Técnicas-de-Imunodiagnóstico

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Interações Antígeno-Anticorpo
Ana Cláudia Carvalho Gouveia
	
Interações Ag - Ac
 Ligações não covalentes
Reversíveis
Características das interações Ag-Ac
Afinidade
	Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo).
Características das interações Ag-Ac
Avidez
	- Força de interações total entre Ac e Ag.
 - Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos 
Especificidade
	- Capacidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ags. 
Características das interações Ag-Ac
Reação cruzada
- Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente 
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
 relacionado, mas com propriedades químicas similares.
Métodos
Reagentes não marcados
(A ligação do Ac altera o estado físico do Ag)
Reação de aglutinação
Reação de precipitação
Reagentes marcados
RIA
ELISA 
IF, citometria de fluxo
Western Blotting
Reação de aglutinação
Direta eritrócitos (hemaglutinação), bactérias, fungos
Passiva látex	
(Ag insolúvel)
Qualitativos
Semi-quantitativos
Ex.: classificação sanguinea
Ex.: detectar infecções 
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Tipagem sanguínea
Inibição da Aglutinação
Quantidades de Ag solúvel são adicionadas a uma quantidade fixa de soro contendo o Ac. 
Precipitado visível
Reação de precipitação
A medida que a quantidade de Ag aumenta, a quantidade de precipitado também aumenta até um máximo, para depois diminuir. 
Precipitação em solução
Precipitação em gel
Imunodifusão Radial
Precipitação em gel
Imunodifusão Dupla
Reagentes marcados
 Enzimas, fluorocromos, isótopos
 Tipos:
 RIA
ELISA 
IF, citometria de fluxo
Western Blotting
Radioimunoensaios
 Utilizam Ac conjugados com radioisótopos para quantificar os ensaios.
 • Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
- Baseia-se na quantificação de uma reação enzimática associada com complexos imunes.
Imunofluorescência
- Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a moléculas reveladoras
chamadas fluorocromos.
 Visualização em microscópio de fluorescência
	Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE 
 Ficoeritrina (FE) VERMELHA
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
 Detecção direta de microrganismos 
(secreções, urina, cortes de tecidos); 
 Identificação de subpopulações de linfócitos;
 Fenotipagem de células tumorais
Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis 
em secreção uretral
Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi
Aplicações:
 Detecção de anticorpos específicos contra 
diversos microrganismos; 
 Diagnóstico de doenças auto-imunes; 
 Detecção de Ac anti-nuclear
Imunofluorescência Indireta
Citometria de fluxo
 Detecta, separa e quantifica células contendo um antígeno particular, marcadas com um fluorocromo; 
 Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente; 
 As células são então analizadas no citômetro de fluxo.
 As células saem de uma célula de fluxo e são iluminadas por um raio laser; 
Citometria de fluxo
 A quantidade de raios laser que é dispersa para fora das células durante a passagem das mesmas pelo laser pode ser medida, o que proporciona informação a respeito do tamanho das células. 
- O laser pode também excitar o fluorocromo nas células e a luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais detectores.
Aplicações:
Caracterização de populações celulares;
 Contagem de microrganismos;
 Separação de populações celulares de acordo com a densidade dos antígenos, tamanho e granulosidade das células;
- Análise de proliferação celular.
CD4 
CD8
CD19
Western Blot
Ensaios imunocromatográficos
Teste rápido de HIV
(Ac anti-HIV)
Diagnóstico de gravidez
( detecção de beta HCG)
Técnicas de Biologia Molecular
Reação da Polimerase em Cadeia
Amostra + 
Reagentes
RT-PCR 
(Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)
Termociclador
Detecção da Amplificação
Produto 
(PCR ou RT-PCR)
Eletroforese em 
gel de 
poliacrilamida
Qual a principal diferença entre os métodos de ELISA e imunofluorescência?
2. Em uma tipagem sanguínea houve aglutinação ao se misturar o sangue pesquisado e os soros anti-AB e anti-Rh. Determine o tipo sanguíneo e faça um esquema explicando a reação ocorrida. 
Quais as características do anticorpo que podem influenciar a sua ligação ao antígeno? 
Ao realizar os exames pré-natais, a gestante J.A.C, 26 anos, apresentou teste ELISA positivo para HIV. Como você interpreta este resultado? Descreva suscintamente a reação ocorrida. 
 Qual imunoensaio você escolheria para o acompanhar o prognóstico de um paciente com linfoma? Justifique sua resposta.
Relatório