Genética aula 5

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Raphael Simões Vieira – Medicina Veterinária 4º período
Tecnologia do DNA recombinante e ciclo celular
A tecnologia do DNA recombinante veio da biotecnologia = conjunto de técnicas que utilizam organismos vivos para produção de produtos úteis. A biotecnologia surgiu a partir da produção industrial da penicilina, que é um antibiótico produzido a partir de um fungo. Outros exemplos seriam a produção de pão, cerveja, queijo, etc. A partir da biotecnologia surgiu a engenharia genética, que permite manipular o DNA. A partir da descoberta da estrutura do DNA surgiu a engenharia genética. Exemplos: enzimas de restrição (são capazes de quebrar o DNA em sequências específicas), eletroforese, PCR (técnicas utilizadas), etc. 
Tecnologia do DNA recombinante: conjunto de técnicas que permitem isolar, modificar e transferir sequências de DNA para outros organismos. O gene de interesse é inserido em outro organismo. Há a construção de um DNA recombinante. O organismo que obteve o gene introduzido passa a expressar genes que antes ele não expressava. O homem faz isso com o objetivo de melhoramento genético. 
Aplicações: organismos transgênicos, terapia gênica, produção de proteínas terapêuticas (como insulina). Todas essas técnicas só são aplicadas graças a algumas propriedades do DNA: dupla cadeia complementar, capacidade de replicação.
Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível: isolar um gene em particular, produção de proteínas, aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogas para comercialização, modificar organismos existentes para que eles expressem uma característica de interesse, corrigir defeitos genéticos em organismos evoluídos.
Para produzir um DNA recombinante: isolar o gene de interesse (organismo doador), amplificar o gene de interesse (PCR), inserir o gene de interesse em um vetor (que vai transferir o gene isolado para o organismo de interesse), inserir o DNA recombinante em uma célula hospedeira (organismo receptor), selecionar as células transformadas, clonar o DNA recombinante, expressar o gene e purificar a proteína de interesse. 
Isolar o gene de interesse: é isolado pelas enzimas de restrição. São enzimas endonucleases (quebram ligações fosfodiéster dentro da cadeia). Essas enzimas são capazes de clivar o DNA em sequências específicas. Essas enzimas foram encontradas em bactérias, como um sistema de defesa contra fagos, que são vírus capazes de infectar bactérias. Sítios de restrição: possui sequências palíndromo, são sequências de DNA que possuem a mesma sequências de forma anti-paralela. Existem mais de 100 tipos de enzimas de restrição. A mesma enzima de restrição cliva tanto a fita do DNA do doador, quanto a fita do hospedeiro. 
Eletroforese: é utilizada para reconhecer o gene de interesse. Pego os fragmentos do DNA, coloco em gel de agarose, aplico a corrente elétrica. Os fragmentos menores conseguem atravessar o gel, ao encontro da carga positiva, com maior facilidade. Os fragmentos menores ficam no fundo do gel, os maiores ficam mais na superfícies. Algumas vezes o peso molecular de dois fragmentos são muito próximos. Tenho que fazer uma outra técnica. Sobre o gel de agarose coloca um filtro de nitrocelulose, em cima desse filtro coloca-se um papel seco. Por baixo de tudo coloca-se uma esponja embebida em solução salina. O papel tende a absorver a água da esponja, quando absorve a água, os fragmentos de DNA migram para o filtro de nitrocelulose. São adicionadas sondas de DNA marcadas com um rádio isótopo. Essas sondas são complementares à sequencia de DNA de interesse. A sonda se liga, como é marcada, é revelada com raio X. 
Quando já tem o fragmento de interesse, utiliza-se PCR para amplificar esse fragmento. Permite amplificar fragmentos de DNA in vitro, mesmo em baixa quantidade, a única exigência é que a sequencia de nucleotídeos de ambos os lados da fita sejam conhecidas. Precisa-se do DNA molde, de primers, DNA polimerase, e fosfonucleotídeos. É necessário 2 primers, um que liga na extremidade 3’, e outro que liga na extremidade 5’. Cada ciclo de PCR precisa de 3 temperaturas diferentes. Primeiro precisa de uma temperatura alta (95 graus, a TAQ polimerase consegue suportar, foi retirada de microrganismos que vivem próximo a vulcões), há desnaturação do DNA (as pontes de H se rompem, as fitas ficam livres). Depois a temperatura diminui, essa temperatura vai depender do primer. Cada primer necessita de uma temperatura. É próxima a 60 graus. Os primers, nesse temperatura, conseguem se ligar aos seus fragmentos complementares. A temperatura aumenta, em torno de 72 graus, a TAQ polimerase consegue agir, alonga a cadeia. A partir de um fragmento de DNA, produziu 4. A partir de 25 ciclos é possível produzir quase 34 milhões de fragmentos. A amplificação é exponencial. 
O gene de interesse agora será ligado a um vetor. O vetor é uma molécula de DNA que se liga ao gene de interesse (DNA exógeno), e transporta o DNA para outro organismo. O vetor tem que ter um sítio de restrição (para as enzimas de restrição poderem atuar), tem que ter a capacidade de se replicar de forma autônoma. Tem que ser uma molécula pequena, com intensa replicação dentro da célula hospedeira. Existem vários tipos de vetores, sendo que os principais são: plasmídeos (carregam DNA exógenos pequenos, são derivados de bactérias), vetores virais (são utilizados mais no caso da terapia gênica, são capazes de carregarem insertos maiores), cosmídeos. 
Plasmídeos: as bactérias, além do seu cromossomo, possuem os plasmídeos, que é um DNA circular. O plasmídeo possui alta capacidade de replicação de forma independente (mesmo se o cromossomo bacteriano não replicar os plasmídeos podem se replicar). O plasmídeo não apresenta genes essenciais para o funcionamento da célula, mas carregam genes que são vantajosos para a bactéria, como genes que conferem resistência a antibióticos. O pUC18 é um plasmídeo muito utilizado. Possui um gene denominado Lacz, que tem como função produzir uma enzima capaz de metabolizar a lactose. A maioria dos sítios de resrição desse plasmídeo estão localizados no gene LacZ. Quando não há o DNA exógeno, o gene LacZ vai estar ativo, vai estar metabolizando a lactose. Já quando a bactéria incorporou o gene de interesse, sofreu transformação, o gene do LacZ foi interrompido, estando inativo, não metabolizando a lactose.
A técnica de inserção pode ser por transformação (quando a bactéria engloba o DNA exógeno) ou por transdução, mais utilizada quando o vetor é um fago = vírus que parasita bactérias. 
Transformação: para o plasmídeo entrar na bactéria, ela precisa de um estímulo. Pode ser por choque elétrico, onde há desestabilização da membrana da bactéria, o plasmídeo recombinante consegue entrar. Pode ser choque térmico. Nesse caso, há mudança de temperatura brusca, permitindo a entrada do plasmídeo. 
Após a seleção das bactérias que foram transformadas, há a clonagem das bactérias, com clonagem do DNA recombinante. As bactérias começam a expressar os genes, produzindo vários produtos. Depois há a purificação, por cromatografia, permitindo retirar o produto de interesse.
Algumas aplicações
Um organismo transgênico possui um DNA exógeno. Já um organismo geneticamente modificado, não necessariamente ele tem um DNA exógeno. 
Salmão transgênico: genes de interesse vindos da enguia e de outra espécie de salmão. São genes de crescimento. Colocou os genes no plasmídeo (vetor). Ovos fertilizados in vitro, o plasmídeo é inserido nos ovos fertilizados, pela técnica de microinjeção. O esperado é que o plasmídeo seja integrado no genoma do organismo. O plasmídeo se liga ao genoma do organismo. Os ovos microinjetados são cultivados, são injetados em um salmão “mãe”, que vai produzir prole transgênica. Apenas de 2 a 3% que conseguem integrar o genoma. Esse salmão transgênico chega a fase adulta 1 ano antes. 
Outro exemplo de animal transgênico é uma vaca que produz leite bem semelhante ao leite humano. Há vacas que produzem leite sem lactose (geneticamente modificadas
ao invés de transgênico). 
Há plantas transgênicas (soja por exemplo), que são resistentes a herbicidas. 
Terapia Gênica
Removem células do organismo de um indivíduo. Há modificação de apenas algumas células do indivíduo, não de todas. Há a terapia germinativa (descendentes são tratados) e somática. Já foram utilizadas terapias gênicas, mas ainda não são aprovadas. 
O grande desafio da clonagem é estimular a célula que já estava madura a se tornar totipotente, capacidade de se diferenciar em qualquer célula do corpo. 
Existe a clonagem reprodutiva (como na ovelha Dolly) e clonagem terapêutica. Na terapêutica, o embrião é cultivado, quando atinge blastocisto, essas células são cultivadas em meios diferentes, sendo capazes de originar todos os tecidos. 
Ciclo celular
Função do material genético: transferir as informações genéticas para os descendentes e coordenar a síntese de proteínas determinando as características dos indivíduos. 
Ciclo celular: conjunto de processos que se passam numa célula viva entre duas divisões celulares. Apresenta duas etapas principais: interfase e fase M. Iremos tratar sobre o ciclo celular da mitose, a meiose ainda não está tão elucidada.
A interfase possui três fases: G1, S e G2. Durante a intérfase, a célula está se preparando para depois se dividir. Não basta o material genético se replicar para ocorrer a divisão. Se não houvesse o aumento citoplasmático, as células iriam reduzir seu citoplasma. 
Fase M: mitose e citocinese, divisão do núcleo e do citoplasma respectivamente.
Em um ciclo celular de 24h a fase G1 dura em cerca de 9h. O maior tempo é gasto na fase S (10h). Algumas células estão em fase S o tempo todo. Já outras células, como neurônios, ficam em G0, não se replicando. A duração do ciclo celular varia de acordo com o tipo celular. 
A mitose é dividida em 5 etapas principais: prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase. Na intérfase o material genético está descondensado, ele está assim para que haja a replicação. Na prófase, o material genético começa a se condensar. Na prometáfase, o principal evento é a perda do núcleo, ele se rompe. Na metáfase: o material genético se organiza em uma região específica da célula (placa equatorial). Anáfase: separação das cromátides irmãs. Telófase; o contrário da prófase. 
O ciclo celular é regulado. Há três pontos de regulação. Se o cromossomo estiver perfeito, ele pode se replicar. Se há algum dano, o DNA tem que ser reparado, se os danos forem excessivos pode levar a apoptose da célula. Esses pontos são denominados chekpoints. Entre a fase G2 e fase M há também. Analisa se o DNA foi replicado de forma correta. O ponto de verificação serve para definir se a célula vai entrar em divisão ou não. 
Como os check points são controlados? Por duas moléculas principais. Ciclinas e CDKs. As ciclinas possuem a concentração variável (áudio)