HOSPEDEIROS PARA CLONAGEM MOLECULAR

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UNIVERSIDADE DE ÉVORA
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Engenharia Genética ­ Clonagem de DNAs em Bactérias (Módulo I)
ACÇÃO FOCO ­ 1999 
Docente Responsável: Prof. Carlos Sinogas
HOSPEDEIROS PARA CLONAGEM
MOLECULAR
MÁRIO SILVA
 
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO
O que é clonar?
O que é um vector?
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Tipos de células hospedeiras
Hospedeiros procarióticos
Hospedeiros eucarióticos
BIBLIOGRAFIA
INTRODUÇÃO
A  recombinação  entre moléculas  de DNA de  diferentes  organismos  é  um  fenómeno  comum na
natureza. Vírus como o  fago  l  têm a capacidade de  inserir o seu genoma no cromossoma de E.
coli. Neste processo, eles podem mudar o conteúdo genético da célula e por vezes uma bactéria
torna­se patogénica,  ao  receber  nova  informação genética de um vírus. Por  exemplo,  quando a
bactéria Corynebacterium diphtheriae é  infectada  por  um  vírus  b  ,  produz­se  uma  toxina  que  é
responsável pelos sinais e sintomas da difteria. O genoma viral que codifica a toxina insere­se no
cromossoma bacteriano sob a forma de um provírus. Esta alteração genética na bactéria, causada
pelo  vírus,  conhecida  como  "conversão  lisogénica",  é  um  exemplo  de  engenharia  genética  na
natureza.
Houve descobertas em biologia molecular, que permitiram aos cientistas reproduzir no laboratório
este  fenómeno natural  e  desenvolver métodos para  introduzir  quase  todo o  tipo  de  informação
genética  num  organismo.  A  maior  parte  destes  avanços  envolve  a  manipulação  genética  de
bactérias  como  E.  coli  e  B.  subtilis,  e  a  levedura  S.  cerevisae  para  a  produção  de  bens  de
consumo,  especialmente  aqueles  que  são muito  caros  ou  virtualmente  impossíveis  de  produzir
pelos métodos tradicionais (quadro I).
Fez­se progressos consideráveis no sentido de introduzir genes em animais e plantas para curar
doenças  genéticas,  aumentar  a  produtividade  das  plantas  e  do  gado  e  tornar  os  cereais  mais
resistentes  a  doenças.  Por  exemplo,  introduz­se  muitos  genes  em  plantas  para  as  tornar
resistentes a insectos e a plantas infestantes. Muitos cientistas estão a tentar introduzir em alguns
cereais como o trigo, o arroz, a cevada e o milho, os genes bacterianos para a conversão do azoto
atmosférico em amónia. Isto permitiria o crescimento dos cereais sem a necessidade de adição de
fertilizantes de azoto, bastante dispendiosos e muitas vezes prejudiciais ao meio ambiente (figura
1).
 
Figura 1­ Plantas transgénicas.
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Quadro I­ Alguns benefícios da biotecnologia.
Hibridoma Anticorpos
Proteínas Insulina
lnterferão
Albumina sérica humana
Hormona humana do crescimento
Activador plasminogénico de
tecidos
Antitrombina
Factores de coagulação do sangue
Luciferase (pirilampo)
Linfocinas
Factor da necrose tumoral
Gonadotropina humana
Agricultura Cereais resistentes a doenças
Tomates hidropónicos
Resistência a pesticidas
Bio­insecticidas
Fixação do azoto
Vacinas Hepatite B
Herpes
Gripe
Malária
 
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O que é clonar?
Clonar é um processo em que se insere um fragmento de DNA num plasmídeo ou no cromossoma
de um fago sendo­lhe permitido replicar­se para produzir numerosas cópias do DNA. A replicação
tem  normalmente  lugar  quando  o  plasmídeo  ou  cromossoma  fágico  se  introduzem  num
hospedeiro apropriado  (ex: uma bactéria ou uma célula de  levedura) e o aparelho de síntese do
DNA do hospedeiro replica o DNA inserido na célula hospedeira.
Normalmente,  o  DNA  dador  corresponde  a  uma  pequena  porção  do  genoma  de  uma  célula  e
encontra­se representado por uma ou duas cópias por célula. Logo, antes de se poder extrair o
DNA dador tem de se obter, a partir quer um pequena porção de tecido, quer de uma cultura de
células, um número suficiente de células desejado. Depois de se ter obtido um número suficiente
de  células  contendo  o  material  genético  pretendido,  cada  célula  tem  que  ser  rebentada  e  o
material genético extraído.
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Figura  2­  Diagramas  de  vectores  de  clonagem  simples  derivados  de  um  plasmídeo.  O  plasmídeo
pode  transportar  um  ou  mais  genes  que  lhe  confiram  propriedades  particulares,  tais  como  a
resistência a certos antibióticos. O gene selectivo ampr codifica a enzima b ­lactamase, que inactiva a
amplicilina (antibiótico).
 
 
Figura 3­ Microfotografia de plasmídeos.
 
 
Figura 4­ Experiência típica de clonagem. Selecciona­se um plasmídeo adequado (vector) para a inserção de um gene determinado
(DNA dador). Tanto o DNA dador como o vector têm sequências de DNA específicas (4 ­ 6 pares de bases) nas quais endonucleases de
restrição cortam as cadeias do DNA. Em tubos separados, mistura­se por um lado o fragmento de DNA contendo o gene a ser clonado
e por outro o plasmídeo no qual o gene será inserido, com a endonuclease de restrição escolhida (neste caso, EcoRl). A enzima
escolhida deverá cortar o plasmídeo num só local. O plasmídeo cortado pode então receber uma porção adicional de DNA. Incuba­se
os fragmentos de DNA e os plasmídeos cortados e abertos, com a enzima ligase que liga fragmentos de DNA e plasmídeos. Desta
ligação resulta um plasmídeo recombinante que contém o fragmento de DNA desejado. As células que adquiriram os plasmídeos
dizem­se «transformadas» e, neste caso, são resistentes ao antibiótico amplicilina.
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Quadro II ­ Componentes de uma experiência de clonagem.
Componente de clonagem Função
DNA dador Fonte do DNA ou gene a ser clonado
Endonuclease de restrição Enzima utilizada para cortar tanto u DNA do dador
como o do vector em locais específicos, de modo a
que o DNA do dador possa ser inserido no vector
Vector Plasmídeo ou bacteriófago utilizado para introduzir o
Vector Plasmídeo ou bacteriófago utilizado para introduzir o
gene a ser clonado numa célula hospedeira
Ligase de DNA Enzima utilizada para ligar as extremidades livres e
adaptáveis do DNA do vector e do dador e assim
formar um vector recombinante
Célula hospedeira Geralmente uma bactéria ou uma célula de levedura.
Os vectores recombinantes introduzem ­se nas
células hospedeiras de modo a obter maiores
quantidades da molécula de DNA recombinante
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O que é um vector?
Um vector é uma molécula de DNA à qual DNA estranho pode ser ligado e posteriormente inserido
nas  células  de  modo  a  que  o  DNA  «recombinante»  se  possa  replicar.  Os  vectores  podem  ser
introduzidos nas células hospedeiras por transformação ou por infecção fágica
Existem  vários  tipos  de  vectores  utilizados  nas  experiências  de  clonagem.  Contudo,  os  mais
frequentes  são  os  plasmídeos  e  vírus  bacteríanos  (bacteriófagos)  porque  facilmente  se
introduzem nas células e são manipulados no laboratório. independentemente do tipo, os vectores
têm de ter certas características adequadas à clonagem.
 
 
Quadro III ­ Características dos vectores de clonagem.
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CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Que atributos deverão ter as células hospedeiras destinadas à engenharia genética?
 
Algumas  estirpes  bacterianas  e  de  levedura  foram  propositadamente  desenvolvidas  para  as
experiências de DNA recombinante. A muitas destas células hospedeiras corresponde um grupo
de vectores que  tem de ser utilizado de  forma a clonar um gene com sucesso.  Isto porque nem
todos  os  vectores  de  clonagem  têm  a  mesma  origem  de  replicação  (ori).  Para  que  um  dado
plasmídeo  se  replique  nas  células,  estas  têm  de  reconhecer  o  seu  local  ori  e  aí  recomeçar  a
replicação do DNA. Por razões de segurança, as células hospedeiras não se devem reproduzir na
natureza,  o  que  reduz  a  probabilidade  de  infecções  acidentais  de  pessoas  que  trabalham  nos
laboratórios e da população em geral. Além do mais, tem de se evitar a transferência do DNA de
uma célula hospedeirapara outra, de modo a impedir a disseminação do DNA recombinante nas
populações naturais dos organismos.
 
Nas noites quentes do Sul, podem observar­se pequenos pontos de luz emitida pelo abdómen dos
pirilampos  (Photinus  pyralis).  Esta  luz  produz­se  através  da  reacção  química  catalisada  pela
enzima luciferase na presença de oxigénio, ATP e uma substância chamada «luciferina». O gene
da  luciferase  (luc)  tem  sido  um  dos  utensílios  experimentais  para  determinar  se  um  gene  foi
introduzido nas plantas. O produto génico da luciferase actua como repórter para indicar quando é
que os genes estão activos nas plantas, porque quando o estão a planta emite luz. Em biologia do
desenvolvimento acredita­se que se pode utilizar o gene da luciferase para estudar quando é que
os genes estão activos ou inactivos durante o desenvolvimento de um organismo. Além disso, a
luciferase é amplamente utilizada em química clínica e em ensaios bioquímicos de laboratórios de
microbiologia.
Até há pouco tempo, a única fonte de luciferase eram os extractos dos abdómens dos pirilampos.
O processo de extracção era fastidioso e a reserva de pirilampos muitas vezes imprevisível. Um
grupo de cientistas da Universidade da Califórnia, em San Diogo,  isolou o RNAm que codifica a
luciferase  do  pirilampo,  converteu­o  em DNA  e  clonou­o  num  plasmídeo  de E.  coli. Os  passos
envolvidos no isolamento e na clonagem do gene da luciferase do pirilampo estão representados
na  Fig.  4.  Também  se  introduziu  em  plantas  um  gene  funcional  da  luciferase  do  pirilampo.  As
células da planta expressam o gene da luciferase e a planta brilha no escuro quando se fornece
luciferina, ATP e oxigénio. Este tipo de experiência usa­se para aferir os processos de introdução
de genes úteis em cereais, como por exemplo os genes responsáveis pela fixação do azoto ou os
que lhes conferem resistência a herbicidas.
 
Figura 5­ Clonagem do gene da luciferase (luc) em Escherichia coli.
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Figura 6­ Microfotografia de E. Coli.
 
As  moléculas  de  DNA  recombinante  podem  ser  construídas  "in  vitro",  e  pode­se  isolar  uma
sequência desejada. Existem três procedimentos para obter essa sequência desejada:
 
1. As moléculas recombinantes individuais devem estar fisicamente separadas uma da outra.
2. As sequências recombinantes devem ser amplificadas para permitir material suficiente para
futuras análises.
3. fragmento especifico de interesse deve ser seleccionado por algum método que permita
obter as sequências pretendidas.
 
Em  algumas  experiências,  centenas  ou  milhares  de  fragmentos  diferentes  de  DNA  devem  ser
produzidos,  e  o  isolamento  de  uma  sequência  particular  deve  parecer  ser  quase  uma  tarefa
impossível.
O Hospedeiro é um sistema vivo estável, no qual o vector pode ser propagado.
O vector é o mensageiro do gene a clonar.
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Tipos de células hospedeiras
O tipo de células hospedeiras usadas para uma aplicação particular deve depender principalmente
do  objectivo  das  experiências  de  clonagem.  Se  o  objectivo  é  isolar  um  gene  para  uma  análise
estrutural, é mais indicado um sistema simples que seja fácil de usar. Se o objectivo é expressar a
informação genética em grandes eucariontes como as plantas, um sistema mais específico deve
ser  recomendado.  Estes  dois  objectivos  não  são  necessariamente  mutuamente  exclusivos.
Frequentemente um simples Hospedeiro primário é usado para  isolar a sequência que é depois
introduzida  dentro  de  um  sistema  mais  complexo  para  expressão.  Os  principais  tipos  de
hospedeiros estão representados no Quadro V.
 
Quadro V­ Tipos de células hospedeiras usadas para engenharia genética
Grupo Procariótica /
Eucariótica
Tipo exemplos
Bactéria Procariótica Gram ­
Gram +
Escherichia coli
Baccilus subtilis
Streptomyces spp
Fungos Eucariótica Unicelulares
Multicelular
Saccharomyces
cerevisiae
Aspergillus nidulans
Plantas Eucariótica Plastos
Células inteiras
Todo o organismo
Vários tipos
Vários tipos
Vários tipos
Animais Eucarióticas Células inteiras
Células de
mamíferos
Oocitos
Todo o organismo
Drosophila
melanogaster
Vários tipos
Vários tipos
Vários tipos
Nota : As células de animais e plantas devem ser sujeitas a manipulação em meios de cultura ou devem ser células de
um organismo inteiro. Em alguns casos as células nos meios de cultura devem ser formadas por hibridação , a partir de
células de diferentes espécies.
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Hospedeiros procarióticos
Uma célula hospedeira  ideal deve ser fácil de manipular e propagar, deve estar disponível  , com
uma grande quantidade de cadeias geneticamente definidas. A bactéria Escherichia coli preenche
estes requisitos, e é usada em muitos protocolos de clonagem.
A Escherichia  coli  tem  sido  estudada  com  grande  detalhe,  e  muitas  cadeias  diferentes  foram
isoladas pelos geneticistas microbianos, durante a  investigação dos mecanismos genéticos nos
organismos procariontes. Estes estudos  forneceram a  informação básica essencial  nos quais  a
engenharia genética é baseada.
A Escherichia coli  é  uma  bactéria Gram­  com  um  único  cromossoma  enrugado  numa  estrutura
designada nucleótido. O tamanho do genótipo é 4X10 pares de bases.
processo da expressão génica (transcrição e tradução) está ligada, com a síntese novamente de
RNAm ficando imediatamente disponível para a tradução.
Não há maturação do RNAm como acontece nas células eucarióticas. A Escherichia coli pode ser
considerada como única, como a mais simples célula hospedeira.
Muitos  dos  genes  clonados  que  são  levados  para  fora  e  usados  na  rotina  que  o  laboratório
envolve.  Os  hospedeiros  Escherichia  coli  com  muitas  cadeias  geneticamente  diferentes  estão
disponíveis para aplicações específicas.
A acrescentar à Escherichia coli, outra bactéria pode ser usada em experiências de clonagem de
genes,  como  por  exemplo,  espécies  de  Bacillus,  Pseudomonas  e  Streptomices.  Há  ,contudo,
algumas  desvantagens  nesta  células.  Frequentemente  há  poucos  vectores  apropriados  para
utilizar em cada célula e obter DNA recombinante dentro da célula pode causar problemas.
Frequentemente faz­se uma clonagem inicial na Escherichia coli , isola­se a sequência pretendida,
e depois  introduz­se o DNA puro dentro do nucleótido do hospedeiro. Muitas das desvantagens
podem ser  evitadas usando esta  aproximação,  particularmente quando são usados os  vectores
fechados .
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Hospedeiros eucarióticos
Uma desvantagem de usar um organismo como a Escherichia coli como hospedeiro de clonagem,
é que pertence a uma célula procariótica, e portanto falta a membrana nuclear (e outros organelos)
que  se  encontram  nas  células  eucarióticas.  Isto  significa  que  alguns  genes  eucarióticos  não
funcionam em Escherichia coli, onde não estão no seu ambiente normal, os quais podem enganar
o seu isolamento por selecção de mecanismos que dependem da expressão do gene.
Também, se a produção da proteína eucariótica pretende um resultado desejável em experiências
de clonagem, não deve ser  fácil assegurar que um hospedeiro procariótico produza a  totalidade
das proteínas funcionais.
Os  eucariontes  superiores  apresentam  um  tipo  diferente  de  problemas  para  a  engenharia
genética, muitos  dos  quais  requerem  soluções  especializadas.  Frequentemente  o  objectivo  das
experiências  de  clonagem  numa  planta  superior  ou  animal  é  para  alterar  as  características
genéticas  do  organismo,  de  isolar  um  gene  para  análises  seguintes  ou  para  produzir  grandes
quantidades de uma proteína particular.
A  levedura Saccharomyces  cerevisae  é  o  ser  unicelular  eucariótico  favorito  para  a  engenharia
genética. Tem sido usado à séculos Na produção da cerveja, do pão etem sido muito estudado.
organismo  é  tratado  com  as  clássicas  análises  genéticas,  e  a  taxa  de  mutação  das  células  é
avaliada. Nos termos da complexidade do genoma, Saccharomyces cerevisae tem cerca de 2x107
pares  de  bases  contido  em  17cromossomas  lineares  (3,5  vezes mais  que  a Escherichia coli),  e
algumas estirpes possuem um tipo de plasmídeo conhecido como 2m . Este plasmídeo tem 6318
pares de bases e o seu número de cópias por célula é de aproximadamente 50.
Outros fungos podem ser usados em experiências de clonagem de genes,  incluindo Aspergillus
nidulans e Neurospora crassa.
As células animais e vegetais podem também ser usadas como hospedeiros para experiências de
manipulação génica.
Algas unicelulares, Clamidomonas  reinhardtir  tem  todas as vantagens dos microrganismos pela
sua estrutura e função de células vegetais, e o seu uso em manipulações génicas cresce à medida
que é mais estudada.
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BIBLIOGRAFIA
 
 NICHOLL, Desmond S. T. (1994) ­ An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge
University Press, United Kingdom.
 
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 PURVES, William K., ORIANS, Gordon H., HELLER, H. Craig e SADAVA, David (1997) ­
Life ­ The Science of Biology, 5ª edição, Sinauer Associates, Massachusetts U.S.A.
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Webmaster Junho, 2000 Música de Fernando de Brito Vintém