Biotécnicas aplicadas à reprodução animal 12

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Figura11I Principaismateriaise equipamentosutilizadosno isolamentoe identificaçãode FOPAbovinos,AI ovário
no fissuechopper;B)suspensãode fragmentosno meiode isolamento;C) dissociaçãomecãnicados
fragmentosdeováriocompipetasdePasteur;D)filtraçãoda suspensãoemmalhasdenáilonde500 11m
e 10011m,
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Figura11,8,FoIículospré'antraisbovinosisoladosmecanicamente1200XI.AI folículoprimordial;B)folículoprimário;
C) folículosecundário.
240
posiçãodosmeiosutilizadaparaocultivode
FOPAvariaenormemente,emfunçãodoes-
tudorealizado.Apesardisso,algunscompo-
nentescomosoluçãosalina,antibióticos(pe-
nicilina,estreptomicina),tampões(bicarbo-
natoeHepes)ediferentessubstratosnutri-
cionais(monossacarídios,lipídios,proteínas,
aminoácidos,ácidosnucléicos,vitaminas,
etc.)constituemabasedamaioriadosmeios
disponíveis.Ademais,essesmeiosbásicos
sãofreqüentementeenriquecidoscomfontes
protéicas(soro- FCS - FetalCalf Serum,
ECS- EstrusCowSerum,SS- SteerSerum
ouBSA - BovineSerumAlbumin),hormô-
nios (FSH e 17~-estradiol),peptídios(VIP
- VasoactiveIntestinalPeptidee ativina)e
diversosfatoresdecrescimento(EGF, FGF,
TGFa eTGF~) emconcentraçõesvariadas.
Independentementedacomposição,parao
sucessodo cultivoa osmolaridadee o pH
devemsituar-se,respectivamente,entre280
a 310mOsm/1e 7,2 a 7,4.A duraçãodo
cultivopodevariardeum a váriosdiasde
acordocom a finalidadedo experimento.
Alémdo meiodecultivo,umoutrocompo-
nentequenãoafetapropriamenteaviabilida-
dedo folículo,massima suahabilidadede
responderadiferentesestímulos(hormônios,
peptídioseoutrosfatoresdecrescimento)diz
respeitoao substratocomo qualo folículo
mantémcontato.Do pontodevistadidático,
deacordocomaformadecontatodofolículo
como substrato,pode-seclassificarossiste-
masdecultivoembietridimensionais,confor-
meilustradona figura11.9.No sistemabi-
dimensional,o folículoencontra-sesobreo
substrato.Essesubstratopodeseropróprio
plásticodaplacadecultivorecobertoounão
porágar,porcomponentesdamatrizextra-
celularpurificados(exemplo- colágenodo
1.Bidimensional- Folículocultivadosobreo substrato
Exemplos
Meiodecultivo- Ô
FOIíCulO===b.]
I
Ej ~ ~I:M~OO
2 3 4
2.Tridimensional- Folículocultivadono interiordosubstrato
Exemplo
!
~Substrato Foliculo
1. Suporteplásticosemrevestimento
2. Suporteplásticorevestidoporcélulas
3. Suporteplásticorevestidoporágarouelementosdamatrizextracelular
4. Suporteplásticorevestidoporelementosdamatriz+células
Figura 11.9. Sistemasde cultivode folículospré-antrais:A) sistemabidimensiona/;B) sistematridimensional
241
tipoI, fibronectina,lamininaematrigel)ou
mesmopor monocamadadecélulassomá-
ticas(exemplos- célulasdagranulosa,fibro-
blastose demaiscomponentesdo estroma
ovariano).No sistematridimensional,o fo-
lículoencontra-seno interiordo substrato,
ouseja,o folículoestátotalmentecircunda-
dopelosubstrato.Os substratosmaiscomu-
menteutilizadosnessetipodesistemasãoo
colágenodotipoI eoágar.É bemconheci-
doerelatadoemdiferentesartigosqueexis-
teumarelaçãodiretaentreformae função
celular.A formada célulaé determinada
entreoutrosfatores,peloscomponentesdo
citoesqueleto(actina,talina).O mecanismo
deaçãodesubstratosàbasedecomponen-
tesdamatrizextracelularé o de ligar-seà
proteínastransmembranáriasdenominadas
integrinasqueporsuavezestãoligadasaos
componentesdocitoesqueleto.Agindodes-
tamaneira,asproteínasdamatrizextrace-
lular,atuandonocitoesqueletoindiretamente
atravésdasintegrinas,controlamaformada
célulaeconsequentemente,interferemcom
a suafunção.
~ ProtocolodeCultivodeFOPABovinoinvitro
A títulodeinformaçãoprática,seráapre-
sentadoaseguir,emdetalhes,oprotocolode
manipulaçãoecultivodeFOPAin vitrodes-
critoporFigueiredoetaI.(1994c).OsFOPA
destinadosaocultivoin vitrosãoisoladose
manipuladospreviamenteemM 199HEPES
suplementadocom5%deFCS, antibióticos
(200VI/ml depenicilina,200/lg/mldees-
treptomicina)e0,23mM depiruvato.Após
o isolamentofolicular,obtém-seumasus-
pensãodevolumefinaliguala 20 ml (para
um ováriointeiro).Dessasuspensão,após
homogeneização,sãoretiradasalíquotasde
2 mlquesãoposteriormentelevadasaomi-
croscópioinvertidoparaa localização,sele-
çãoe manipulaçãode FOPA isolados.Os
FOPA selecionadossãoaspiradoscommi-
242
cropipetasecolocados,emgrupodequatro
acinco,emmicrogotasde50 /lI domeiode
isolamento.A utilizaçãodemicrogotasfaci-
litaa localizaçãodos folículos,agilizandoa
colocaçãodosmesmosnasplacasdePetri.
Em seguida,os folículossãosubmetidosa
trêslavagensemmicrogotas,no sentidode
eliminarascélulasdoestromaovarianopre-
sentesnasuspensão.Apósalavagem,osfo-
lículossãocolocadosnomeiodecultivo(cer-
cade350/lI) contidono interiordasfossas
daplacadecultivo.O meiodecultivoutiliza-
do por nossaequipeéconstituídodeMEM
suplementadocomantibióticos(200VII mlde
penicilina,200/lglmldeestreptomicina),10%
deFCS e ITS (insulina- 6,25/lg/ml,trans-
ferrina- 6,25/lg/mleselenium- 6,25ng/ml).
O cultivofolicularé realizadoem estufas
contendo5%deCOzemara39°C.No caso
deculturadeduraçãodecincodias,o meio
étrocado24horasapóso iníciodocultivoe
posteriormenteacada 48horas.
~ ParâmetrosUtilizadosnaAvaliaçãoda
Eficiênciado Cultivode FOPA in vitro
Avaliaçãoda SobrevivênciaFoIiculor
Os FOPA podemseravaliadosquantoà
suaviabilidade,diretamente,a fresco,sem
(avaliaçãosubjetiva)ou como empregode
corantesvitais(azuldetripan),utilizando-se
um microscópioinvertidobemcomoapós
processamentohistológico.A avaliaçãoafres-
cobaseia-senoaspectodooócitoquandovi-
sível,edascélulasdagranulosacircundantes
quedevemapresentar-sehomogêneosebri-
lhantes.Osfolículosdegeneradosapresentam
contornosirregulares,oócitoeloucélulasda
granulosade aspectoenegrecido,podendo
estasestaremretraídasedescoladasdamem-
branabasaI.Do pontodevistahistológico,
deveserobservadooaspectodooócito,bem
como,dascélulasdagranulosacircundantes.
O núcleodooócitodeveapresentarcromati-
nadescondensadacompatívelcomo estádio
deprófaseI e o citoplasmaoocitáriodeve
apresentar-sehomogêneo.É importanteob-
servartambéma aparência,tamanhoe dis-
tribuiçãodosnúcleosdascélulasdagranulo-
sa.Nos folículosdegenerados,asalterações
maiscomumenteobservadassãoa conden-
saçãodacromatina,bemcomoaretraçãodo
citoplasmadooócito.Emmenorfreqüência,
podeserobservadareduçãoda densidade
nuclearnacamadadecélulasdagranulosa,
comotambémapresençadepicnosenuclear.
A figura11.10mostraexemplosdeFOPAbo-
vinosnormaisou degeneradosobservados
apóscultivoin vitro.Outraformadeavaliar
aviabilidadeoocitáriaconsistenautilização
datécnicadeautoradiografia,quetambém
utilizatécnicashistológicasemumadesuas
etapas.Nessecaso,avalia-seacapacidadesin-
téticadooócitoecélulasdagranulosaconsi-
derandoasuahabilidadedeincorporaruridi-
natriciadaoumetioninamarcadacomenxo-
fre35 (535).
Figura11.10. FOPAbovinosisoladosapóscultivoinvitro
ressaltandoumfolículodegenerado(seta)
sendoosdemaismorfologicamentenormais.
Avaliaçãodo Crescimentoe
SobrevivênciaFoIicularinvitro
A avaliaçãodo crescimentofolicularin
vitropodeserrealizada:a) a fresco,medin-
do-seodiâmetrodosfolículosusualmenteno
inícioeno fimdoperíododecultivo;b) de-
terminando-seaatividademitóticadascélu-
lasdagranulosa,considerandoasuacapaci-
dadede incorporarmarcadoresradioativos
(exemplo:timidinatriciada- técnicadeau-
toradiografia)ou nãoradioativos(exemplo:
BrdU - bromodeoxuridina- técnicadeimu-
nocitoquímica).A taxadefolículosvivospré
e póscultivoin vitropodeserdeterminada
utilizando-secorantesvitaiscomoporexem-
plooazuldetripan(JewgenowetaI.,1998).
~ FatoresqueAfetama Sobrevivência,
Adesãoe MorfologiadosFOPA in vitro
Fornecidosalgunsprincípiosbásicosso-bre o cultivofolicular,algunsfatoresque
afetamasobrevivência,adesãoemorfologia
deFOPAserãodiscutidosaseguir,comênfa-
senaespéciebovina.As perdasdefolículos
duranteo cultivoinvitropodemocorrerpor
duasmaneiras:a) degeneraçãoeb)porina-
bilidadedofolículodeaderir-seaosubstrato
econsequentementeserperdidoporocasião
dastrocasdemeiodecultivo.
PerdasFoIicularesporDegeneraçãoFoIicular
A taxadedegeneraçãofolicularqueocor-
repredominantementeno oócitoduranteo
cultivode FOPA bovinospodeserinfluen-
ciadaprincipalmenteportrêsfatores:1)tipo
deovárioutilizadocomodoadordeFOPA,
2) meioutilizadono isolamentofoliculare
3) composiçãodo meiodecultivo.
* InfluênciadoOvárioDoadordeFOPA
FigueiredoetaI.(1994b)testaramaefi-
ciênciadeováriosdebezerra,vacasadultas
emciclonormal,gestantese finalmenteem
pós-partocomodoadorasdeFOPA parao
243
cultivoinvitro.Apóscincodiasdecultivofoi
demonstradoquea percentagemdefolícu-
losviáveisoriundosdevacasempós-parto
(32,1%)foi significativamenteinferioraos
ováriosdebezerras(55,5%),vacasemciclo
normal(71,7%)evacasgestantes(60,7%).
Essesresultadosmostramqueestádiorepro-
dutivodasfêmeasdoadorasdeováriosafeta
aviabilidadedeFOPA cultivadosin vitro.
* Influênciado Meio Utilizadono
IsolamentoFolicular
FigueiredoetaI.(1993b)observaramque
a sobrevivênciade FOPA podeserafetada
pelacomposiçãodo meio de isolamento:
Quandoo PBS (PhosfateBufferSaline)foi
usadocomomeiode isolamento,a grande
maioriadosfolículosteveseusoócitosde-
generadosapóso primeirodiadecultivo.
* Efeitoda Composiçãodo Meio de Cultivo
FigueiredoetaI. (1994b)descreveram
queasobrevivênciadosfolículospré-antrais
bovinosinvitrofoireduzidanaausênciade
hipoxantinae substratosenergéticos,tais
comoo piruvatoe a glutamina.Foimos-
tradoquea adiçãodeumamisturadepi-
ruvato(0,23mM),glutamina(2mM) e
hipoxantina(2mM)aomeiodecultivode
basedenominadodecontrole(MEM suple-
mentadocomantibióticos- 200VI/ml de
penicilina,e200jlg/mldeestreptomicina,
10%deFCS eITS - insulina6,25jlg/mle
selenium6,25ng/ml)aumentouapercen-
tagemdefolículosmorfologicamentenor-
maisde29,4%(meiocontrole)para78,6%
(meiotratado).
PerdasFoIicularesporInabilidadede
AdesãoFolicularao Substrato
O cultivodeFOPA bovinosdiretamente
sobreo suportedeplásticoapresentacomo
inconvenientes,alémdaalteraçãodaforma
folicular,as grandesperdasfolicularesdu-
244
ranteastrocasdemeio,devidoaofatodos
folículosnãoaderiremouaderiremfraca-
menteaoplástico.Nosentidodesuperares-
tesproblemas,Figueiredoetalo(1995b)ava-
liaramoefeitodediferentestiposdematriz
extracelular(exemplos:fibronectina,coláge-
nodotipoI, matrigelelaminina),emsiste-
masbidimensionaletridimensionaldecul-
tivo,sobreamorfologiaeadesãofolicularao
substrato.Nosistemabidimensional,autili-
zaçãodafibronectina(76,0%),colágenodo
tipoI (65,2%)ematrigel(80,4%)aumentou
significativamenteaporcentagemdefolícu-
losaderidosquandocomparadoaoplástico
(20,4%)nãorecobertopormatriz.Quando
osfolículosforamcultivadosemsistematri-
dimensionalnointeriordeumgeldecolá-
genotipo I, nenhumaperdafolicularfoi
observadaeamorfologiafolicularfoiseme-
lhanteàobservadanoovário.Emresumo,a
utilizaçãodecomponentesdamatrizextra-
celularé importanteparaa preservaçãoda
morfologiafolicular,bemcomo,parareduzir
ou abolirasperdasfolicularesduranteas
trocasdemeiodecultivo.
~ FatoresqueAfetamo Crescimentoin
vitrode FOPA Bovinos
In vivo,várioscomponentesproduzidos
endócrinae localmentepodemestimulara
neovascularizaçãoouinervaçãodospeque-
nosfolículos,osquaisproporcionamnutrien-
tes,citocinas,hormôniosesubstânciasneu-
ropeptidérgicas.Essesfatoresparecemser
necessáriosparaa sobrevivênciadosfolícu-
loseiníciodocrescimentofolicular(vanden
Hurketal.,1997).Osfatoresqueregulamo
crescimentodefolículospré-antraisbovinos
aindasãopoucocompreendidos.Estudos
realizadosin vitrotêmdemonstradoqueo
crescimentodosfolículospré-antraiséafeta-
dopormuitosfatores,osquaisraramente
atuamindependentemente(Williams,1990).
In vitro,FSH,ativina,EGF,TGFseVIP pa-