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Introdução à Microscopia Óptica Adriana Fontes Departamento de Biofísica e Radiobiologia - UFPE e-mail: adriana.fontes.biofisica@gmail.com lâmpada e condensador MICROSCÓPIOS ocular objetiva câmera iluminação Tonar visível o que não é a olho nu MICROSCÓPIOS 1680 1700 1845 1900 1930 1960 1970 1971 1985 1998 Robert Hooke (1600 s) MICROSCÓPIOS lâmpada e condensador ocular objetiva e foco ocular objetiva e foco lâmpada e condensador direto invertido Transmissão vs. Reflexão MICROSCÓPIOS ANTIGOS MICROSCÓPIOS MODERNOS (ÓPTICA INFINITA) MICROSCÓPIOS MODERNOS (ÓPTICA INFINITA) MICROSCOPIA Contraste Resolução Aumento CONTRASTE Campo Claro (Brightfield) Objetos “amplitude” Diferenças de absorção da luz Índice de refração/ espessura Contraste de Fase Contraste Diferencial Interferencial Fase DIC Brightfield Fase DIC Brightfield AUMENTO OBJETIVAS • campo de visão diminui com o aumento da objetiva. DISTÂNCIA DE TRABALHO CAMPO DE VISÃO ABERTURA NUMÉRICA (N. A.) IMERSÃO OBJETIVAS – Abertura Numérica N.A. = n sen θ, n é o índice de refração OBJETIVAS – Distância de Trabalho direto invertido AUMENTO Magnificação ~1000 x N.A. LUZ LUZ COMO ONDA LUZ COMO PARTÍCULA A energia do fóton é: DIFRAÇÃO DIFRAÇÃO E RESOLUÇÃO R = 0,61 λ/N.A. (R é resolução, λ é comprimento de onda = 600 nm, N.A. é abertura numérica) Se você está usando uma objetiva de 10X e abertura numérica 0,25, quais dos sistemas biológicos você conseguirá visualizar: hemácia de 8 um, bactéria 1 de 1 um, vírus de 100 nm e bactéria 2 de 500 nm? E com uma objetiva de 100X e abertura numérica 1,4? Quais dos sistemas biológicos você irá enxergar? DIFRAÇÃO E RESOLUÇÃO DIFRAÇÃO E RESOLUÇÃO Depth of field MICROSCOPIAS ÓPTICA VS. ELETRÔNICA Resolução - 200 nm Sistema biológico vivo Óptica Luz visível – 400 a 800 nm 400 x 103 a 800 x 103 pm Eletrônica 100 keV – 3,7 pm; 200 keV – 2,5 pm; 300 keV – 1,96 pm. Resolução (TEM) – 0,1 nm Resolução (SEM) – 1 nm OBJETIVAS DE IMERSÃO - ÓLEO Por qual razão foram inventadas as microscopias de imersão em óleo? O óleo evita a reflexão interna total, aumenta o ângulo de coleta da luz, aumentar a N.A. e melhora a resolução. TRABALHANDO COM CÉLULAS VIVAS REFERÊNCIAS 1. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/ 2. https://micro.magnet.fsu.edu/ 3. Microscopia Óptica: Fundamentos e Aplicações às Ciências Biomédicas, Editor: Wanderley de Souza, SBBM.
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