Micropropagação - Aplicações Biotecnológicas

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Micropropagação
Aplicações Biotecnológicas
Gabriel Scalioni - 101957
Thales Koba -77863
Introdução
Definição: Rápida propagação clonal de tecidos, ou células vegetais in vitro.
T. Murashige e F. Skoog (1962). "A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco 
Tissue Cultures".
Vantagens:
1. Tempo e espaço reduzidos;
2. Amostra vegetal menor;
3. Taxa de multiplicação celular in vitro é mais rápida;
4. É aplicável em uma maior variedade de organismos;
5. Protege a amostra de re-infecções;
6. Relativamente segura em relação a microrganismos;
7. Melhor armazenamento;
8. Plantas micropropagadas podem adquirir novas características desejáveis.
Método Geral de Micropropagação
Descrito por Bhojwani e Razdan (1990) pode ser separado em 5 etapas:
0) Estágio preparatório;
1) Iniciação de culturas;
2) Multiplicação;
3) Alongamento dos brotos e enraizamento;
4) Transplantação e aclimatização.
Método Geral de Micropropagação
0) Estágio preparatório
● Cuidados no cultivo de plantas que serão utilizadas para micropropagação:
○ Plantas cultivadas em estufa apresentam melhores resultados: maior controle de luz e 
temperatura;
○ Aplicação de reguladores de crescimento;
○ Controle de contaminações;
○ Algumas espécies requerem tratamento diferenciado como: exposição à luz vermelha e 
pré-tratamento térmico.
Método Geral de Micropropagação
1) Iniciação de Culturas
● Obter culturas assépticas da planta que será micropropagada utilizando explantes adequados:
○ Escolha do explante: depende principalmente do objetivo da micropropagação;
- Gemas apicais e laterais: utilizados para clonagem da planta original devido a sua 
 progênie “true-to-type”
- Ponta do meristema: utilizado em estudos de eliminação viral devido a sua alta taxa
 metabólica que inibe a replicação viral
○ Esterilização: Plantas são guardadas em estufas para evitar contaminação pelo ar e antes da 
remoção da amostra, a superfície é esterilizada com etanol 70%;
○ Evitar escurecimento do explante, proveniente da liberação de fenóis que ao oxidar formam 
quinonas tóxicas ao tecido.
Método Geral de Micropropagação
2) Multiplicação
a) Regeneração a partir de calos: Células vegetais de praticamente qualquer parte da planta são 
capazes de formar calos, e os calos podem ser induzidos para regeneração da planta por 
organogênese ou embriogênese somática;
b) Formação de gemas adventícias: Formação de brotos a partir de qualquer parte da planta se 
não as gemas apicais e laterais;
c) Ramificação lateral forçada: Remoção do meristema apical estimula o crescimento de brotos 
a partir das gemas laterais.
Clonagem da planta Tylophora indica por ramificação lateral forçada
Método Geral de Micropropagação
3) Alongamento dos brotos e enraizamento
● Citocinina: Responsável pelo crescimento dos brotos e pela inibição da formação de raízes. Caso 
esteja em excesso, inibe o alongamento dos brotos;
● Enraizamento: Mesmo que com o uso de determinadas auxinas o explante consiga formar raízes in 
vitro é preferível que o enraizamento seja feito in vivo
○ As raízes formadas in vitro morrem depois da transplantação;
○ As conexões vasculares formadas in vitro muitas vez não estão bem desenvolvidas;
○ As raízes formadas in vitro são menos eficazes pois não possuem pêlos absorventes;
○ Muitas vezes calos são formados nas junções das raízes e brotos formados in vitro;
Método Geral de Micropropagação
Transplantação e aclimatização
● Devido às condições não-naturais que são propiciadas in vitro, as plantas muitas vezes apresentam 
anormalidades morfológicas, anatômicas, histológicas e fisiológicas, como nutrição heterotrófica e 
um baixo controle sobre perda de água; Por isso requerem um processo de aclimatização antes de 
sua transplantação.
● Aclimatização: Processo de “reabilitação” da planta em meio com poucos nutrientes e baixa 
umidade;
● Formação de órgãos de armazenamento in vitro: Foi observado que ao mudar a concentração de 
sacarose, da substância reguladora de crescimento, luz e temperatura, algumas espécies viriam a 
formar órgãos de armazenamento (tubérculos, raízes tuberosas, bolbos ou rizomas) que podem ser 
utilizados na transplantação da planta.
Aplicações
Aplicações da micropropagação in vitro
1) Modalidades do cultivo de tecidos e células vegetais:
● Cultivo de meristemas;
● Fusão de protoplastos
● Cultivo de calos;
● Geração de haploides;
● Sementes sintéticas;
2) Resgate de embriões
3) Conservação do germoplasma
Cultivo de meristemas
A cultura de meristemas geralmente é utilizada para:
● Multiplicação de indivíduos;
● Limpeza clonal.
Fusão de protoplastos
A fusão de protoplastos pode ocorrer:
● Entre protoplastos da mesma espécie (homocários);
● Entre protoplastos de espécies diferentes (heterocários).
É uma técnica que pode gerar melhoramento genético.
Há grande dificuldade no isolamento de protoplastos, cultivo e regeneração de 
plantas.
Cultivo de calos
Calo: aglomerado de células não organizadas, irregularmente diferenciadas, que 
se multiplicam desordenadamente e se desenvolvem a partir de tecidos vegetais, 
normalmente em resposta a injúrias químicas ou físicas.
Produção de metabólitos secundários, como:
● Alcaloides;
● Terpenoides;
● Compostos fenólicos.
Geração de Haploides
Possui duas rotas de obtenção:
● Cultura de anteras;
● Eliminação cromossômica;
○ Cruzamento interespecífico seguido de eliminação do genoma da planta doadora do pólen.
Obtenção de plantas homozigóticas em uma geração.
Sementes Sintéticas
● Análogo à semente verdadeira;
● Constituídas de um embrião somático envolto por uma ou mais camadas de 
um composto artificial (alginato de sódio);
● Propagação (sementes inviáveis);
● Armazenamento (criopreservação);
Resgate de embriões
Técnica de cultivo utilizada para:
● Resgatar embriões híbridos, resultantes de cruzamentos incompatíveis;
● Recuperar embriões haploides após a eliminação cromossômica.
Excisão do embrião, esterilização e incubação.
Conservação do germoplasma
Os germoplasmas são qualquer estrutura de um organismo vivo que possa dar 
origem a exemplares da mesma espécie, como sementes.
● Culturas vegetais são mantidas em conservação em bancos germoplasmas:
○ Curto-médio prazo: 6-8°C, iluminação reduzida - retardar o crescimento;
○ Longo prazo: criopreservação (-80°C em frezzer ou -196°C nitrogênio líquido).
● Podem auxiliar na reintrodução de espécimes no ambiente.
Micropropagação de Orquídeas
Métodos de propagação de orquídeas in vivo:
● Propagação “backbulb” (espécies simpodiais):
○ Separação da parte mais antiga do pseudobulbo para “forçar” crescimento de brotos 
dormentes;
○ Processo extremamente lento e que pode no máximo dobrar o número de plantas em 1 ano. 
Micropropagação de Orquídeas
● Germinação de sementes (monopodiais):
○ Baixa sobrevivência das sementes na natureza;
 - Sementes de orquídeas não possuem endosperma - associação com fungos (micorrizas).
○ Alta heterogeneidade da população;
○ 3 - 5 anos para a planta florescer;
Micropropagação de Orquídeas
Roton (1949) - Nós de Phalaenopsis cultivados em Knudson C desenvolveram folhas depois de 14-60, e 
vieram a desenvolver raíz e formar uma planta completa;
Morel (1960) - Pontas de brotos cultivadas in vitro formavam corpos protocormicos (PLBs), que se 
desenvolviam em aglomerados de protocormos os quais viriam a se desenvolver em uma completa com 
brotos e raízes;
Regeneração de brotos e raízes de protocormos de Cymbidium multiplicados in vitro
Micropropagação de Orquídeas
Morel (1972) - Se o aglomerado de protocormos fosse cortado em 3-6 partes e cultivado em meio, cada 
pedaço produziria 3-5 protocormos em 1 mês. Se o processo for repetido, milhões de planta poderiam ser 
formadasem 1 ano partindo de um único pedaço de gema que mede <1mm;
● Cultura de células somáticas de orquídeas (pontas de brotos, folhas, pontas de raízes ou caule 
florais) levam a formação de PLBs.
Técnica de Morel foi adotada comercialmente e é hoje em dia o único método economicamente viável de 
propagação clonal de orquídeas;
● Produtores comerciais iniciam a cultura com um pedaço de 5-10mm, pois pedaços muito pequenos 
demoram muito mais para formar protocormos.
Micropropagação de Orquídeas
 
Estágios da regeneração de protocormos e brotos, a partir de um pedaço de protocormo
Micropropagação de Orquídeas
Métodos de propagação de um híbrido de 
Cymbidium:
(a) 5.353 PLBs em 10 meses
(b) 36.350 PLBs em 12 meses
(c) 351.700 PLBs em 9 meses
(d) 28.100 PLBs em 9 meses
L-TLC (c) é o melhor método para micropro-
pagação desse híbrido.
Cultura de Tecido Vegetal - SBW do Brasil
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206250/
Micropropagação de Transgênicos
Linhagens foram dividas em grupos de acordo com o antígeno expresso:
● LT10 - S-HBsAG
● LT9 - M-HBsAG
● LT11 - L-HBsAG
● Controle
30-35 sementes da primeira geração foram plantadas em 
2 meios: LM1 (Cinetina 5mg/L) e LM2 (Cinetina 0,5 mg/L) 
e os explante retirados das mudas divididos em 2 grupos: 
I - raízes retiradas;
II - raízes e cotilédones retirados. 
Micropropagação de Transgênicos
Estágios da micropropagação:
a. Multiplicação da plântula in vitro;
b. Formação de plântulas a partir do estímulo das
gemas apicais;
c. Multi-plântula completamente desenvolvida;
d. Enraizamento da plântula in vitro;
e. Mudas para transplantação;
f. Comparação entre transgênico e não-transgênico.
Resultados e Conclusões 
 
 
Resultados e Conclusões
É possível aumentar consideravelmente os níveis de S-, M- e L-HBsAG através 
da micropropagação, o que é interessante para a formação de vacinas orais 
contra HBV. Os resultados também mostram que a micropropagação pode servir 
de ferramenta para a biofarmacêutica, pois possibilita um aumento notável na 
produção de biofármacos.