
Enterobacter → além do trato intestinal pode estar no solo, água e plantas. 
 
Características que fazem dos coliformes fecais e, em particular da E. coli, bons 
indicadores: 
 
 
� Especificidade: as bactérias selecionadas só devem ser encontradas no meio 
intestinal, particularmente a E. coli; 
� Estão presentes em grandes quantidades nas fezes, de tal forma que podem ser 
detectados em altas diluições; 
� São resistentes às condições ambientais extra-intestinais; 
� Mesmo em pequenas quantidades são detectados de forma fácil e completa.- Coliformes totais: indicam mais como o alimento foi preparado, indicam 
condições de higiene, não indicam risco. Isto tendo em vista que este grupo engloba 
várias espécies e, entre elas, o Enterobacter e o Citrobacter que podem se desenvolver 
no ambiente, particularmente na água. 
 - Coliformes fecais: indicam contaminação por fezes, têm conotação de risco. 
Este grupo compreende basicamente a E. coli, que tem como habitat natural o trato 
intestinal e que pouco sobrevive a condições ambientais. 
“A presença de grande número desses microrganismos na água ou alimentos 
indica a possibilidade da existência de agentes patogênicos eliminados pelas fezes”. 
 A ausência desses microrganismos (intestinais) no exame de alimentos indicará 
boas condições de higiene porém não de inocuidade. A inocuidade dos alimentos só pode 
ser garantida após investigação dos microrganismos patogênicos. 
 Grande parte dos alimentos é controlada por padrões microbiológicos referentes a 
coliformes. 
 
3.1 Determinação de coliformes totais, fecais e de Escherichia coli pelo método do 
número mais provável (NMP) (APHA, 1992) 
 
 Teste de tubos múltiplos 
 Semeia-se diluições em 3 ou mais séries de 3 ou 5 tubos. 
 Teste presuntivo: tubos com caldo lauril sulfato triptose. 
 Incubação por 24 a 48 horas/35 - 37oC. 
 Dos tubos com crescimento e gás semeia-se para o teste confirmativo: 
Coliformes totais - Caldo lactosado bile verde brilhante - 37oC /24 a 48 horas. 
Coliformes fecais - Caldo EC 44,5oC ± 0,2 / 24 horas ou 45,5oC ± 0,2 / 24 a 48 horas 
 
 Após a incubação levar o número de tubos positivos para uma tabela de NMP 
(Hoskins), partindo da maior diluição que tenha 3 tubos positivos. É importante que haja 
pelo menos um tubo negativo dentre as diluições escolhidas. (Tabela em anexo) 
 Para o NMP de Escherichia coli semeia-se dos tubos de caldo EC com resultado 
positivo, ágar EMB e a partir de colônias características (negras com brilho metálico ou 
 
rosadas de centro escuro) realiza-se, para cada um dos tubos, as provas do IMViC (indol, 
VM, VP e citrato). A Escherichia coli apresenta as características: 
indol: + ou -, VM: +, VP: - e Citrato: - 
 O NMP de E. coli é obtido levando-se à tabela o número de tubos de caldo EC 
positivos, que deram resultado característico para E. coli através das provas do IMViC. 
 
4. Quantificação de Staphylococcus sp. e de S. aureus através da contagem em 
placas 
 
 Nesta determinação as diluições em estudo são colocadas na superfície do ágar 
(Ágar seletivo para Staphylococcus segundo Baird-Parker), na quantidade de 0,1 a 0,2 ml 
e espalhadas com uma alça de Drigalsky ou bastão em forma de “L”. 
 Após incubação a 35-37oC/24-48 horas, conta-se as colônias negras, com e sem 
halo de transparência, separadamente, nas placas que apresentem entre 20 e 200 
colônias. 
 Para a confirmação, toma-se entre 3 e 5 colônias de cada tipo e semeia-se em 
ágar nutriente inclinado e, após incubação, realiza-se esfregaços corados pelo método de 
Gram para a verificação de morfologia. O total de colônias contadas corresponde à 
população de Staphylococcus sp. 
 O total correspondente à espécie S. aureus pode ser obtido submetendo-se às 
provas da catalase, coagulase, termonuclease, Voges-Proskauer e utilização do manitol 
em anaerobiose, as colônias características previamente isoladas em ágar nutriente 
(KLOOS & SCHLEIFER, 1986). 
A partir do número de colônias que deram resultados característicos para o 
S. aureus nessas provas, proporcionalmente ao número contado, chega-se ao número de 
bactérias/grama ou mililitro. 
 
 
Provas que diferenciam o Staphylococcus aureus de outros coagulase positivos: 
 
Prova S.aureus S. intermedius S. hyicus S. delphini 
Coagulase + + + + 
VP + - - - 
Ac. do manitol 
 anaerobiose 
 aerobiose 
 
+ 
+ 
 
- 
11 a 89% + 
 
- 
+ 
 
- 
- 
Ac. da maltose + 90% + - + 
Ac. da trealose + + + - 
 
Termonuclease + + + - 
 
 A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos 
diferentes, um relacionado à Saúde Pública, para confirmar o envolvimento em surtos de 
intoxicação alimentar, e outro relacionado com o controle de qualidade higiênico-sanitária 
dos processos de produção de alimento ou atendimento de padrões oficiais. Nesses 
casos o Staphylococcus aureus serve como indicador de condições higiênicas de 
processamento, de superfícies e, em particular, da participação do homem como fonte de 
contaminação, tendo em vista que este microrganismo tem como seu habitat natural, 
entre outros locais, as mãos, fossas nasais e boca do ser humano. 
 De maneira geral, alimentos envolvidos em surtos apresentam uma grande 
população de S. aureus, não exigindo métodos particularmente sensíveis, enquanto na 
enumeração como indicador, o número de células geralmente é reduzido, exigindo 
métodos mais sensíveis, principalmente se o S. aureus não representa a espécie 
predominante no alimento. O ágar de Baird-Parker se presta de forma adequada a esse 
fim. 
 É importante ressaltar que alimentos submetidos a tratamento térmico após um 
período de manutenção em condições que permitam o crescimento podem não 
apresentar células viáveis de S. aureus, destruídas pelo calor, e ainda assim conter 
toxinas estafilocócicas, altamente resistentes ao calor. 
 
5. Quantificação de clostrídios sulfito redutores e de Clostridium perfringens 
através da contagem em placas (APHA, 1992) 
 
 Os clostrídios sulfito redutores e junto a eles o Clostridium perfringens são comuns 
em diferentes tipos de alimentos, particularmente em carnes frescas, aves, alimentos 
desidratados, vegetais e ingredientes de uma forma geral. Isto faz com que a simples 
presença desses microrganismos seja praticamente inevitável. Em casos de surtos de 
intoxicação alimentar a demonstração de centenas, milhares ou mais microrganismos por 
grama no alimento suspeito é um suporte ao diagnóstico, quando acompanhado de 
evidências clínicas e epidemiológicas. A confirmação deve ser realizada através da 
enumeração de esporos de Clostridium perfringens nas fezes dos pacientes acometidos. 
 Como indicadores os clostrídios sulfito redutores se prestam a demonstrar a 
possível presença de outros patógenos, de origem intestinal ou não, inclusive do 
Clostridium botulinum. O Clostridium perfringens é também utilizado como indicador de 
contaminação fecal em água, principalmente em águas tratadas como a água clorada. O 
fato de ser esporulado permite a sua sobrevivência ao tratamento. 
 
 Há vários meios de cultura disponíveis para a enumeração de clostrídios sulfito 
redutores e Clostridium perfringens em alimentos, como o ágar sangue neomicina, o ágar 
sangue cicloserina, o ágar sulfito polimixina sulfadiazina (SPS) e o ágar triptose sulfito 
cicloserina (TSC), entre outros, sendo que este último pode ser usado com ou sem gema 
de ovo. A seletividade destes meios é resultante da incorporação da um ou mais 
antibióticos, para inibir diversos anaeróbios e anaeróbios facultativos e, salvo no caso dos 
meios com sangue, a característica diferencial comum a todos os demais é a presença de 
ferro e sulfito. Dentre esses meios os mais utilizados na enumeração de clostrídios em 
alimentos são o SPS e o TSC. 
 Os clostrídios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro e precipita 
na forma de sulfeto de ferro, produzindo colônias negras. 
 
5.1 Contagem ppdita. 
 
As diluições eleitas são semeadas, pela técnica de “pour plate”, em placas de 
Petri, utilizando-se o Ágar sulfito polimixina sulfadiazina (SPS), fundido e resfriado a ± 
45oC, em dupla camada. 
 Após incubação a 46oC/18 a 24 horas (SILVA e cols., 1997) ou 35 a 37oC/24 horas 
(APHA, 1992), em anaerobiose, conta-se as colônias negras nas placas que contenham 
entre 20 e 200 colônias. 
Para a confirmação das colônias típicas declostrídios sulfito redutores deve-se 
selecionar várias colônias e transferir para tubos contendo caldo infusão cérebro coração, 
previamente desaerados. Para desaeração do meio, submeter os tubos à fervura em 
banho por 15 minutos, com as tampas afrouxadas, e resfriar imediatamente em banho de 
gelo. Incubar os tubos inoculados a 35oC/24 horas, preparar um esfregaço da cultura para 
coloração de Gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase. 
Teste de catalase – adicionar ao tubo de BHI, 1,0 ml de peróxido de hidrogênio a 
3% e observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (negativo). Os 
clostrídios sulfito redutores são bastonetes Gram positivos e catalase negativos. 
Para efeito de resultado considerar como confirmadas todas as culturas de 
bastonetes Gram positivos catalase negativos. Calcular o número de UFC/grama ou 
mililitro em função do número de colônias típicas, diluição inoculada e porcentagem de 
colônias confirmadas. (Cuidado pois pode haver crescimento e produção de toxina pelo 
C. botulinum). 
 
Para se chegar a Clostridium perfringens deve-se selecionar de 5 a 10 colônias e 
repicar em ágar nutriente inclinado e, após incubação em anaerobiose, realizar 
esfregaços corados pelo método de Gram. Constatada a presença de bastonetes 
 
grandes e G+, realizar as provas da motilidade e redução do nitrato a nitrito (ágar nitrato 
motilidade). O C. perfringens é positivo para as duas provas. Provas adicionais podem ser 
realizadas como da fermentação da lactose e hidrólise da gelatina (também positivo nos 
dois testes). O resultado final é obtido em função também do número de colônias típicas, 
diluição inoculada e porcentagem de colônias confirmadas. 
 
6. Quantificação de bolores e leveduras pela contagem em placas 
 
 Os bolores e leveduras se constituem em um grande e diversificado grupo de 
microrganismos que compreende milhares de espécies. Esses microrganismos são 
facilmente encontrados no solo e no ar e dado ao fato de sua natureza heterotrófica e sua 
capacidade de adaptação a diferentes condições ambientais, podem ser encontrados 
como contaminantes e com ativa capacidade de desenvolvimento em diferentes tipos de 
alimentos, principalmente naqueles processados sob condições inadequadas de higiene 
(principalmente de equipamentos). 
 Esses microrganismos podem determinar graus variáveis de decomposição de 
alimentos. Dado ao fato de serem microrganismos pouco exigentes em termos de pH, aw 
e outros fatores, invasão e crescimento podem ocorrer em qualquer tipo de alimento se 
as condições ambientais assim o permitir. 
 A contagem de bolores e leveduras é realizada após a preparação das diferentes 
diluições decimais, através da técnica de semeadura em superfície, de 0,1 ml, em ágar 
adicionado de antibiótico ou acidificado (APHA, 1992). Para esse fim pode ser usado o 
PCA adicionado de cloranfenicol (100 µg/ml), o ágar batata dextrosado acidificado a pH 
3,5 e o ágar extrato de malte também acidificado (sol. a 10% de ácido tartárico ou 
láctico). A vantagem da utilização do cloranfenicol é a possibilidade do mesmo ser 
autoclavado juntamente com o meio de cultura dado a sua termoresistência. 
 A incubação deve ser realizada entre 22 e 25oC/5 dias com as placas em pé e 
contadas aquelas que apresentam entre 15 e 150 colônias. Na predominância de bolores 
deve ser contada a placa que mais se aproxima de 15 colônias e, na predominância de 
leveduras, a que se aproxima de 150. A incubação pode ser realizada também em 
temperatura ambiente. 
 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
 Como exemplo da utilização de indicadores, na avaliação da qualidade 
microbiológica de alimentos e na prevenção de surtos ou casos de enfermidades 
bacterianas veiculadas por alimentos, muitos países e organizações internacionais 
estabeleceram critérios microbiológicos baseados, na sua maioria, na determinação de 
 
microrganismos indicadores. Assim, no Brasil, o Ministério da Saúde, através da 
Resolução RDC no 12 de 02 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância 
Sanitária, estabelece: 
 
Anexo II 
Conclusão e interpretação dos resultados das análises microbiológicas de alimentos 
destinados ao consumo humano 
 
I - Interpretação dos resultados: 
Para interpretação dos resultados, compara-se os valores encontrados nas 
análises realizadas com os valores estabelecidos no Anexo I. De acordo com a 
comparação temos: 
Ia - Produtos em condições sanitárias satisfatórias: São aqueles cujos resultados 
analíticos estão abaixo ou igual aos estabelecidos para amostra indicativa ou amostra 
representativa. 
Ib - Produtos em condições sanitárias insatisfatórias: 
Ib1 – São aqueles cujos resultados analíticos estão acima dos limites estabelecidos para 
amostra indicativa ou amostra representativa, conforme especificado no Anexo I da 
Resolução n.12 
Ib2 – São aqueles cujos resultados analíticos demonstram a presença ou a quantificação 
de outros microrganismos patogênicos ou toxinas que representem risco à saúde do 
consumidor. 
 
II - Conclusão 
IIa – “Produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) de 
acordo com os padrões legais vigentes” para as situações enquadradas no item Ia. 
IIb – “Produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) 
impróprio para o consumo humano por apresentar...” (citar o resultado(s) analítico(s) 
e o(s) parâmetro(s) não atendido(s) para as situações enquadradas no item Ib1. 
IIc – “Produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) 
impróprio para o consumo humano por apresentar...” (microrganismos patogênicos 
ou toxina que representa perigo severo à saúde do consumidor). 
A análise preventiva com o objetivo de impedir a ocorrência de transtornos na 
saúde pelo consumo de alimentos, realizada através da determinação, na grande maioria 
dos estabelecimentos, de microrganismos indicadores, tem sido considerada de pouca 
eficiência, não somente pela problemática da amostragem ao acaso, mas também pela 
duração das investigações laboratoriais. Estas últimas são justificadas somente para 
 
aqueles alimentos que podem chegar ao consumidor depois de contar com o resultado da 
análise. Por isso, em muitas ocasiões, é mais eficaz controlar de maneira contínua a 
higiene da elaboração. Este tipo de processo é conhecido como controle de pontos 
críticos (FEHLHABER & JANETSCHKE, 1992). 
 Pontos críticos são considerados como todos os pontos do processo tecnológico 
em pode ocorrer um aumento da carga microbiana por contaminação ou por multiplicação 
da microbiota presente, ou aqueles pontos que são decisivos na eliminação ou na criação 
de uma estabilidade microbiológica. Entre eles se encontram as higienizações corretas de 
equipamentos e dependências, a comprovação de que as aplicações de calor são 
corretas, o controle do pH, das concentrações de NaCl e das temperaturas de 
armazenagem. Os pontos críticos de controle são estabelecidos a partir de uma análise 
de risco da totalidade do processo de produção. Com a colocação deste conceito 
(ARPCC) em prática pode garantir-se uma higiene mais perfeita dos alimentos do que 
aquela conseguida somente a partir da análise do produto terminado (FEHLHABER & 
JANETSCHKE, 1992). 
 
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