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APROVEITAMENTO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS PARA PRODUÇÃO DE BIOENERGIA
Luiz Felipe Gonçalves Gava, Iara Rebouças Pinheiro
Rua Horacio Leandro nº22, Basiléia, Cachoeiro de Itapemirim; felipe_gava19@hotmail.com
Universidade Federal do Espírito Santo
RESUMO
Foram estudadas diferentes concentrações enzimáticas na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar, com o objetivo de determinar qual a melhor combinação das enzimas estudadas que irão produzir a maior quantidade de glicose em menor tempo. As enzimas utilizadas foram Complexo Celulase (REF NS22086), β-glicosidase (REF NS22118) e Xilanase (REF NS22083) cedidas pela empresa Novozymes. O bagaço utilizado no processo foi pré-tratado com peróxido de hidrogênio 7,4%. O objetivo do pré-tratamento foi remover parte da liginina e da hemicelulose para facilitar o processo de hidrólise. Observou-se que as concentrações enzimáticas próximas ao ponto central foram as que alcançaram melhores concentrações de glicose em menor tempo. Portanto, dentre todos os experimentos realizados, a maior concentração de glicose obtida foi em torno de 637mg/dL para média das hidrólises com concentrações enzimáticas de 1500 FXU/g de xilanase, 10 FPU/g de complex celulase e 150 CBU/g de β-glicosidase.
Palavras-chave: Hidrólise enzimática, celulases, glicose, Pré-tratamento, enzimas, bagaço.
INTRODUÇÃO
Atualmente a busca por alternativas energéticas menos prejudiciais ao meio ambiente tem aumentado de maneira significante. A biomassa lignocelulósica vem aparecendo como uma opção, pois é uma matéria-prima renovável de baixo custo que se encontra em larga escala na natureza. Esses materiais são, geralmente, provenientes de resíduos agroindustriais. Além disso, são abundantes fontes de carboidratos, desta forma, possuem um potencial para produção de etanol. O Brasil gera cerca de 350 milhões de toneladas de resíduos lignocelulósicos por ano. Utilizando esses resíduos anuais para a produção de etanol, o país teria a capacidade de produzir 147 milhões de toneladas de açúcares (sacarose e glicose), gerando um potencial de produção de etanol de 92 bilhões de litros (Pereira Jr. apud Aguiar, 2010). 
O bagaço de cana-de-açúcar é o material mais abundante da biomassa lignocelulósica e tem sido o principal alvo de pesquisas com o objetivo de geração de etanol a partir dos açúcares provenientes de sua hidrólise. Os carboidratos encontrados na matéria lignocelulósica estão na forma de polímeros, mais especificamente na forma de celulose, hemicelulose e lignina. Assim, para sua utilização como matéria-prima para produção de etanol deve-se realizar o processo de hidrólise.
Os materiais lignocelulósicos são resistentes a bioconversão e é necessário realizar um pré-tratamento com o objetivo de remover parte da lignina e da hemicelulose, reduzir a cristalinidade, tornar o material mais poroso e mais susceptível às enzimas celulolíticas. Dos vários tipos de pré-tratamento que existem destaca-se o a partir de peróxido de hidrogênio alcalino (RABELO, 2010). 
A hidrólise baseia-se na conversão das moléculas de celulose à glicose, através de agentes químicos, físicos ou enzimáticos. Os açúcares liberados podem então, a partir do processo de fermentação, gerar o etanol celulósico. 
O processo de hidrólise enzimática tem sido mais utilizado, por não produzir grandes quantidades de resíduos tóxicos. As enzimas utilizadas são provenientes de alguns microorganismos do gênero Trichoderma, Penicilium e Aspergillus. Diversas enzimas podem ser utilizadas no processo, porém pode-se destacar a complexo celulase, a β-glicosidase e a xilanase. Ao final do processo de hidrólise obtêm-se os açúcares monossacarídeos que estão prontos para serem fermentados.
Junto com os estudos sobre quais as melhores enzimas a ser utilizadas, surgem estudos estatísticos sobre os dados encontrados com o objetivo de maximizar os resultados. A partir disso é possível obter as melhores concentrações enzimáticas e o melhor experimento, além de um padrão para o processo de hidrólise. A análise estatística para a construção de um modelo de resposta é um fator importante e de grande utilidade neste tipo de estudo, pois através do modelo é possível prever variações nas concentrações de glicose que podem ocorrer no experimento em função da alteração das concentrações das enzimas. 
MATERIAIS E MÉTODOS
Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com peróxido de hidrogênio
O bagaço utilizado foi cedido pela Indústria Paineiras, empresa localizada no sul do Espírito Santo, no município de Cachoeiro de Itapemirim. O pré-tratamento foi realizado utilizando 12 gramas de uma mistura de bagaço seco peneirado (16-60 mesh). O peróxido de hidrogênio utilizado no pré-tratamento possuía concentração de 7,4% (V/V). Ajustou-se o pH do meio para 11,5 através de uma solução tampão de NaOH (5 mol/L). Adicionou-se 151,65 mL de H202 em 300 mL de água. Depois disto ajustou-se o pH utilizando a solução tampão de NaOH, após acrescentou-se água destilada até que o volume atingisse a marca de 600 mL reacionais. Ajustou-se o banho em 25 ºC, ligou-se o agitador e a solução foi deixada reagindo por um tempo de 1 hora. Após isso, o bagaço foi lavado por 12 vezes, sendo utilizados 500 mL de água destilada por lavagem, e por fim, o material foi colocado na estufa em uma temperatura de 45 ºC por um período de 48 horas.
Hidrólise enzimática
As enzimas utilizadas no presente trabalho foram Complexo Celulase (REF NS22086), β-glicosidase (REF NS22118) e Xilanase (REF NS22083) foram cedidas pela empresa Novozymes. A tabela 1 apresenta o planejamento experimental, indicando a concentração enzimática de cada hidrólise.
Tabela 1: Concentração enzimática de cada hidrólise
	
	Complex Celulase
	β-glicosidase
	Xilanase
	Hidrólise A
	5 FPU/g
	100 CBU/g
	1000 FXU/g
	Hidrólise B
	15 FPU/g
	100 CBU/g
	1000 FXU/g
	Hidrólise C
	5 FPU/g
	200 CBU/g
	1000 FXU/g
	Hidrólise D
	15 FPU/g
	200 CBU/g
	1000 FXU/g
	Hidrólise E
	5 FPU/g
	100 CBU/g
	2000 FXU/g
	Hidrólise F
	15 FPU/g
	100 CBU/g
	2000 FXU/g
	Hidrólise G
	5 FPU/g
	200 CBU/g
	2000 FXU/g
	Hidrólise H
	15 FPU/g
	200 CBU/g
	2000 FXU/g
	Hidrólise I
	10 FPU/g
	150 CBU/g
	1500 FXU/g
	Hidrólise J
	10 FPU/g
	150 CBU/g
	1500 FXU/g
	Hidrólise K
	10 FPU/g
	150 CBU/g
	1500 FXU/g
	Ponto Central
	10 FPU/g
	150 CBU/g
	1500 FXU/g
Iniciou-se o experimento preparando-se a solução tampão a ser utilizada para controlar o pH durante o processo. Um volume de 500 mL de tampão foi preparado utilizando 2,415 g de ácido cítrico (0,1 M), 3,97 g de citrato de sódio (0,1 M) e aferiu-se o volume com água destilada até se completar os 500 mL do recipiente. Depois disto, mediu-se as quantidades de cada uma das enzimas e colocou-se os volumes medidos no reator. Pesou-se 3 g de bagaço pré-tratado e colocou-se o bagaço pesado e quantidade de solução tampão suficiente para completar 300 mL reacionais no reator. No decorrer da hidrólise, retirou-se amostras de 2 mL do líquido reacional nos tempos de 0, 3, 6, 12, 24 horas de experimento para posteriormente analisar a concentração de glicose liberada em cada um dos respectivos tempos de experimento pelo método enzimático utilizando o kit glicose HK liquiform (Labtest).
Determinações das glicoses das amostras
A dosagem das amostras retiradas em tempos determinados das hidrolises foi realizada através do kit glicose HK liquiform (Labtest). Iniciou-se a dosagem preparando a solução a ser utilizada. Esta solução foi preparada misturando dois reagentes contidos no kit, em uma proporção de 1 para 4 entre o reagente 1 e o reagente 2, respectivamente. Após isso, com o auxilio de um micropipetador, pipetou-se 1000 μL da solução preparada para vários eppendorfes. Cada microtubo foi demarcado e recebeu 10 μL de uma determinada amostra. Além disso, foi realizado um padrão e um branco utilizando os eppendorfes, no qual o padrão recebia 1000 μL de solução e 10 μL de solução padrão de glicose contida no kit eo branco recebeu 1000 μL de solução. Todos os eppendorfes foram levados ao vortex garantindo a homogeneização das amostras. Em seguida, as amostras foram colocados em banho maria a uma temperatura de 25 ºC por 5 minutos. Ao final, mediu-se as absorbâncias em espectrofotômetro no comprimento de onda de 400 nm. Deve-se ter o cuidado de ler todas amostras no máximo em uma hora após as amostras estarem em temperatura de 25ºC, devido a degradação do reagente. Foram anotadas as absorbâncias de cada amostra e a partir de uma relação descrita pelo kit em que o valor de absorbância encontrado para o padrão equivale a 100 mg/dL de glicose, determinou-se a concentração de glicose de cada amostra.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Inicialmente foram realizadas um total de 11 hidrólises, com triplicata do ponto central(Hidrólises com concentração média de cada enzima). Em cada uma delas foram utilizadas diferentes quantidades das enzimas complex celulase , β-glicosidase e xilanase. 
Neste primeiros 11 experimentos realizados a hidrólise I foi a que obteve a maior variação entre a quantidade inicial e final de glicose, em menor tempo. Inicialmente, no tempo zero, ela possuía uma concentração de glicose de 282,85 mg/dL e, ao final, no tempo 12 horas já possuía uma concentração de 631,56 mg/dL, um aumento de cerca de 123%. Nessa hidrólise foi utilizada a enzima xilanase em concentração 1500 FXU/g, complex celulase em 10 FPU/g e β-glicosidase em 150 CBU/g, mesmas concentrações das hidrólises J e K, já que eram triplicatas do ponto central. 
Entretanto, alguns dos experimentos apresentaram variações inesperadas nos resultados, onde a quantidade de glicose decresceu com decorrer do tempo de hidrólise. Por isso, os experimentos que apresentaram essa variação foram realizados novamente, sendo eles as hidrólises B, C, D, F, I, J e K. Ao realizar novamente as hidrólises para verificar se o comportamento dos resultados era característico desses experimentos, observou-se que alguns continuavam comportando-se da mesma maneira e outros apresentaram comportamentos de acordo com o esperado inicialmente. Na tabela contida na figura 1 encontram-se os dados que não apresentaram comportamento anômalo dos primeiros experimentos e os dados da segunda bateria de experimentos.
Figura 1: Gráfico com a concentração de glicose em determinados tempos das hidrólises
Ao final da analise dos resultados da segunda bateria de experimentos, o ponto central, que corresponde a média entre as hidrólises I, J e K, obteve a maior variação, em menor tempo, da quantidade de glicose formada. Pela segunda vez, os experimentos que possuíam as enzimas xilanase em concentração 1500 FXU/g, complex celulase em 10 FPU/g e β-glicosidase em 150 CBU/g alcançaram os melhores resultados. O ponto central apresentou uma variação da quantidade de glicose do tempo inicial ao tempo final de 12 horas de 367,97 mg/dL, um aumento de cerca de 136%, com um erro padrão de 30,94 e um desvio padrão de 141,8. 
Além disso, observou-se que os experimentos B, C, D e F continuam apresentando decréscimo na concentração de glicose, enquanto nos resultados das hidrólises I, J e K constatou-se um comportamento diferente, caracterizado pelo crescimento da quantidade glicose nas amostras com o decorrer do tempo. Desta forma, chegamos à hipótese de que as quantidades de glicose diminuíam com passar do tempo de experimento devido a algum tipo de contaminação microbiana, onde microorganismos, sendo eles fungos ou bactérias, poderiam estar consumindo a glicose formada. 
Com isso, o objetivo era realizar novas hidrólises, porém utilizando algum tipo de substância inibidora do crescimento de microorganismos dentro do reator. Iria ser utilizado o fluoreto como uma opção para realizar os experimentos, porém, por falta de alguns reagentes e por um tempo mínimo necessário para a realização de tantos experimentos, não foi possível realizar essa terceira bateria de hidrólises. Desta forma, em futuros trabalhos serão realizados esses experimentos para obtenção de melhores resultados.
CONCLUSÕES
As concentrações enzimáticas de 1500 FXU/g de xilanase, 10 FPU/g de complex celulase e 150 CBU/g de β-glicosidase, que são as concentrações do ponto central, alcançaram os melhores resultados. Na primeira bateria de experimentos, a hidrólise I, que era uma das repetições do ponto central, obteve uma variação da concentração de glicose de 282,85 mg/dL no tempo inicial à 631,56 mg/dL no final de 12 horas. E na segunda bateria, a média entre os resultados do ponto central alcançou uma variação de 269,55 mg/dL no tempo zero à 637,52 mg/dL no de 12 horas. Desta forma, pode-se concluir que concentrações enzimáticas próximas as utilizadas no ponto central foram as que atingiram uma maior quantidade de glicose em menor tempo de hidrólise.
REFERÊNCIAS
1. AGUIAR, C. Hidrólise enzimática de resíduos lignocelulósicos utilizando celulases produzidas pelo fungo Aspergillus niger. 2010. 106 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Engenharias e Ciências Exatas, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Paraná. 2010.
2. RABELO, S. C.. Avaliação de desempenho do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino para a enzimática de bagaço de cana-de-açúcar. 2007. 150 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo. 2007.
3. RABELO, S. C.. Avaliação e Otimização de pré-tratamentos e Hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de Etanol de Segunda Geração. 2010. 414 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) – Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo. 2010.
4. DIONISIO, G. ;SANTANA, F. ;MORAES, F. ;ZANIN, G..Aplicação de complexo enzimático lignocelulósico para a hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. Disponível em: <http://www.cobeqic2009.feq.ufu.br/uploads/media/105721401.pdf>. Acesso em: 05 de Abril de 2012.
5. FRADE, V.. Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.). Disponível em: <http://www.fei.edu.br/pt-BR/ensino/pos_graduacao/mestrado/programa_mestrado_administracao/Documents/relatorio%20Final%20Veronica%20Frade.pdf>. Acesso em: 06 de maio de 2012.
6. RIBEIRO, C. ;EDUARDO F.. Hidrólise e Fermentação de Bagaço de Cana-de-Açúcar para Produção de Etanol. 2010. 48 f. Trabalho de Conclusão de Curso – DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA, ESCOLA POLITÉCNICA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. 2010.
UTILIZATION OF AGRO-INDUSTRIAL RESIDUES FOR BIOENERGY PRODUCTION
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the best combination of enzymes that will produce the largest amount of glucose in less time to hydrolysis of bagasse sugarcane. The enzymes used was Cellulase Complex (REF NS22086), β-glucosidase (NS22118 REF) and Xylanase (REF NS22083), provided by Novozymes Company . The pulp used in the process was pretreated with 7.4% hydrogen peroxide aiming to removal partially of lignin and hemicellulose to facilitate the hydrolysis process. The enzymatic concentrations near the central point, were the best glucose concentrations reached in less time. Among all experiments, the highest glucose concentration obtained was about 637mg/dL for enzymatic concentrations in hydrolysis with 1500 FXU / g xylanase 10 FPU / g of cellulase complex and 150 CBU / g of β-glucosidase .
Key-words: Enzymatic hydrolysis, cellulases, pretreatment, glucose, marc.