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Hemoglobina Oxigênio • A transição da vida anaeróbia para aeróbia se mostrou mais eficiente em termos de produção de energia – obtém-se 15 mais energia da glicose na presença do oxigênio que na sua ausência. • Organismos unicelulares ou muito pequenos podem absorver oxigênio diretamente do ar ou da água. • Em vertebrados, são necessários mecanismos mais avançados – o sistema circulatório e o uso de proteínas de transporte. Hemoglobina e mioglobina • Hemoglobina: contida nas hemácias e leva oxigênio dos pulmões para os tecidos, além de contribuir no transporte de CO2 e íons hidrogênio de volta para os pulmões. • Mioglobina: presente nos músculos, fornece um suprimento de reserva de oxigênio. • A hemoglobina é capaz de usar com eficiência até 90% de seu potencial transportador de O2, enquanto a mioglobina em mesmas condições atinge apenas 7%. Hemoglobina e mioglobina • A hemoglobina e a mioglobina foram as primeiras proteínas a terem suas estruturas determinadas. • Foi também com a hemoglobina que pela primeira vez se observou que uma mutação na seqüência de uma proteína poderia levar a uma doença – a anemia falciforme. Mioglobina • Constituída de hélices-α ligadas por alças e um grupo heme, apresentando uma estrutura globular. • Existe na forma livre de oxigênio (desoximioglobina) e na forma ligada a uma molécula de O2 (oximioglobina) • Abundante em mamíferos aquáticos (Primeira estrutura: cachalote) O grupo Heme • A ligação de oxigênio à mioglobina e à hemoglobina depende da existência do Heme (ou Hemo), grupo prostético. • O Heme é parte de um grupo de compostos químicos chamados porfirinas, sendo a das globinas chamada de Fe-protoporfirina IX. • Há um íon ferro (em geral no estado ferroso, Fe2+) no centro do heme, ligado a quatro nitrogênios. • É o heme que dá ao sangue e aos músculos a cor vermelha característica. Coordenação do ferro • Além das quatro ligações aos nitrogênios, o íon Ferro pode formar mais duas ligações, a partir dos dois lados do plano do heme (chamados quinto e sexto pontos de coordenação). • Na mioglobina, o quinto ponto é ocupado por uma histidina (chamada histidina proximal). • O sexto ponto é desocupado na desoximioglobina, e ligado ao oxigênio na oxi- mioglobina. Coordenação do ferro • A ligação do oxigênio ao sexto ponto de coordenação do ferro reestrutura seus elétrons tornando-o menor, permitindo que ele retorne ao plano do heme. Desoxi-hemoglobina Oxi-hemoglobina Ligação ao oxigênio • Uma vez ligado ao oxigênio, há uma estrutura de ressonância entre Fe2++O2 e Fe 3++O2 -(íon superóxido) � o ferro pode se apresentar no estado férrico. • O superóxido é uma espécie reativa de oxigênio (classe de radicais livres, tóxicos ao organismo) e portanto é importante que a mioglobina libere oxigênio na forma molecular (O2) e não na forma O2 -. • Uma segunda histidina (chamada distal) forma uma ponte de hidrogênio com o superóxido mantendo-o estável e evitando sua saída. Hemoglobina • A hemoglobina é formada por quatro sub-unidades (duas cadeias α e duas cadeias β), cada uma semelhante à mioglobina. • A identidade entre as duas cadeias da hemoglobina humana e a mioglobina é de 25% e 24%, e há conservação de resíduos funcionalmente importantes (como as histidinas distal e proximal). • Evolução divergente Hemoglobina de cavalo (Perutz) Hemoglobina • Os íons de ferro situam-se de forma relativamente distante (entre 24 e 40Å de separação). • A curva de saturação de oxigênio para a hemoglobina é uma sigmóide, enquanto para a mioglobina é uma hipérbole. • Enquanto a mioglobina apresenta meia- saturação a apenas 2 torr (ou mmHg), em hemoglobina isso ocorre a 26 torr. Cooperatividade e fisiologia • Curvas sigmoidais indicam um processo cooperativo (a ligação de um oxigênio num heme facilita a ligação aos outros). • O oxigênio precisa ser transportado dos pulmões (pO2=100torr) para os tecidos (~20torr). • Nos pulmões, ocupa-se por volta de 98% dos sítios de hemoglobinas. Já nos tecidos, há 32% de saturação. Se houvesse apenas a mioglobina, a saturação nos tecidos seria 91%. Cooperatividade e fisiologia • Durante o exercício, a concentração de oxigênio nos músculos cai de 40 para 20torr. Com isso, a liberação de oxigênio pela hemoglobina é ainda maior: além da liberação de 21% (98%-77%) relativa à queda de 100torr para 40torr, há ainda 45% de liberação relativa à queda de 40 para 20 torr (77%-32%). • Assim, a cooperatividade da hemoglobina a torna uma forma eficiente de levar oxigênio aos tecidos onde ele é mais necessário. Cooperatividade e estrutura • Uma vez que a ligação de oxigênio em um ponto no tetrâmero de hemoglobina influencia a ligação nos outros pontos, é preciso que haja algum tipo de processo estrutural que leve a tal fenômeno. • Visto que a distância entre os sítios do ferro é relativamente grande (algumas dezenas de ångstroms), não se trata de interações diretas. Cooperatividade e estrutura • A comparação de estruturas cristalográficas da desoxi-hemoglobina e da oxi-hemoglobina mostram que há uma rotação de um dímero αβ devido à oxigenação. T: estado “tenso” R: estado “relaxado” Cooperatividade e estrutura Cooperatividade e estrutura • No estado T, há mais interações entre os dímeros, enquanto no estado R eles estão mais livres para se mover entre si. • Por conta dessa maior flexibilidade, no estado R é possível para a hemoglobina se ligar ao oxigênio com afinidade mais alta que no estado T. • Assim, uma vez que a ligação de uma molécula de O2 dispara a mudança do tetrâmero de T para R, a ligação de oxigênio em um sítio aumenta a afinidade nos outros. Cooperatividade e estrutura • A mudança entre os estados T e R é disparado pela ligação do oxigênio ao heme: – O oxigênio faz com que o ferro se mova para dentro do plano da porfirina. – A histidina proximal é atraída, deslocando também a hélice-α em que se encontra. – A região C-terminal dessa hélice se encontra justamente na interface entre os dímeros, afetando então a estrutura quaternária. O papel do 2,3-BPG • Para que a função da hemoglobina seja eficiente, o estado T deve ser estável até que o oxigênio a converta para o estado R. Porém, o estado T é muito instável naturalmente. • Estudando-se hemoglobinas em hemácias e totalmente purificadas, descobriu-se que a diferença observada entre as duas se dá devido à presença do composto 2,3- bisfosfoglicerato (2,3-BPG) em hemácias. O papel do 2,3-BPG • Analisando a estrutura da hemoglobina ligada ao 2,3-BPG, observa-se que ela se liga no centro do tetrâmero, em uma cavidade que só está presente na forma T. O papel do 2,3-BPG • Assim, o estado T se mantém estável, até que a ligação do oxigênio induz a conversão para o estado R, com a liberação do 2,3-BPG. • Quando a ação de uma molécula diferente do ligante de uma proteína muda o seu comportamento através de ligação em outro ponto da proteína, diz-se que há um efeito alostérico. • O 2,3-BPG é chamado o efetor alostérico para o caso da hemoglobina. Íons H+ e CO2 – O efeito Bohr • Tecidos de metabolismo rápido (como músculos) geram grandes quantidades de H+ e CO2. Tais espécies são também efetores alostéricos da hemoglobina. • A afinidade da hemoglobina por O2 diminui à media que o pH se torna menor que 7,4. Assim, em um músculo ativo (pH 7,2), libera-se mais oxigênio (77%, contra 66% caso não houvesse mudança de pH). Íons H+ e CO2 • Na desoxi-hemoglobina a histidina 146 é protonada, fazendo uma ponte salina com o aspártico 94. • Em pHs mais altos, a histidina não está protonada, não podendo fazer essa ponte. Com a queda do pH, essa ponte é formada e por conseqüência o estado T é estabilizado. Íons H+ e CO2 • Já no caso do CO2, o efeito se dá por conta de sua tendência a se converter no ácido carbônico, H2CO3, reação acelerada pela enzima anidrase carbônica. • Uma vez que tal ácido tem pKa de 3,5, ele tende a se dissociar em HCO3 - e H+, diminuindo o pH no interior da hemácia e levando ao mesmo mecanismo descrito para o H+. Íons H+ e CO2 • O CO2 pode também interagir diretamente com as aminas terminais da desoxi- hemoglobina (formando grupos carbamatos), o que também estabiliza o estado T formando pontes salinas, e assim favorecendo a liberação de oxigênio. Mutações e Doenças: Anemia Falciforme • Uma das doenças mais famosas relativas à hemoglobina é a anemia falciforme, devida à mutação E6V na cadeia β. • O surgimento de um resíduo hidrofóbico nessa região induz a uma interação com os resíduos F85 e V88, iniciando um processo de agregação. • Geralmente letal quando presente nos dois genes que codificam a cadeia β, quando a mutação está em apenas um gene o indivíduo é resistente à malária, o que explica a prevalência da mutação na áfrica. Mutações e Doenças: Talassemia • A talassemia se caracteriza pela perda ou redução substancial de uma das cadeias da hemoglobina. • Na talassemia α, a cadeia α está ausente e os tetrâmeros possuem apenas cadeias β, que se ligam ao oxigênio com alta afinidade e sem cooperatividade, resultando em pouca liberação nos tecidos. Mutações e Doenças: Talassemia • Na talassemia β, a cadeia β está ausente resultando na formação de agregados insolúveis de cadeias α, que se precipitam resultando em perda de hemácias, causando anemia. O papel da AHSP • Uma vez que cadeias α podem gerar precipitados, é necessário um mecanismo para evitar a agregação. • Isso é evitado através da proteína AHSP, que se liga especificamente à cadeia α em um complexo solúvel. Uma vez que a cadeia β tem mais afinidade à α que a AHSP, uma vez que a cadeia β está presente ela desloca a AHSP, permitindo então a formação da hemoglobina tetramérica. Outras globinas • No genoma humano, além do gene da mioglobina, de dois genes para a cadeia α, e do gene da cadeia β da hemoglobina, há também os genes γ, δ, ε e ζ. • A cadeia γ substitui a β na hemoglobina fetal, que tem afinidade mais alta pelo oxigênio, permitindo obter sangue do sangue materno. Outras globinas • As cadeias δ, ε e ζ formam hemoglobinas expressas diferencialmente durante o desenvolvimento humano. • Há também duas globinas monoméricas: – Neuroglobina: expressa no cérebro e na retina, tem papel na proteção contra hipóxia (insuficiência de oxigênio). – Citoglobina: tem expressão mais generalizada e possivelmente tem a mesma função, mas ainda é pouco estudada.
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