Apostila de aulas práticas de Microbiologia Geral 2016

Prévia do material em texto

1 
 
Universidade Federal de Ouro Preto 
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas – ICEB 
Departamento de Ciências Biológicas - DECBI 
 
 
 
 
 
 
Apostila de Aulas Práticas 
MICROBIOLOGIA GERAL 
 
2016/2 
 
 
 
 
Professor (a):___________________________________________ 
Aluno:_________________________________________________ 
Turma:________________________________________________ 
2 
 
APRESENTAÇÃO 
 
 
A Microbiologia é uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência básica 
ou aplicada. E como ciência aplicada, podemos destacar os processos industriais, controle de doenças, 
de pragas, produção de alimentos, dentre outras. 
De forma geral, estamos lidando diretamente com a prática da microbiologia em várias 
ocasiões no cotidiano, desde a simples conservação e qualidade dos alimentos como o conhecimento 
futuro do uso de micro-organismos para fins industriais. E nesse “meio do cominho”, nos tornamos 
aptos à conhecer cientificamente esse ramos da Biologia mais profundamente, como estudante e 
futuros profissionais de diversas área da saúde. 
É nesse contexto, que torna-se imprescindível o uso da apostila. A apostila é o material de 
apoio às aulas práticas, disponibilizado aos alunos. Esta contém explicações teóricas e práticas dos 
procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e didática. 
Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o professor 
ou o monitor para te auxiliar. 
 
Bom Trabalho á Todos! 
3 
 
Sumário 
A - Normas de segurança ____________________________________________________________ 4 
B - Instruções de uso do bico de Bunsen _________________________________________________ 5 
C - Instruções de uso de microscópios___________________________________________________ 6 
PRÁTICA 1: Ubiquidade dos micro-organismos e controle do crescimento microbiano ___________ 9 
PRÁTICA 2: Preparações microscópicas a fresco _________________________________________ 15 
PRÁTICA 3: Preparações microscópicas fixadas: coloração diferencial de Gram ________________ 17 
PRÁTICA 4: Coloração diferencial de endósporos bacterianos ______________________________ 20 
PRÁTICA 5: Isolamento e identificação de bactérias Gram-positivas: Inoculação em meio de 
enriquecimento ___________________________________________________________________ 22 
PRÁTICA 6: Isolamento e identificação de bactérias Gram-positivas: Inoculação em meio 
seletivo/diferencial ________________________________________________________________ 25 
PRÁTICA 7: Isolamento e identificação de bactérias Gram-positivas: Prova da Catalase _________ 28 
PRÁTICA 8: Isolamento e identificação de bactérias gram-negativas: Inoculação em meio 
seletivo/diferencial ________________________________________________________________ 29 
PRÁTICA 9: Isolamento e identificação de bactérias gram-negativas: provas bioquímicas _______ 31 
PRÁTICA 10: Isolamento e identificação de bactérias gram-negativas: interpretação das provas 
bioquímicas ______________________________________________________________________ 34 
PRÁTICA 11: Técnica de microcultivo para observação microscópica de fungos ________________ 38 
PRÁTICA 12: Preparações microscópicas à fresco para visualização de fungos _________________ 40 
PRÁTICA 13: Antibiograma (método de Kirby-Bauer) _____________________________________ 42 
PRÁTICA 14: Titulação de vírus _______________________________________________________ 46 
 
4 
 
A - Normas de segurança 
Durante o semestre você aprenderá os métodos apropriados para a manipulação de micro-
organismos. Embora você não vá trabalhar com patogênicos, toda cultura deve ser manuseada 
com respeito e boa técnica, como se fosse um patogênico em potencial. Seguem algumas normas 
que você deverá observar para sua própria segurança, assim como a dos demais usuários do 
laboratório. 
1. Siga criteriosamente as instruções descritas em cada roteiro de aula prática. O aluno que não 
estiver com seu roteiro não poderá assistir à aula. 
2. O uso do jaleco é obrigatório em todas as aulas práticas. Seu uso é necessário para a proteção 
contra possíveis contaminações e também para se evitar danos às roupas pelo uso de corantes e 
outros reagentes. O aluno que não estiver com seu jaleco não poderá assistir à aula. 
3. Utilize sapatos fechados e roupas com comprimento adequado para se evitar a exposição a 
possíveis contaminações e acidentes. 
4. Prenda os cabelos longos durante toda a aula para se evitar acidentes durante a utilização do 
bico de Bunsen e contaminação com os materiais de trabalho. 
5. Não coma, beba, fume ou leve qualquer objeto à boca durante sua permanência no 
laboratório. 
6. Não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar acidentes, 
distrair os outros alunos e promover contaminação. 
7. Desligue celulares e quaisquer aparelhos eletrônicos de comunicação ou entretenimento. 
8. Deixe somente os materiais indispensáveis à execução do trabalho prático sobre a bancada 
(apostila de aulas práticas, lápis e caneta). Os demais materiais devem ser acomodados nas 
prateleiras, antes do início da aula, ESPECIALMENTE O CELULAR. 
9. Nunca coloque pipetas contaminadas, alça de inoculação ou qualquer outro material 
contaminado sobre a bancada. Flambe a alça de inoculação antes e após o uso. 
10. Pipetas ou ponteiras utilizadas devem ser depositadas em recipientes apropriados com 
solução desinfetante. 
11. Mantenha as culturas tampadas e apoiadas num suporte enquanto não estiverem em uso. 
5 
 
12. Limpe imediatamente qualquer respingo sobre a bancada, primeiro com papel toalha, depois 
com solução desinfetante. 
13. Notifique, imediatamente, quaisquer anormalidades e acidentes, como quedas, quebra de 
materiais ou equipamentos, contato da pele com materiais contaminados, cortes, queimaduras, 
etc. para as devidas providências. 
14. Identifique todo material a ser incubado com as seguintes informações: código da disciplina, 
turma, nome do aluno, numero da bancada e condição do experimento. 
15. Mantenha a sua bancada sempre limpa e organizada ao final da aula. 
16. Mantenha os microscópios sobre a bancada, desligados e com as lentes limpas. 
17. Nunca retire equipamentos, reagentes ou culturas microbianas do laboratório. 
18. Lave as mãos com água e sabão ao final da aula prática na pia apropriada. 
 
B - Instruções de uso do bico de Bunsen 
1. Antes de acender o Bico de Bunsen, remova os compostos inflamáveis próximos à chama. 
2. A zona estéril é localizada até 10 cm da chama azul do Bico de Bunsen; devendo todo o 
trabalho prático ser executado nesta área por trás da chama, isto é com a chama 
posicionada entre o rosto do operador e suas mãos. 
3. Antes e depois de todos os experimentos esterilize, isto é, aqueça a alça de inoculação na 
chama azul do bico de Bunsen até torná-la vermelha. Este procedimento impede que o 
experimento seja contaminado por micro-organismos exteriores. 
4. Flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a 
contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o micro-
organismo desejado será inoculado. 
 
6 
 
C - Instruções de uso de microscópios 
1. Destrave o microscópio, movimentando a trava; 
2. Gire o revólver, posicionando a objetiva de menor aumento (4x); 
3. Coloque a lâmina sobre a platina e prenda-a com a presilha (certifique-se de que a lâmina esteja 
bem encaixada); 
4. Acenda a luz do microscópio; 
5. Regule a quantidade de luz, movendo o diafragma e baixando o condensador (para organismos 
mais transparentes, diminua a luminosidade, regulando a abertura do diafragmae baixando mais 
o condensador); 
6. Levante a platina, movimentando o macrométrico e o micrométrico até o seu ponto máximo; 
7. Observando através da ocular e, utilizando o parafuso macrométrico, baixe suavemente a 
platina até que o material a ser observado possa ser visualizado em foco. Corrija a focalização 
utilizando somente o parafuso micrométrico; 
8. Encaixe a objetiva de médio aumento (10x) e faça o ajuste da focalização com o micrométrico; 
9. Observe o material, selecione uma determinada área e encaixe a objetiva de 40x, com o mesmo 
procedimento; 
9.1. Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para 
focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: 
 - Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente no 
centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para 
evitar o choque com a lamínula. 
 - Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito lentamente; 
assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com o 
micrométrico. 
 - O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a 
parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada. 
 - Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva de 
menor aumento. 
7 
 
 - Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma 
gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da objetiva; 
 - Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa, até a 
mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a 
gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem 
aparecer, complete a focalização com o micrométrico. 
10. Trave o microscópio e ajuste a focalização sempre com o parafuso micrométrico. 
11. Procure campos onde os micro-organismos exibem motilidade, utilizando os parafusos do 
“charriot”; 
12. Observe as diferenças entre os micro-organismos focalizados e desenhe-os, considerando-se o 
tamanho, a forma e a coloração. 
13. Terminada a observação, desligue a luz, gire o revólver para encaixar a objetiva de 10x, abaixe 
a platina e retire a lâmina. 
14. Posicione o microscópio na parte central da bancada e cubra-o com a sua capa. 
15. Descarte a lâmina e a lamínula nos frascos com detergente e desinfetante colocados na 
bancada. 
 
Recomendações adicionais 
- Não manuseie o equipamento com as mãos úmidas. 
- Manter a platina sempre limpa e seca. 
- Habitue-se não deixar a fonte de luz acesa quando não estiver utilizando o microscópio. 
- As lentes da objetiva nunca devem tocar a lâmina. Portanto, nunca focalize levantando a platina 
com o parafuso macrométrico e olhando pela ocular ao mesmo tempo. 
- Retire a lâmina do microscópio após o uso. Descarte as mesmas em recipiente apropriado, a ser 
indicado pelo técnico/professor(a). 
- Ao final aula, limpe a objetiva de imersão com papel toalha embebida em solução de álcool 70%. 
- Não enrole os fios dos microscópios. Apenas desconecte-o da tomada após o uso. 
- Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na 
8 
 
base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de 
trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o 
aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. 
- Quando o microscópio não estiver em uso, deverá ser desligado e guardado coberto. 
 
Figura 1. Partes Integrantes do microscópio óptico: figura obtida do endereço: http://biologia-
cell.blogspot.com.br/2010/09/introducao-biologia-celular.html 
 
 
 
 
 
 
9 
 
PRÁTICA 1: Ubiquidade dos micro-organismos e controle do crescimento microbiano 
1. INTRODUÇÃO 
Os micro-organismos são encontrados em qualquer ambiente, em suspensão ou 
assentados com a poeira em várias superfícies. O meio aquático foi provavelmente o ambiente 
original dos micro-organismos, a partir do qual se especializaram e colonizaram o ambiente 
terrestre. Além disso, os micro-organismos estão presentes nas partículas de poeira e, portanto, 
são passíveis de entrar no nosso corpo cada vez que respiramos, sendo depositados nos cabelos 
nas roupas, na pele e nas mucosas. Os micro-organismos do ar também contaminam alimentos e 
bebidas. No entanto, felizmente, na sua maioria, são inócuos ou benéficos, havendo relativamente 
poucos que causam prejuízos ao homem. O microbiologista deve estar apto a estimular e otimizar 
o desenvolvimento dos micro-organismos benéficos e combater aqueles que causam doenças ou 
deterioram os alimentos e o ambiente. 
Nesta primeira aula você deverá conhecer as normas básicas, os materiais e equipamentos 
necessários ao Laboratório de Microbiologia e terá oportunidade de verificar a presença de micro-
organismos em diferentes ambientes. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia. 
2.2 - Demonstrar a presença de micro-organismos em diferentes ambientes. 
2.3 - Verificar o poder dos desinfetantes/anti-sépticos no controle de micro-organismos. 
3. MATERIAL 
 
 Ágar nutriente estéril em placas de Petri 
 Cotonetes ou swabs estéreis 
 Bico de Bunsen 
 Solução de álcool iodado 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Demonstração da presença de micro-organismos no ambiente: 
Exponha a placa de ágar nutriente a uma condição de inoculação de sua preferência, como por 
exemplo, exposição ao ar, à pele, ao cabelo ou à respiração. 
10 
 
Ar: 
- Deixe três placas de ágar nutriente, abertas e expostas ao ar em diferentes tempos (5, 10 e 15 
minutos). Se quiser, exponha a placa em ambientes diversos como banheiro, cantina, etc. 
Mãos: 
- Com uma caneta apropriada, divida a placa de ágar nutriente em três porções. 
- Em uma das porções da placa, passe o dedo indicador em vários pontos da superfície do ágar. 
- Lave o dedo médio com água e sabão e na outra porção da placa, passe-o em vários pontos da 
superfície do ágar. 
- No dedo anelar, passe uma solução anti-séptica de álcool-iodado e após secagem, passe-o em 
vários pontos da superfície do ágar. 
Respiração: 
- Abra uma placa de ágar e inocule tossindo, soprando ou espirrando diretamente sobre ela. 
Pele, nariz e boca: 
- Com uma caneta apropriada, divida a placa de ágar nutriente em três porções. 
- Passe um swab ou cotonete na pele, ou narinas ou boca (garganta). Espalhe o material coletado 
em cada uma das porções da placa de ágar nutriente. 
Cabelo: 
- Pegue um fio de cabelo e deposite-o com cuidado sob a superfície do ágar. 
Solo: 
- Colete uma porção de material de solo e dissolva em pequena quantidade de água. Inocule, com 
a ajuda de um swab, o material diluído em uma placa de ágar nutriente. 
4.2 - Incubação das placas: 
- As placas devem ser identificadas na borda do fundo da placa com número da turma, bancada, 
data e condições de inoculação. 
- Incube as placas na estufa a 25ºC, por 7 dias (até a próxima aula). Incubar as placas invertidas 
para evitar a desidratação do meio e evitar que a água de condensação caia sob a superfície do 
meio. 
11 
 
- Após período de incubação, anotar o número, a presença e a diversidade morfológica das 
colônias microbianas que cresceram sobre a superfície do ágar. 
4.4 - Orientação para a leitura e interpretação dos resultados: 
Uma célula ou esporo de micro-organismo, em condições nutritivas favoráveis, multiplica-se e 
origina umapopulação visível macroscopicamente, denominada colônia. As características 
morfológicas mais evidentes são: 
Tamanho: 
Colônias pequenas (até 5 mm) - bactérias e fungos leveduriformes 
Colônias grandes (de crescimento irrestrito) - fungos filamentosos 
Aspecto: 
Mucóide, cremoso ou butiroso - bactérias, fungos leveduriformes 
Cotonoso aveludado, granular ou pulverulento: fungos filamentosos 
Pigmentação: 
Cor do verso - Parte em contato com o ar 
Cor do reverso - Parte em contato com o meio de cultura 
Superfície: 
Rugosa e lisa, côncava e convexa 
Uniforme e radiada 
Bordas: 
Regulares ou irregulares. 
ANEXO 1 
Material de apoio para alguns exemplares de colônias 
1. Fungos Filamentosos 
Fonte: http://www.ufrgs.br/depbiot/205/metani.htm 
12 
 
 
2. Fungos Filamentosos 
 Fonte: http://pgodoy.com/?gallery=fungos-leveduriformes 
 
 
 
3. Bacterias 
 Fonte: http://educador.brasilescola.com/estrategias-ensino/ 
 
 Fonte: http://www.infoescola.com/microbiologia/cultura-bacteriana/ 
 
Fonte: http://www.splabor.com.br/blog/estufa-de-cultura-
bacteriologica/ 
13 
 
 
14 
 
4.5 - ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
PRÁTICA 2: Preparações microscópicas a fresco 
 
1. INTRODUÇÃO 
Preparações microscópicas compreendem técnicas em que espécimes microbianos são 
depositados sobre lâminas, possibilitando a observação ao microscópio. Duas técnicas gerais 
permitem a obtenção de material adequado para o exame microscópico. Uma delas é a suspensão 
de micro-organismos em meio líquido onde podem ser examinados vivos, com o auxílio de 
corantes vitais. Na outra forma, as células microbianas são fixadas pelo calor e coradas com 
corantes químicos específicos. 
A visualização microscópica a fresco dos micro-organismos é difícil devido ao seu reduzido 
tamanho e índice de refração que se aproxima ao da água que os torna praticamente incolores 
quando suspensos em meio aquoso. No entanto, as preparações microscópicas a fresco são úteis 
para que sejam observadas a viabilidade e as atividades celulares como motilidade e divisão 
binária, além de tamanho e forma natural das células microbianas. As preparações fixadas que 
utilizam calor e exposição a substâncias químicas durante a coloração provocam distorções na 
morfologia das células. 
Nesta prática serão preparadas lâminas a fresco de amostras contendo grupos distintos de 
micro-organismos, tais como bactérias, leveduras e fungos filamentosos, coradas com corante 
vital. Pode-se observar, com esta técnica, a grande diversidade das células microbianas no 
tamanho e na forma, bem como verificar a ocorrência ou não de motilidade. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Preparar lâminas a fresco para a observação microscópica de algumas amostras de bactérias, 
leveduras e fungos filamentosos. 
2.2 - Familiarizar-se com o manuseio adequado do microscópio óptico. 
3. MATERIAIS 
 Placas de Petri da aula anterior contendo micro-organismos diversos 
 Lâminas e lamínulas 
 Alça de repicagem ou platina 
 Piceta com água destilada 
 Bico de Bunsen 
16 
 
 Corante vital azul de metileno 
 Microscópio óptico 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Limpe bem uma lâmina embebida em álcool com papel toalha e coloque sobre a lâmina limpa 
uma gota do corante azul de metileno; 
4.2 - Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen; deixe-a esfriar a 
temperatura ambiente; 
4.3 - Com o auxílio da alça de repicagem previamente flambada e resfriada, colete um pouco de 
uma colônia de micro-organismo raspando suavemente a superfície do ágar (cuidado para não 
retirar pedaços do ágar, o crescimento do micro-organismo ocorre somente na superfície); 
4.4 - Faça o esfregaço espalhando a amostra sobre o corante em cima da lâmina, fazendo 
movimentos circulares até obter uma camada uniforme na área central da lâmina; 
4.5 - Encostando uma das bordas da lamínula na gota, deixe-a descer suavemente para evitar a 
formação de bolhas de ar entre a lâmina e a lamínula; 
4.6 - Focalize conforme procedimento descrito anteriormente. 
5. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
PRÁTICA 3: Preparações microscópicas fixadas: coloração diferencial de Gram 
 
1. INTRODUÇÃO 
Nas preparações microscópicas fixadas as células microbianas são fixadas sobre lâmina, 
geralmente pelo calor. Durante esse processo os micro-organismos são mortos e ficam aderidos à 
superfície da lâmina. Assim, eles podem ser corados utilizando-se uma série de corantes químicos 
e lavagens subsequentes, permanecendo aderidos à lâmina. 
A técnica de coloração diferencial requer o uso de pelo menos três reagentes químicos, 
aplicados sequencialmente sobre o esfregaço fixado. O primeiro reagente confere cor a todas as 
células, o segundo reagente é um descorante que pode ou não remover o primeiro corante da 
célula inteira ou de algumas de suas estruturas. Essas estruturas descoradas podem aceitar ou 
assumir a cor de um segundo corante, corante de contraste. Assim, grupos de células ou suas 
estruturas podem ser distinguidos com base no corante que é retido. 
A técnica diferencial mais importante em Microbiologia é a coloração de Gram, pois separa 
as bactérias em dois grandes grupos. Estes grupos são o das bactérias Gram positivas e o das 
bactérias Gram negativas, o que é importante para o diagnóstico e classificação das bactérias. A 
técnica da coloração de Gram foi desenvolvida no final do século XIX por Hans Christian Gram, 
numa tentativa de diferenciar o patógeno Streptococcus pneumoniae das células do tecido 
pulmonar humano. 
A técnica de coloração de Gram permite a distinção de grupos bacterianos baseados na 
habilidade dos mesmos em reter certos corantes. Ao todo são utilizadas quatro soluções, as quais 
são aplicadas sequencialmente ao esfregaço do micro-organismo fixado a uma lâmina. O primeiro 
corante, cristal violeta (CV), colore as células bacterianas de roxo escuro. Em seguida é aplicada 
uma solução de Iodo (I), denominada lugol. O lugol funciona como mordente, aumentando a 
interação entre a célula bacteriana e o primeiro corante, formando um complexo insolúvel, cristal 
violeta-iodo (CV-I). A terceira solução, álcool, é então aplicada brevemente e atua como 
descolorante. Esta é a etapa crítica da técnica de coloração de Gram. As bactérias Gram-negativas 
quando lavadas com o descolorante perdem rapidamente o complexo CV-I, ficando incolores. 
Devido a diferenças de natureza química e estrutura da parede celular bacteriana, as bactérias 
Gram-positivas resistem à coloração pelo álcool, retendo o complexo CV-I, permanecendo roxas. A 
ação do álcool como removedor do complexo CV-I da célula depende da estrutura da parede 
celular bacteriana. O último reagente utilizado na coloração de Gram é corante de contraste, 
18 
 
safranina ou fucsina, que colore as bactérias Gram-negativas de rosa-avermelhado, mas não 
altera a cor roxa das bactérias Gram-positivas. 
Além da coloração de Gram, outras técnicas de coloração diferencial são também utilizadas 
para a distinção de grupos bacterianos específicos. Por exemplo, a técnica de Ziehl-Neelsen tem 
sido utilizada na identificação de micobactérias e no diagnóstico de tuberculose e lepra. 
Microbiologistas também utilizam técnicas de coloração especial que permitem a visualização de 
estruturas celulares como flagelo, cápsula, esporo e núcleo, dentre outras. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Familiarizar-se com as técnicas de coloração diferencial de células microbianas para o exame 
microscópico. 
2.2 - Diferenciar bactérias de acordo com sua resposta à coloração de Gram. 
3. MATERIAL Culturas microbianas previamente crescidas em meio líquido ou sólido 
 Fucsina ou safranina, cristal violeta, lugol (solução de iodo), álcool acetonado, óleo de imersão 
e água destilada 
 Microscópio óptico 
 Alça de repicagem 
 Lâminas 
 Bico de Bunsen 
 Óleo de imersão 
 Bandejas e suportes para lâminas 
4. PROCEDIMENTO 
 4.1 - Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen; deixe-a esfriar a 
temperatura ambiente; 
4.2 - Com o auxilio da alça de repicagem, colete uma gota do micro-organismo presente em 
cultura líquida. Se a cultura do micro-organismo não estiver em meio líquido, coloque primeiro na 
lâmina uma gota de água destilada e em seguida transfira assepticamente uma pequena porção 
de uma colônia pura para a lâmina. Prepare o esfregaço com movimentos circulares, espalhando a 
19 
 
suspensão microbiana de modo a formar uma camada fina e uniforme na área central da lâmina. 
Deixe secar ao ar; 
4.3 - Fixe o esfregaço passando-o três a seis vezes sobre a chama do bico de Bunsen (ao lado 
oposto ao que foi realizado o esfregaço). Evite o aquecimento excessivo para não queimar o 
esfregaço e não quebrar a lâmina. Deixe a lâmina esfriar ao ambiente; 
4.4 - Inicie a coloração de Gram. RESPEITE O TEMPO INDICADO PARA CADA REAGENTE: 
a) Cubra o esfregaço com o corante cristal violeta por 1 minuto; 
b) Lave utilizando-se a pisseta com água destilada; 
c) Cubra com a solução de lugol por 1 minuto; 
d) Lave o excesso de lugol com água; 
e) Lave a lâmina com solução de álcool acetonado, rapidamente, até que não se 
desprenda mais corante da preparação; 
f) Lave o excesso de álcool com água; 
g) Cubra o esfregaço com solução de safranina por 30 segundos; 
h) Lave a lâmina com água e, em seguida, deixe-a secar ao ar. 
4.5 - Observe ao microscópio óptico com objetiva de imersão (100X) de alta luminosidade, 
focalizando inicialmente com as objetivas de menor aumento. 
5. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
Desenhe todas as estruturas visualizadas e classifique as bactérias como Gram-positivas ou Gram-
negativas: 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
PRÁTICA 4: Coloração diferencial de endósporos bacterianos 
 
1. INTRODUÇÃO 
Algumas bactérias são capazes de formar células de repouso muito resistentes, 
denominadas esporos bacterianos ou endósporos. A formação de endósporos é pouco comum 
entre bactérias patogênicas. Ela ocorre, principalmente, nas espécies saprófitas do gênero Bacillus 
que apresenta apenas uma espécie patogênica, o Bacillus anthracis, agente etiológico do 
carbúnculo ou antraz. O gênero Clostridium, de bacilos Gram-positivos anaeróbios, também forma 
endósporos. Os endósporos correspondem à forma de repouso ou de resistência, não de 
reprodução bacteriana. Entretanto, quando são colocados em um meio nutritivo conveniente, 
germinam e originam a forma vegetativa. Além disso, eles são muito mais resistentes do que as 
formas vegetativas em relação aos efeitos do calor, do dessecamento, do congelamento, de 
substâncias químicas tóxicas (anti-sépticos e desinfetantes) e de radiações. A capa protéica é 
responsável pela resistência à coloração e aos agentes químicos deletérios, enquanto a presença 
de grandes quantidades de dipicolinato de cálcio é responsável pela resistência à desidratação e 
ao calor. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Familiarizar-se com técnicas de preparações fixadas e coradas de bactérias para exame 
microscópico. 
2.2 - Visualizar as formas de latência que algumas bactérias possuem (endósporos). 
3. MATERIAL 
 
 Culturas de Bacillus subtilis previamente crescida em meio ágar nutriente 
 Corantes: Verde malaquita e Safranina 
 Microscópio óptico 
 Alça de repicagem 
 Lâminas 
 Bico de Bunsen 
 Óleo de imersão 
 Bandejas e suportes para lâminas 
21 
 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Coloque uma gota de água sob uma lâmina limpa. Esterilize uma alça de repicagem, 
aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen. Deixe-a esfriar. Colete a colônia de bactéria (Bacillus 
subtilis) em meio sólido raspando levemente a superfície do ágar com alça de repicagem; 
4.2 - Prepare o esfregaço, espalhando a suspensão com a alça de repicagem, fazendo movimentos 
circulares até obter uma camada uniforme na área central da lâmina; Deixe secar um pouco ao ar; 
4.3 - Fixe o esfregaço passando três vezes o lado oposto ao que foi realizado o esfregaço da lâmina 
sobre a chama do bico de Bunsen. Evite o aquecimento excessivo para não queimar o esfregaço; 
4.4 - Coloque a lâmina sobre o suporte e cubra toda a superfície do esfregaço com o corante verde 
malaquita. Coloque a lâmina sobre a chama do bico de Bunsen por seis a dez segundos, com o 
lado em que foi realizado o esfregaço voltado para cima, até o inicio da vaporização do corante. 
Evite o aquecimento excessivo para não queimar o esfregaço ou quebrar a lamina. Deixe esfriar. 
Lave a preparação com água destilada; 
4.5 - Cubra o esfregaço com safranina por 30 segundos; 
4.6 - Lave a preparação com água destilada. Tocar as bordas com papel absorvente para remoção 
do excesso de água e deixar a lamina secar ao ar; 
4.7 - Observe ao microscópio óptico com objetiva de imersão e alta luminosidade, focalizando 
inicialmente com as objetivas de menor aumento; 
4.8 - Após observação, descarte o material no local apropriado. 
5. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
PRÁTICA 5: Isolamento e identificação de bactérias Gram-positivas: Inoculação em meio de 
enriquecimento 
1. INTRODUÇÃO 
Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso não 
faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma coloração 
diferencial. 
 A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias e 
como estas serão coradas de forma distinta. As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma 
fina camada de glicoproteína recoberta por uma espessa camada formada principalmente por 
lipoproteínas e substâncias lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa 
camada de glicoproteína. 
Os estafilococos são células esféricas Gram-positivas que habitualmente se dispõem em 
cachos irregulares semelhantes a cachos de uva. Crescem rapidamente em muitos tipos de meio 
de cultura produzindo pigmentos que variam do branco ao amarelo intenso. Alguns são membros 
da microbiota normal da pele e das mucosas de seres humanos; outros causam supuração, 
abscessos, infecções piogênicas e mesmo septicemia fatal. O tipo mais comum de intoxicação 
alimentar é causado por uma enterotoxina estafilocócica termoestável. Os estafilococos 
desenvolvem rapidamente resistência a numerosos antimicrobianos, causando, assim, problemas 
terapêuticos difíceis. 
Os estafilococos crescem rapidamente na maioria dos meios bacteriológicos, em condições 
aeróbias ou microaerófilas, com maior rapidez ainda em 37ºC, porém formam melhor o pigmento 
em temperatura ambiente de 20 a 25ºC. As colônias em meio sólido são arredondadas, lisas, 
elevadas e brilhantes. Em geral, o S. aureus forma colônias acinzentadas a amarelo-douradas 
intensas. No isolamento primário, as colônias de S. epidermidis costumam ser de cor cinza a 
branca; muitas colônias só apresentam pigmento após incubação prolongada. Ainda, os 
estafilococos mostram-se relativamente resistentes ao ressecamento, calor (suportam uma 
temperatura de 50ºC durante 30 minutos) e cloreto de sódio a 9%, porém são rapidamente 
inibidos por certas substâncias químicas, como por exemplo, hexaclorofeno a 3%. 
Os estafilococos produzem a enzima catalase, o que os diferencia dos estreptococos. Os 
Streptococcus são cocosGram-positivos que formam pares ou cadeias e apresentam-se 
amplamente distribuídos na natureza. Algumas espécies são membros da microbiota natural da 
23 
 
pele e da cavidade bucal, enquanto outras são associadas a importantes doenças humanas como, 
por exemplo, Streptococcus pyogenes e Streptococcus pneumoniae. 
2. OBJETIVOS 
1º Dia 
2.1 - Colher material clínico (nariz ou garganta) para o isolamento de Sthaphylococcus e 
Streptococcus. 
2.2 - Reconhecer o crescimento através da análise macroscópica das colônias em meios de cultura. 
2.3 - Visualizar o tipo e arranjo das células de Sthaphylococcus e Streptococcus através da 
coloração de Gram. 
2.4 - Realizar a técnica de catalase para determinar o gênero Sthaphylococcus. 
3. MATERIAL 
 Swabs estéreis 
 Tubos contendo caldo Tioglicolato 
 Lâminas de microscopia 
 Alça bacteriológica estéril e bateria de Gram 
 Placas contendo ágar Manitol Hipertônico 
 Placas contendo ágar Nutriente 
 Peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Coletar secreção da mucosa nasal de ambas as narinas ou de garganta, utilizando-se um 
“swab” estéril, fazendo movimentos rotatórios. Semear em caldo Tioglicolato, conforme mostra 
figura abaixo, incorporando na área aeróbia do meio de cultura. Identificar o tubo e incubá-lo por 
24 horas a 37º C. 
Comentários: O meio Tioglicolato é um meio de enriquecimento utilizado para teste de 
esterilidade de produtos biológicos e farmacêuticos e para cultura de aeróbios, anaeróbios 
obrigatórios e anaeróbios facultativos. Bactérias anaeróbias obrigatórias se desenvolvem no fundo 
do tubo, as anaeróbias facultativas no meio e as aeróbias na camada superficial. 
 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
Observe se houve crescimento de micro-organismos no caldo Tioglicolato, indicado pela turvação 
do meio ou presença de grumos na camada aeróbia (superior do meio de cultura). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Inóculo 
Caldo Tioglicolato 
25 
 
PRÁTICA 6: Isolamento e identificação de bactérias Gram-positivas: Inoculação em meio 
seletivo/diferencial 
 
1. PROCEDIMENTO 
1.1 - A partir do Tioglicolato previamente inoculado na aula passada e com auxílio da alça de 
repicagem, semear na superfície de uma placa de ágar Nutriente através da Técnica de Esgotamento 
por Estrias Cruzadas, o objetivo de estriar, é obter colônias isoladas. É importante não cruzar as 
estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias 
isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, 
arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria, conforme explicação abaixo. 
 
Estrias Cruzadas: 
1º) Divida a placa em quatro quadrantes.; 
2º) Espalhe o inóculo no 1° quadrante esgotando com a alça de repicagem, fazendo movimentos 
de zig-zag. Flambe novamente a alça e a resfrie encostando a alça de repicagem na superfície do 
ágar; 
3º) Gire a placa 90 graus e toque no canto (final) da estria do primeiro quadrante e deslize-a 
várias vezes, repetindo o movimento zig-zag até o outro extremo do segundo quadrante da placa. 
Flambe novamente a alça e resfrie.; 
4º) Gire a placa 90 graus e estrie no terceiro quadrante da placa, repetindo o procedimento 
anterior. 
5º) Finalmente, no quarto quadrante da placa faça estrias espaçadamente a partir do terceiro 
quadrante e depois espalhe no sentido inverso. A alça não deve tocar nenhuma das estrias 
previamente formadas. 
 
 
 
 
 
 
26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.2- Divida a placa de Ágar Manitol Hipertônico em duas. A partir do Tioglicolato e com auxílio da alça 
de repicagem, semear na superfície através da Técnica de Estrias Simples, Essa técnica é muito 
utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas 
hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio -gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos. 
 
1.3 - Prepare um esfregaço fino a partir do Tioglicolato e core pelo GRAM. 
Comentários: O ágar Manitol Hipertônico é um meio seletivo utilizado para isolar Staphylococcus a 
partir de amostras biológicas como urina, secreções, feridas, etc. O seu alto conteúdo de NaCl 
seleciona o crescimento de bactérias do gênero Staphylococcus. A fermentação ou não do manitol 
diferencia espécies do gênero. No caso de fermentação do manitol, há produção de ácido, com 
viragem do indicador de pH vermelho de fenol para amarelo (ou seja, há uma mudança da cor do 
meio de rosado a amarelo). As colônias de Staphylococcus fermentadoras de manitol (S. aureus) 
são rodeadas por uma zona amarela. Colônias não fermentadoras do manitol (ex: S. epidermidis) 
são rodeadas de uma zona vermelha. 
 
 
27 
 
2. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
- Observe se houve crescimento nas placas de ágar Nutriente e Manitol Hipertônico, indicado pela 
presença de colônias na superfície do ágar, colônias pequenas ou grandes, brilhantes ou opacas, 
bordas regulares ou irregulares, etc. 
- Diferencie as colônias quanto à pigmentação: cor branca ou amarela. 
- Observe se houve modificação da cor do meio ágar Manitol Hipertônico, de rósea para amarela 
devido a viragem do indicador de pH vermelho de fenol, resultante da fermentação do manitol. 
Quando não há utilização do manitol o meio permanece inalterado (manitol negativo). 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
PRÁTICA 7: Isolamento e identificação de bactérias Gram-positivas: Prova da Catalase 
 
A prova da catalase diferencia bactérias do gênero Staphylococcus (catalase positivo) de 
Streptococcus (catalase negativo).Se destina a verificação da presença da enzima catalase, uma 
superoxidodismutase. A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio com 
formação de água e oxigênio molecular (H2O2 + catalase à H2O + ½ O2). A prova pode ser 
efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com 
sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A verificação da produção 
dessa enzima por determinada bactéria pode ser feita adicionando-se peróxido de hidrogênio 
(H2O2 a 30%) à cultura em meio sólido ou líquido, e verificando-se desprendimento de bolhas 
gasosas (O2). Se o microorganismo produzir catalase, o resultado positivo será visto como 
desprendimento de gás sobre colônia (borbulhamento). 
1. PROCEDIMENTO 
1.1 - Semear uma colônia crescida no ágar Nutriente em lâmina. Adicione uma gota de água 
oxigenada; 
1.2 - Verifique se há a formação de bolhas (catalase positivo) ou se não há a formação de bolhas 
(catalase negativo). 
 
2H2O2 O2 + 2H2O 
2. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
CATALASE 
29 
 
PRÁTICA 8: Isolamento e identificação de bactérias gram-negativas: Inoculação em meio 
seletivo/diferencial 
1. INTRODUÇÃO 
 As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína 
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias lipídicas. 
A família Enterobacteriaceae reúne várias espécies de bastonetes Gram-negativos, 
anaeróbios facultativos, importantes para a saúde humana. Algumas como a Escherichia coli 
apresentam cepas (sorotipos) comensais da microbiota intestinal, reconhecidas como coliformes 
fecais, sendo indicadoras de contaminação fecal quando presentes em produtos para consumo, 
tais como alimentos e água potável. Outros gêneros de Enterobacteriaceae como, por exemplo, 
Salmonella, Shigella e Yersiniaapresentam espécies e sorotipos enteropatogênicos, assim como 
outros sorotipos de E. coli também considerados patógenos intestinais, e são pesquisados em 
laboratórios de análises clínicas, como suporte ao diagnóstico de diversas enfermidades entéricas. 
O meio EMB (Eosina Azul de Metileno - Eosin Methilene Blue) é um meio seletivo e 
diferencial empregado no isolamento de bactérias Gram-negativas. A seletividade do EMB é 
assegurada pela presença do azul de metileno, que inibe o crescimento de bactérias Gram-
positivas. O caráter diferencial é obtido através da leitura da fermentação da lactose. As bactérias 
que fermentam a lactose, diminuem o pH do meio alterando a cor da eosina de vermelho para 
negro (colônias negras, aspecto verde-metálico). Já as bactérias que não fermentam a lactose 
apresentam colônias da cor do meio, púrpura. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Inocular a cultura de micro-organismo em meio seletivo/diferencial. 
2.2 - Visualizar o tipo e arranjo das células da família Enterobacteriacea através da coloração de 
Gram. 
3. MATERIAL 
 
 Culturas teste de Enterobacteriacea 1, 2 e 3 
 Swabs e Bateria de Gram 
 Ágar EMB (eosina azul de metileno) 
 Lâminas de microscopia e Alça bacteriológica estéril 
30 
 
4. PROCEDIMENTO 
 4.1 - Escolha uma das culturas teste (uma por bancada). Identifique a Placa de Petri contendo ágar 
EMB; 
4.2 - Homogeneíze a cultura bacteriana em tubo. Próximo ao bico de Bunsen, insira o swab na 
cultura molhando bem e, em seguida, inocule em ágar EMB espalhando a amostra sobre toda a 
superfície até secar; 
4.3 - Incube por 24 horas a 37ºC em estufa bacteriológica; 
4.4 - Prepare um esfregaço fino em lâmina, a partir da cultura teste, e core pelo método de GRAM. 
5. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
Anote os resultados observados como forma bacteriana, tipo de agrupamento e reação tintorial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
PRÁTICA 9: Isolamento e identificação de bactérias gram-negativas: provas bioquímicas 
1. INTRODUÇÃO 
Todo micro-organismo produz alterações nos meios em que se desenvolve. Essas 
transformações são decorrentes de atividades metabólicas que, na grande maioria, são devidas à 
ação de enzimas que os micro-organismos elaboram, ou apenas modificações fisiológicas, sem 
participação enzimática. Cada micro-organismo possui em sistema enzimático específico (perfil 
bioquímico), resultando daí propriedades bioquímicas diversas utilizáveis na prática na sua 
caracterização. Em microbiologia, as provas bioquímicas consistem na verificação das 
transformações químicas que ocorrem num substrato pela ação de um determinado micro-
organismo. Elas são utilizadas como recurso auxiliar valioso na identificação dos gêneros e 
espécies microbianas. A série bioquímica consiste no crescimento do micro-organismo de 
interesse em vários tipos de meio de cultura, que possibilitam observar outras reações 
bioquímicas, além daquelas observadas nos meios presuntivos (Ágar EMB, por exemplo). 
2. OBJETIVOS 
2º Dia 
2.1 - Inocular a cultura teste em uma série de tubos para diferentes provas bioquímicas e 
descrever as alterações produzidas nos meios pelos micro-organismos decorrentes do seu 
metabolismo. 
3. MATERIAL 
 Culturas teste de Enterobacteriacea 1, 2 e 3 
 Alça bacteriológica estéril 
 Bateria de provas bioquímicas 
 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Teste de Glicose 
Princípio: Determinar a capacidade de um micro-organismo de fermentar a glicose incorporada a 
um meio base, podendo produzir ácido ou ácido com gás. 
Técnica: A inoculação da cultura teste deve seguir as normas de semeadura em meio de cultura 
líquida com alça bacteriológica. Incubar por 18 a 24 horas a 35-37ºC em estufa bacteriológica. 
32 
 
4.2 - Teste de Lactose 
Principio: Determinar a capacidade de um micro-organismo de hidrolisar a lactose incorporada a 
um meio base com produção de ácido. 
Técnica: A inoculação da cultura teste deve seguir as normas de semeadura em meio de cultura 
líquida com alça bacteriológica. Incubar por 18 a 24 horas a 35-37ºC em estufa bacteriológica. 
4.3 - Teste de Produção de Uréase (reação para verificar a utilização da uréia como única fonte de 
nitrogênio) 
Principio: Determinar a habilidade de um micro-organismo em degradar, enzimaticamente, a uréia 
pela uréase, com a formação de duas moléculas de amônia. Para esta reação, dispõe-se de um 
meio sólido em tubo contendo uréia como única fonte de nitrogênio e um indicador de pH (por 
exemplo, vermelho de fenol, que em meio alcalino é vermelho e em meio ácido é amarelo). 
Técnica: A inoculação da cultura teste deve seguir as normas de semeadura em meio inclinado 
com alça bacteriológica, fazendo estrias na superfície do ágar. Incubar por 18 a 24 horas a 35-37ºC 
em estufa bacteriológica. 
4.4 - Teste de Citrato (reação para verificar a utilização de citrato de sódio como única fonte de 
carboidrato por via oxidativa) 
Principio: Determinar se um micro-organismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de 
carbono para seu crescimento. Para essa reação, dispõe-se de meio sólido em tubo contendo 
citrato como única fonte de carbono, além de fosfato de amônio e um indicador de pH (ex: azul de 
bromotimol, que em meio alcalino é azul e em meio neutro é verde). 
Técnica: A inoculação da cultura teste deve seguir as normas de semeadura em meio inclinado 
com alça bacteriológica, fazendo estrias na superfície do ágar. Incubar por 18 a 24 horas a 35-37ºC 
em estufa bacteriológica. 
4.5 - Teste de produção de ácido sulfídrico (H2S) 
Principio: Determinar a liberação de ácido sulfídrico (H2S) por ação enzimática nos aminoácidos 
sulfurados (cisteína), produzindo uma reação visível de cor negra. Para esta reação, usa-se meio 
contendo fonte protéica com aminoácidos providos de enxofre. A capacidade bioquímica da 
bactéria de utilizar estes aminoácidos é verificada pela sua produção de ácido sulfídrico que, em 
presença do acetato de ferro do meio, forma um precipitado negro. 
33 
 
Técnica: A inoculação da cultura teste deve seguir as normas de semeadura em meio de cultura 
sólido em tubo (picagem profunda) com agulha bacteriológica, a inoculação deverá ter a 
profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma única picada. Incubar por 18 a 24 
horas a 35-37ºC em estufa bacteriológica. 
4.6 - Pesquisa de motilidade 
Principio: Para esta reação, utiliza-se um meio de cultura semi-sólido em tubo, no qual a cultura é 
inoculada com agulha por picada até a metade do tubo (mesmo tudo usado na prova do ácido 
sulfídrico). 
34 
 
 
PRÁTICA 10: Isolamento e identificação de bactérias gram-negativas: interpretação das provas 
bioquímicas 
1. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
3º Dia 
1.1 – Teste de glicose 
Resultado Cor do Meio Interpretação 
 
 
Positivo 
Amarelo sem bolhas no tubo 
de Durham 
Amarelo com bolhas no tubo 
de Durham 
Presença de ácidos sem 
produção de gases 
Presença de ácidos com 
produção de gases 
Negativo Rosa Ausência de fermentação 
 
Interpretação: Todas as bactérias que fermentam a glicose liberam ácido como produto final e 
algumas liberam gás, além dos ácidos. As bactérias que produzem gás possuem a enzima formiase, 
que degrada o ácido fórmico. 
Glicose ácido ou ácido + gás 
 
Gás: ácido fórmico H2 + CO2 
1.2 – Teste de lactose 
Resultado Cor do Meio Interpretação 
Positivo Amarelo Presença de ácido 
Negativo Rosa Ausência de ácido 
 
Interpretação: O micro-organismo que possui a enzima lactase tem a capacidade de desdobrar a 
lactose em D-glicose e D-Galactose e, com a fermentação desta última, liberar ácidos. 
formiase 
35O micro-organismo que não possui a enzima lactase não libera ácidos e degrada a peptona 
existente no meio, portanto resta no meio NH3. Ora, sabemos que NH3 é uma base e que, na 
presença do indicador, há a viragem deste para pH alcalino. 
Os dissacarídeos são muito complexos para entrar numa célula bacteriana para a sua degradação. 
Então são catabolizados em monossacarídeos menos complexos por enzimas exocelulares 
(hidrolases), de maneira que possam penetrar nas células, com exceção da lactose, que possui 
uma enzima, a galactose permeasse, que transporta a lactose para dentro da célula bacteriana e, 
depois, então, é hidrolisada. 
 
Lactose D-glicose + D-galactose 
 (β-galactosidase) 
 Ácidos 
1.3 - Teste de Produção de Uréase (reação para verificar a utilização da uréia como única fonte de 
nitrogênio) 
Resultado Cor do Meio Interpretação 
Positivo Rosa Meio alcalino 
Negativo Amarelo Meio ácido 
Interpretação: O teste positivo (rosa-escuro) significa que a bactéria possui a enzima uréase, que 
hidrolisa a uréia em amônia, alcalinizando o meio e virando o indicador de pH vermelho-de-fenol 
de amarelo (pH = 6,8) para rosa-escuro (pH = 8,0). No teste negativo, o meio permanece amarelo, 
mas com crescimento porque a bactéria se utiliza da peptona presente no meio. 
1.4 - Teste de Citrato (reação para verificar a utilização de citrato de sódio como única fonte de 
carboidrato por via oxidativa) 
Resultado Cor do Meio Interpretação 
Positivo Azul Meio alcalino 
Negativo Verde Meio neutro sem 
crescimento 
 
lactase 
36 
 
Interpretação: As bactérias que utilizam o citrato como única fonte de carbono terão resultado 
positivo cor azul (pH alcalino), que é um produto do metabolismo do sal inorgânico acrescentado 
no meio, pois o produto do metabolismo do citrato é difícil de detectar, porque são dois sais. 
Então saberemos que o citrato foi metabolizado, pelo produto do metabolismo do sal inorgânico 
de amônia, pois neste meio foi colocada uma fonte de carbono que é citrato, e uma de nitrogênio, 
que é um sal inorgânico de amônia. O teste negativo será verde e sem crescimento, pois a 
bactéria, não conseguindo utilizar a fonte de carbono e nitrogênio do meio, não sobreviverá. 
Indicador de pH azul de bromotimol: Ácido - coloração amarela (pH = 6,0); Alcalino - coloração azul 
da Prússia (pH = 8,4) e meio não inoculado - coloração verde (pH = 6,9). 
1.5 - Teste de produção de ácido sulfídrico (H2S) 
Resultado Cor do Meio Interpretação 
Positivo Negro Presença de H2S 
Negativo Amarelo Ausência de H2S 
 
Interpretação: O teste positivo de cor negra significa que a bactéria possui a enzima cisteína 
dissulfidrilase ou tiossulfato redutase, que age sobre os substratos específicos, produzindo gás 
sulfídrico, o qual reage com íons férricos presentes no meio, produzindo sulfeto ferroso, que 
precipita uma coloração negra. O teste negativo, o meio de cultura permanece amarelo, porque 
não existe ácido sulfídrico para reagir com íons férricos. 
1.6 - Pesquisa de motilidade 
Pode-se observar a motilidade da bactéria, através do crescimento desta em toda a extensão do 
meio (com motilidade), ou somente no local da picada (sem motilidade). 
Para identificação do micro-organismo isolado, comparar os resultados obtidos com a tabela 
abaixo na qual estão representados os gêneros e principais espécies da família 
enterobacteriaceae, e suas respectivas reações bioquímicas. 
BACTÉRIA ISOLADA: ___________________________________________________________ 
Anotações: 
 
 
37 
 
 
 
38 
 
PRÁTICA 11: Técnica de microcultivo para observação microscópica de fungos 
1. INTRODUÇÃO 
Os fungos são organismos heterotróficos, geralmente aeróbios e adaptados a ambientes 
diversos, onde podem existir como saprófitas, parasitas ou simbiontes. Como saprófitas, os fungos 
degradam a matéria orgânica, transformando-a em formas químicas simples que retornam ao 
solo. Como parasitas, podem causar doenças em animais e vegetais, ocasionando assim um 
grande impacto às atividades agrícolas e de saúde. Como simbiontes, podem existir em associação 
com outros organismos, tais como as algas, formando os liquens, ou raízes das plantas formando 
as micorrizas. 
Ainda, os fungos são ubíquos, encontrando-se no solo, na água, nos vegetais, em animais, 
no homem e em detritos em geral. O vento age como importante veículo de dispersão de seus 
esporos e fragmentos de hifa. Os fungos podem se desenvolver em meios de cultivo especiais, 
formando colônias de dois tipos: leveduriformes e filamentosas. As colônias leveduriformes são 
pastosas ou cremosas, formadas por micro-organismos unicelulares que cumprem as funções 
vegetativas e reprodutivas. As colônias filamentosas podem apresentar formas de algodão, 
aveludadas ou pulverulentas; são constituídas fundamentalmente por elementos multicelulares 
em forma de tubo, as hifas. Ao conjunto de hifas, dá-se o nome de micélio. 
Nos métodos utilizados para o isolamento e cultivo de fungos geralmente empregam-se 
meios sólidos acidificados, com pH em torno de 4 a 5, com o objetivo de inibir o crescimento de 
bactérias. As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema importância, 
uma vez que a identificação dos micro-organismos isolados depende, em grande parte, do 
conhecimento de suas características morfológicas (tais como tipo de micélio e de esporos). 
A classificação dos fungos filamentosos baseia-se, principalmente, no tipo de micélio 
vegetativo que o fungo apresenta, isto é, cenocítico (asseptado) ou apocítico (septado), e na 
presença de estruturas de reprodução sexuada e assexuada. No microcultivo, a cultura de fungo 
cresce na lâmina e na lamínula, aparecendo os órgãos bem separados e intactos quando se retira 
o bloco de ágar, permitindo assim o estudo minucioso da micromorfologia. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Visualizar o crescimento de fungos micelianos em meio de cultura 
2.2 - Familiarizar-se com a técnica do microcultivo para a identificação de fungos. 
39 
 
3. MATERIAL 
 Micro-organismos: fungos previamente crescidos em meios de cultura ou amostras obtidas de 
diferentes fontes (frutas, pães, queijos, grãos, etc.) 
 Placa de Petri fechada e estéril contendo o seguinte aparato: suporte de vidro, lâmina para 
microscopia, fragmento de ágar Sabouraud, lamínula, algodão. 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Próximo à chama do bico de Bunsen, inocule na porção mediana de cada lado do fragmento 
de ágar uma amostra do fungo que se deseja cultivar, fazendo uma pequena perfuração nas 
bordas do fragmento de ágar com a agulha de repicagem; 
4.2 - Após inoculação do fungo, cubra o fragmento do ágar com a lamínula; 
4.3 - Umedeça o algodão do interior da placa de Petri e feche a placa adequadamente; 
4.4 - Incube a placa à temperatura ambiente durante uma semana. 
40 
 
PRÁTICA 12: Preparações microscópicas à fresco para visualização de fungos 
2º Dia 
 
PROCEDIMENTO 
 
1.1 - Em uma nova lâmina, deposite uma gota de azul de lactofenol ou azul de metileno; 
1.2 - Retire a lamínula do microcultivo e deposite-a sob a lâmina contendo o corante; 
1.3 - Observe ao microscópio óptico nas objetivas de 4X, 10X e 40X; 
1.4 - Desenhe as estruturas observadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
ANEXO 3 
Material de apoio para identificação de algumas estruturas fúngicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Procedimento para visualização microscópica de fungos leveduriformes 
2.1- Para visualização das levedurasdo fermento do pão, coloque antes sobre uma lâmina limpa 
uma gota de azul de metileno e em seguida uma gota da suspensão de leveduras (para evitar a 
contaminação do corante com o microrganismo) e espalhe o inóculo; 
2.2 - Observe ao microscópio óptico nas objetivas de 4X, 10X e 40X; 
2.3- Desenhe as estruturas observadas. 
 
 
 
 
 
 
 Rhyzopus sp Aspergillus sp Penicilium sp 
42 
 
PRÁTICA 13: Antibiograma (método de Kirby-Bauer) 
1. INTRODUÇÃO 
Antibióticos são definidos como compostos químicos produzidos por micro-organismos, 
capazes de ocasionar a morte ou inibição do crescimento de outros micro-organismos. Fungos e 
bactérias caracterizam-se como os principais produtores de agentes antimicrobianos. Além da 
síntese biológica, alguns desses compostos podem também ser produzidos por síntese química. 
Agentes químicos, naturais ou sintéticos, utilizados para o tratamento de doenças infecciosas são 
denominados genericamente de agentes antimicrobianos. 
Para a utilização de antibióticos para fins clínicos, é necessário considerar algumas 
características importantes, tais como: seletividade, espectro de ação, seleção de resistentes, 
solubilidade, efeitos na microbiota normal do trato intestinal, dentre outras. A determinação “in 
vitro” da resistência ou sensibilidade de uma bactéria a um ou a vários antibióticos recebe o nome 
de “antibiograma”. Esta técnica pode também ser usada para a determinação do espectro de ação 
de um novo antibiótico ou para definição da sua dosagem biológica, por meio da determinação da 
concentração inibitória mínima (CIM). Em qualquer dessas situações é necessária a utilização de 
técnicas padronizadas e bactérias cujo grau de sensibilidade seja estável e bem conhecido. 
O antibiograma pode ser realizado por meio de duas metodologias: diluições seriadas em 
tubos ou placas ou por difusão em meio sólido (método de Kirby-Bauer). A rotina laboratorial mais 
utilizada é a difusão em meio sólido, utilizando-se discos de papel de filtro, previamente 
impregnados com tipos e/ou doses conhecidos do antibiótico, e colocados em contato com a 
bactéria inoculada na superfície do meio. A análise do grau de sensibilidade ou resistência da 
bactéria está relacionada com o diâmetro das zonas de inibição formadas em torno dos discos de 
papel impregnados com os antibióticos, após 16 a 18 horas de incubação. 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Avaliar a amplitude da atividade antimicrobiana de alguns antibióticos selecionados. 
2.2 - Executar o antibiograma pelo método de Kirby-Bauer para a determinação da sensibilidade 
de bactérias a antibióticos. 
 
 
 
43 
 
3. MATERIAL 
 Culturas de Escherichia coli (Gram -) e Sthaphylococcus aureus (Gram +), crescidas por 24h 
 Ágar Mueller Hinton 
 Swabs 
 Bico de Bunsen 
 Pinça 
 Discos de filtro com antibióticos 
4. PROCEDIMENTO 
4.1 - Executar, por bancada, um antibiograma com uma bactéria Gram-negativa ou uma Gram-
positiva pela técnica de difusão em meio sólido; 
4.2 - Homogeneíze a cultura contendo a bactéria e embebeda o swab com a cultura; 
4.3 - Semeie o swab por toda placa contendo ágar Mueller Hinton; 
4.4 - Selecione alguns discos de papel contendo concentrações conhecidas de antibióticos e, com 
auxílio de uma pinça previamente flambada, transfira os discos para a superfície do meio de 
cultura inoculado, deixando certa distância entre os discos; Cuidado: não pressione os discos de 
papel no meio de cultura! Incube as placas por 16 a 18 horas a 37ºC. 
Observações O método descrito aqui se refere a patógenos de crescimento rápido e não deve ser 
aplicado a micro-organismos de crescimento lento, para os quais os critérios dos diâmetros dos 
halos não são apropriados. 
 Para servir como orientação terapêutica, o antibiograma deve predizer a provável eficácia in 
vivo dos agentes antimicrobianos. A variação do tamanho dos halos para fins de previsão é o 
resultado da correlação dos diâmetros dos halos com a experiência clínica com o antibiótico. Para 
propósito de interpretação, é conveniente dividir os tamanhos dos halos em 3 categorias: 
sensíveis, intermediários ou resistentes. 
 - Sensíveis: a bactéria é sensível a doses comuns do antibiótico 
 - Intermediário: a bactéria é sensível somente com altas doses do antibiótico 
 - Resistente: não é provável que as bactérias respondam à terapêutica com o antibiótico 
 
44 
 
Avalie o crescimento microbiano nas placas. O crescimento deve ser contínuo; se apenas colônias 
isoladas estiverem presentes, o inoculo foi muito diluído e o teste deve ser repetido. 
Meça e anote o diâmetro de cada halo (incluindo o diâmetro do disco). Preferencialmente, leia na 
parte inferior da placa, sem remover a tampa, usando uma régua. 
5. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS 
Interprete os resultados de acordo com os dados da Tabela abaixo. 
Bactéria utilizada: 
Antimicrobiano Diâmetro do halo (mm) Interpretação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Região onde o micro-organismo cresceu normalmente 
Ausência do halo de inibição do crescimento 
microbiano; antibiótico não foi eficaz contra o micro-
organismo 
Halo de inibição do crescimento microbiano 
45 
 
 
46 
 
 
PRÁTICA 14: Titulação de vírus 
1. INTRODUÇÃO 
A multiplicação de um vírus numa célula hospedeira é um fenômeno avaliado 
indiretamente pela lise da célula. Esta lise pode ser observada macroscopicamente em cultura de 
bactérias E. coli sobre placas de ágar ou em culturas de células de mamífero em monocamadas. 
Quando se adiciona o vírus a uma monocamada de células sensíveis, acontece a adsorção do 
vírus através da interação de receptores celulares com proteína(s) específica(s) da superfície viral. 
Essa é a primeira fase do processo de multiplicação. A seguir, ocorre internalização do vírus no 
citoplasma, sendo o ácido nucléico liberado, num processo chamado desnudamento viral. Segue-se a 
replicação do ácido nucléico, a biossíntese de componentes virais e, finalmente, a morfogênese ou 
montagem dos novos vírus. Por último, a célula libera os novos vírus, completando a fase de 
multiplicação. A duração do processo (1 ciclo viral) varia de acordo com o tipo de vírus, tipo de célula 
e com o número de partículas que iniciam a infecção (carga viral). Após esse primeiro ciclo de 
multiplicação ainda podem existir células não infectadas, as quais serão também atacadas num 
processo contínuo progressivo até a destruição completa da população susceptível. Com 48 horas ou 
mais (de acordo com o sistema), observa-se a formação de áreas de lise translúcidas e circulares na 
monocamada celular, que são chamadas de placas de lise. 
Diversas técnicas em virologia requerem o conhecimento preliminar da concentração viral das 
suspensões a usar. É importante, portanto, saber o número de unidade infecciosa por unidade de 
volume de suspensão. E, para isso, é a partir da técnica de Titulação Viral que é possível quantificar o 
número de partículas infecciosas presentes numa suspensão viral. 
Esta técnica baseia-se no princípio de que um vírus, ao infectar uma célula e ao ser transmitido 
às células vizinhas, irá provocar a morte a essas células. Estas células mortas serão visualizadas, após 
adição de um corante vital (vermelho neutro). As células susceptíveis ao vírus a titular são postas em 
cultura em um meio semi-sólido e então, utilizadas quando tiverem numa densidade correspondente 
à sub-confluência, aproximadamente sete dias. 
A titulação pelo método da contagem do número de placas é um dos métodos mais 
sensíveis e precisos para determinar o número departículas virais infectantes presentes em uma 
amostra. Fazendo-se uma diluição seriada em escala de 10 da amostra de vírus a ser titulada (em 
uma solução salina ou no próprio meio de cultura) e adicionando-se volume conhecido dessa 
diluição em uma monocamada de células, considera-se que cada uma das placas de lise 
47 
 
observadas é o resultado da multiplicação iniciada por um único vírus que se espalhou para as 
células vizinhas. Cada placa de lise é chamada de Unidade Formadora de Placa (UFP). 
2. OBJETIVOS 
2.1 - Demonstrar a titulação de um vírus humano pelo método da contagem das unidades 
formadoras de placas (UFP). 
3. MATERIAIS 
 Placas de seis câmaras contendo monocamadas celulares infectadas. 
4. PROCEDIMENTO (apenas demonstrativo) 
4.1 - Marque, em cinco microtubos esterilizados, as diluições 10-1 a 10-5. Marcar com C- (controle 
negativo) no sexto tubo; 
4.2 - Coloque 0,9 ml de meio de cultura em todos os tubos; 
4.3 - Ao tubo marcado 10-1 acrescente 0,1 ml do vírus. Homogeneíze bem agitando o tubo em 
vórtex; 
4.4 - Transfira 0,1 ml do tubo 10-1 para o tubo 10-2. Homogeneíze bem e continue diluindo o vírus 
até o tubo 10-5; 
 
4.5 - Transfira 0,1 ml de cada diluição de vírus para as câmeras da placa previamente identificadas; 
4.6 - Incube por 1 hora a 37º C, para adsorção viral, agitando levemente de 10 em 10 minutos; 
4.7 - Após adsorção, lave a monocamada de células com PBS (1X) para retirar as partículas virais 
que não adsorveram; 
4.8 - Acrescente mais 1 ml de meio por câmera na placa e incubar em estufa a 37ºC por 48 horas 
para a multiplicação do vírus; 
4.9 - Retire a placa da estufa; 
10-1 10-2 10-3 10-4 
48 
 
4.10 - Fixe com formol 10% e core com cristal violeta; 
4.11 - Conte o número de UFP em cada diluição. 
Observações: 
A presença do vírus é indicada pelas áreas de lise (morte celular por vírus). Essas áreas, 
denominadas "placas de lise" são circulares e resultantes de diversos ciclos de multiplicação viral, 
iniciados a partir de um único vírus em uma célula infectada. Nas câmeras de diluição mais baixa, 
as zonas de lise mostram-se confluentes (morte de todas as células de toda a monocamada). Nas 
câmeras de diluições mais altas (menor concentração de vírus), já é possível verificar placas de lise 
isoladas e contáveis. Observe que o número de placas é menor nas diluições mais elevadas. 
COMO QUANTIFICAR OU CALCULAR O TÍTULO DO VÍRUS: 
Selecionar câmeras que permitem uma contagem real e significativa; normalmente variável entre 
30 e 300, e que tenha o maior número placas isoladas e contáveis. Contar o número das UFP. O 
título será expresso em UFP/ml, sendo igual ao número de placas contadas, multiplicado pelo 
inverso da diluição utilizada, corrigido para ml (ou seja, X10), já que o volume inoculado das 
diluições foi 0,1 ml. 
Exemplo: Tome a placa de seis câmeras já infectada, fixada e corada e contendo vírus a ser 
titulado e determine o título de vírus por ml dessa amostra. 
4. ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS