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ENZIMAS UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MATO GROSSO DO SUL UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE DOURADOS CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Profa. Msc. Cinthia Ap. de Andrade Silva aparecidasucro@uems.br ENZIMAS • São proteínas especializadas na catálise de reações biológicas, ou seja, elas proporcionam que as reações químicas tornem-se muito mais rápidas que a reação não catalisadas ou catalisadas quimicamente 2 • Aceleram reações químicas Ex: Decomposição do H2O2 H2O2 H2O O2 + Catalase Condições da Reação Energia livre de Ativação KJ/mol Kcal/mol Velocidade Relativa Sem catalisador Platina Enzima Catalase 75,2 18,0 48,9 11,7 23,0 5,5 1 2,77 x 104 6,51 x 108 ENZIMAS 3 • Atuam em pequenas concentrações 1 molécula de catalase decompõe 5.000.000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min • Não são consumidas na reação ENZIMAS 4 • Catálise biológica fim séc. XVIII – digestão da carne: estômago; – digestão do amido: saliva. • Década de 1850 – Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas • Eduard Buchner (1897) – extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool; – enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva. HISTÓRICO DAS ENZIMAS 5 • James Sumner (1926) – Isolou e cristalizou a urease; – Cristais eram de proteínas; – Postulou que “todas as enzimas são proteínas”. • John Northrop (década 1930) – Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas. • Década de 1950 – 75 enzimas isoladas e cristalizadas; – Ficou evidenciado caráter proteico. • Década de 1980 Foram identificadas moléculas de RNA que possuem atividade catalítica, as ribozimas. 6 HISTÓRICO DAS ENZIMAS • As enzimas aceleram a velocidade da reação por diminuir sua energia de ativação, que é energia necessária para levar o substrato ao estado de ativação energética (molécula em transição entre o substrato e o produto). ATUAÇÃO DAS ENZIMAS 7 8 • Quando se eleva a temperatura de um sistema, as moléculas, no seu conjunto, adquirem um conteúdo energético maior, mas é respeitado o mesmo padrão de distribuição de energia entre elas. 9 A velocidade das reações pode ser aumentada pelo: aumento do número de moléculas (a), aumento da temperatura (b) e com a diminuição da energia de ativação (c) 10 RNA Estrutura Enzimática Ribozimas Se covalente Apoenzima ou Apoproteína Holoenzima Cofator Proteína Pode ser: • íon inorgânico • molécula orgânica Coenzima Grupo Prostético Cofator ESTRUTURA DAS ENZIMAS 11 12 • Adição do sufixo “ASE” ao nome do substrato: Ex: - gorduras (lipo - grego) – LIPASE - amido (amylon - grego) – AMILASE • Nomes arbitrários: - Tripsina e pepsina – proteases NOMENCLATURA DAS ENZIMAS 13 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS 14 CLASSE 1 - Oxirredutases: catalisam reações onde há troca de elétrons (oxi-redução). • Desidrogenases: facilita a transferência de hidrogênio. • Desaturases: formação de ligação dupla em ácido graxo. • Hidroxilases: facilita a oxidação de dois doadores com a incorporação de oxigênio em um dos doadores. • Oxidases: há a redução do oxigênio molecular • Oxigenases: há a adição de oxigênio em uma molécula • Redutase: uma hidrogenase que reduz o substrato. 15 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS CLASSE 2 - Transferases: transferência de grupos de uma molécula para outra. • Quinases: transfere grupos de alta energia. • Mutases: move grupo de um ponto para o outro da molécula • Fosforilases: quebra de uma ligação C—O pela adição de Pi. • Polimerases: reações de adição de uma unidade de polimerização. • Transaldolases: transfere um grupamento aldeído de um substrato para outro. • Transcetolases: o grupamento cetona é movido de uma molécula para outra. • Transaminases (aminotransferase): transfere um grupamento amino de um aminoácido para um cetoácido. 16 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS CLASSE 3 - Hidrolases: quebra moléculas por hidrólise. • Esterases: hidrolisa um éster em álcool e ácido. • Lipases: promovem a quebra de ligações ésteres entre um ácido graxo e o glicerol. • Nucleosidases: degrada nucleosídeos em base nitrogenada + ribose. • Nucleotidases: degrada nucleotídeos em nucleosídeos + Pi. • Peptidases: quebra de ligações peptídicas. • Fosfatases: hidrólise de ésteres, liberando Pi. • Sulfatases: hidrólise liberando sulfato. 17 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS CLASSE 4 - Liases: corta ou sintetiza ligações C—C, C— O e outras, por reações que não oxidação ou hidrólise e sem envolvimento de reações de transferência de grupamentos de uma molécula para outra. • Aldolases: forma ligação C—C após a ligação de um aldeído ou cetona com outro composto bioquímico. • Descarboxilases: catalisa a remoção de CO2. • Hidratases: liberação de água durante a formação do produto. • Sintases: catalisa uma síntese onde não há gasto de ATP. 18 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS CLASSE 5 – Isomerases: formação de isômeros. • Epimerases: promove a interconversão de epímeros. • Mutases: transferência de grupamentos em uma mesma molécula formando isômeros. • Racemases: formação de isômeros especulares inversos. CLASSE 6 - Ligases: união de duas moléculas acopladas à quebra de ATP. • Carboxilases: adição de CO2. • Sintetases: ligação de duas moléculas com quebra de pirofosfato (P—P). 19 ESQUEMA DE UMA REAÇÃO ENZIMÁTICA - TRANSFERASE 20 LIGAÇÃO DE UM SUBSTRATO A UMA ENZIMA NO SÍTIO ATIVO 21 • Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou Chave-Fechadura, que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato. TEORIAS DE MODELOS REACIONAIS 22 • Daniel Koshland (1958): Ajuste Induzido, enzima e o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição. TEORIAS DE MODELOS REACIONAIS 23 (a) O sítio ativo da enzima tem estrutura espacial específica; (b) a ligação com o substrato ajusta a conformação enzimática, tornando-a ideal para a catálise INTERAÇÃO ENZIMA SUBSTRATO 24 COMPLEMENTARIDADE ESPACIAL E QUÍMICA ENTRE ENZIMA E SUBSTRATO 25 FATORES QUE ALTERAM A ATIVIDADE DE UMA ENZIMA E + S ES E + P • Fatores decorrentes da natureza protéica das enzimas - pH - temperatura • Fatores decorrentes da formação do complexo ES - concentração do substrato - concentração da enzima - afinidade da enzima pelo substrato • Presença de inibidores 26 INFLUÊNCIA DO PH DO MEIO SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA • Condições fixas de: - temperatura - [substrato] - [enzima] Cada enzima tem seu pH ótimo pH ótimo pH 27 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA DO MEIO SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA Ativação térmica Desnaturação térmica Temperatura ótima • Condições fixas de: - pH (ótimo) - [substrato] - [enzima] 28 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA • Condições fixas de: - temperatura (ótima) - pH (ótimo) - [substrato] em excesso [E] 29 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA• Condições fixas de: - temperatura (ótima) - pH (ótimo) - [enzima] [S] 30 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA E E E E S + E E E E S E E E E P P + Baixa [substrato] Formação do produto é proporcional à concentração de substrato 31 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA [Substrato] em excesso S S S S S S S S + E E E E E E E E S S S S E E E E + P P P P P P P P S S S S S S S S Velocidade da reação independe da [S] 32 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA Em baixas concentrações de substrato a velocidade de reação é de primeira ordem – isto é, é proporcional a concentração de substrato Em altas concentrações de substrato, a velocidade da reação é de ordem zero – isto é, é constante e independente da concentração de substrato [S] V e lo c id a d e d a r e a ç ã o Cinética de 1a ordem Cinética de ordem zero 33 AS ENZIMAS PODEM FICAR SATURADAS PELO SUBSTRATO Baixa [S] Velocidade é proporcional a [S] Velocidade independe da [S] Alta [S] excesso de S 34 PODER CATALÍTICO DAS ENZIMAS • Capacidade de converter substrato em produto em unidade de tempo – QUIMIOTRIPSINA - 1,9 x 102 mol/s – ANIDRASE CARBÔNICA - 1 x 106mol/s NÚMERO DE RENOVAÇÃO (TURNOVER NUMBER) nº de mols de substrato convertido em produto por mol de enzima em unidade de tempo 35 Poder catalítico Nº de renovação Velocidade máxima da reação PODER CATALÍTICO DAS ENZIMAS 36 UNIDADES ENZIMÁTICAS • Unidade Internacional – nº de mols de substrato transformado ou produto formado por mL de solução por minuto em pH e temperatura padronizados UI= M/mL/min ou UI= M mL-1 min-1 • Katal – nº de mols de substrato transformado ou produto formado por L por segundo em pH e temperatura padronizados K=M/L/s ou K=ML-1 s-1 • Arbitrária – estabelecida pelo pesquisador 37 ATIVIDADE ENZIMÁTICA • Depende também: – presença e concentração do cofator – poder catalítico da enzima • capacidade da enzima de transformar o substrato ligado ao complexo ES em produto por unidade de tempo ES E + P – afinidade da enzima pelo substrato (Km) • maior ou menor capacidade da enzima de se ligar ao substrato E + S ES afinidade da enzima pelo substrato (Km) 38 INTRODUÇÃO À CINÉTICA ENZIMÁTICA Estudo da velocidade da reação (V): S P V Quantidade de produto formado Quantidade de substrato transformado (em unidade de tempo) Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada Pode ser medido por: 39 CINÉTICA ENZIMÁTICA Leonor Michaelis Maude Menten Representaram uma reação enzimática em 2 etapas Após curto tempo - estado estacionário ou estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é alcançado constantes de velocidade E + S ES E + P k 1 k -1 k 2 40 Estado estacionário ou estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] Variação das concentrações dos componentes da reação enzimática em função do tempo. O intervalo 0 – t1 é muito pequeno. Após o tempo t1 estabelece-se o equilíbrio entre E, S e ES, cujas concentrações permanecem aproximadamente constantes até o tempo t2. A concentração do produto cresce sempre; a concentração do substrato, a rigor, diminui mas pode ser considerada constante face à sua enorme concentração em comparação à da enzima, do complexo ES e do produto. Entre t1 e t2 está o tempo inicial, durante o qual a velocidade inicial (v0) deve ser medida. 41 Esquema ilustrativo do equilíbrio E + S ES, em três situações (I, II, III) de concentrações diferentes de substrato e mesma concentração de enzima, analisadas após um mesmo tempo inicial. As velocidades de reação (v0) são indicadas em porcentagens da Vmáx. 42 Equação de Michaelis-Menten V max [S] V 0 = K M + [S] 43 Equação de Michaelis-Menten – equação da velocidade de uma reação enzimática: V= Vm . [S] Km +[S] Onde Vm é a velocidade máxima da reação Km = [S] Uma propriedade importante: 44 Km = [S] V máx [S] V Vmax 2 Propriedades importantes de Km: • É numericamente igual a [substrato] na qual a velocidade da reação é metade da Vmax • Característico de cada enzima • Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato 45 Km Afinidade da enzima pelo substrato Pequena [substrato] é necessária para a reação atingir metade da Vmáxima Km Grande [substrato] é necessária para a reação atingir metade da Vmáxima Afinidade da enzima pelo substrato CONCLUSÕES SOBRE Km 46 Km Km Afinidade da enzima pelo substrato Afinidade da enzima pelo substrato CONCLUSÕES SOBRE Km 47 CONCLUSÕES SOBRE A CINÉTICA MICHAELIANA Quando a [S] for menor que o Km (até atingir a saturação da enzima) a velocidade da reação é proporcional à [S] Reação de 1a ORDEM Quando a [S] é muito maior que Km a velocidade da reação é constante e igual a Vmax Reação é de ORDEM ZERO V e lo c id a d e d a r e a ç ã o [S] Gráfico característico é uma hipérbole 48 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA • Reversível • Irreversível Competitiva Não Competitiva (mista) Incompetitiva (acompetitiva) 49 INIBIÇÃO REVERSÍVEL • inibidor forma com a enzima um composto INSTÁVEL • inibição NÃO envolve modificação COVALENTE • tipos de inibidores reversíveis competitivos não competitivos incompetitivos 50 • Há competição pelo centro ativo do enzima • O inibidor é estruturalmente semelhante ao substrato • A inibição pode ser contrariada adicionando mais substrato ao meio • O Km aumenta e o Vmáx não se altera INIBIÇÃO COMPETITIVA 51 INIBIÇÃO COMPETITIVA • Inibidor competitivo Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima E + S ES E + P EI + I Enzima 52 INIBIÇÃO COMPETITIVA Enzima Sítio Ativo IC S S IC IC IC IC S P P S S S S S S S P P P P 53 INIBIÇÃO COMPETITIVA [substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente afinidade da enzima pelo substrato Na presença do inibidor competitivo Km da enzima aparente 54 INIBIÇÃO COMPETITIVA 55 INIBIÇÃO COMPETITIVA 56 INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA • Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato • NÃO se liga no sítio ativo da enzima • Aumento da [substrato] não diminui a inibição • Km da enzima NÃO se altera • Vmáx diminui na presença do inibidor 57 INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA E + S ES E + P EI + S + I + I EIS • Inibidor não-competitivo NÃO se liga ao sítio ativo da enzima Enzima 58 INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA Diminui a concentração de enzima ativa Velocidade máxima da reação 59 • O inibidor liga-se a um local específico do enzima (quenão o centro ativo) • O inibidor liga-se ao complexo ES • O complexo ESI não forma produto INIBIÇÃO INCOMPETITIVA • O Km diminui e a Vmáx diminui 60 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA E + S ES E + P + I EIS • Inibidor incompetitivo NÃO se liga ao sítio ativo da enzima Enzima Bloqueio de ES I se fixa no complexo ES 61 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA 62 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL • inibidor se combina com um grupo funcional (sítio ativo) da enzima • inibidor se liga à enzima formando um complexo ESTÁVEL • forma-se uma ligação COVALENTE entre o inibidor e a enzima • destruição de um grupo funcional essencial ao funcionamento do enzima 63 MECANISMOS DE REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA Disponibilidade de substrato Concentração de enzima Atividade da enzima • Controle à nivel gênico – indução – repressão • Enzimas alostéricas • Modificação covalente • Clivagem proteolítica de pró-enzimas 64 • Enzimas que aumentam ou diminuem a sua atividade em reação a determinados fatores. • Fazem normalmente parte de sequências metabólicas. Permitem regular a atividade de toda a sequência metabólica e possibilitam à célula ajustar-se às suas necessidades energéticas e biomoleculares. ENZIMAS REGULADORAS 65 REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA CONTROLE À NÍVEL GÊNICO INDUTOR presente Síntese da proteína INDUTOR ausente NÃO ocorre a síntese da proteína 66 Sítio Alostérico (regulador) Substrato Mudança de conformação Alteração na atividade Sítio Ativo (catalítico) Moduladores ou Efetores Positivos Negativos REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ENZIMAS ALOSTÉRICAS 67 Induz: Modificações conformacionais na estrutura espacial do enzima Modifica a afinidade do enzima para com os seus substratos REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ENZIMAS ALOSTÉRICAS 68 Ocorre em enzimas que possuem um local de modulação alostérico Modulador alostérico Positivo (ativam a enzima) Negativo (inibe a enzima) Heterotropismo (o modulador é diferente do substrato) Homotropismo (o modulador é igual ao substrato) A ligação entre o modulador e o enzima é não-covalente e o local de modulação é especifico para cada modulador, no caso das enzimas heterotrópicas REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ENZIMAS ALOSTÉRICAS 69 Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição por retroalimentação (inibição por feedback ou retroinibição), onde o próprio produto da reação atua como modulador da enzima que a catalisa. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ENZIMAS ALOSTÉRICAS Coordena o fluxo de moléculas por uma via metabólica 70 • Não seguem a cinética de Michaelis-Menten • Comportamento sigmóide • [S] para a qual V0=Vmáx/2 não corresponde ao Km REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ENZIMAS ALOSTÉRICAS 71 REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ENZIMAS ALOSTÉRICAS 72 • Fosforilação • Adenilação • Urinilação • ADP-ribosilação • Metilação Grupos adicionados ou retirados da enzima através de modificações covalentes REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA MODIFICAÇÃO COVALENTE Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibe vias ativas. 73 REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA CLIVAGEM PROTEOLÍTICA Enzima Ativa Pró-Enzimas Zimogênios Clivagem Proteolítica 74
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