Relatorio Enzimologia

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Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
Alyne Campos, Amanda Campos, Amanda Santomé, Ana Luiza Caetano, André Gabriel, Maria Luiza Kuhn, Victoria Martins e Sebastião Neto
Profa. Dra. Mariângela Fontes Santiago
Relatórios de enzimologia
Goiânia, 
30 de maio de 2018
Relatório nº 1: Escurecimento Enzimático
1. Introdução.
O escurecimento enzimático de frutas inicia-se em resposta a injúrias físicas e fisiológicas como resultado da oxidação de compostos fenólicos que irá resultar polímeros coloridos. As lesões levam ao colapso celular e à consequente descompartimentação dessas células, promovendo o contato dos compostos fenólicos com enzimas associadas ao escurecimento (PORTE e MAIA, 2001; VILAS BOAS, 2002). Essa reação pode causar mudanças indesejáveis, além do escurecimento da superfície da fruta, pode ocorrer a deterioração de aroma e outras propriedades organolépticas, a diminuição do valor nutricional e da vida útil de muitos alimentos. O escurecimento enzimático é causado principalmente pela ação da enzima polifenol oxidase (PPO).
De acordo com o trabalho de VILAS BOAS, 2002, existem variáveis para que ocorra o escurecimento enzimático, como o tipo de substrato, ou seja, o tipo de fruta estudada; a concentração de oxigênio presente no ambiente; e a temperatura. 
Apresenta-se na Figura 1 o esquema da reação de escurecimento enzimático envolvendo a enzima polifenoloxidase (PPO), que é considerada a principal enzima associada com a deterioração dos tecidos vegetais, pois com o rompimento destes por danos mecânicos, esta enzima atua oxidativamente sobre o substrato disponível, acelerando o escurecimento e, consequentemente, a alteração e perda de qualidade do alimento (Fennema, 1976).
2. Objetivo.
Analisar o efeito de agentes inibidores da atividade das enzimas polifenoloxidases. 
3. Reagentes e Materiais.
· Maçã;
· Batata;
· 5 placas de Petri;
· Pinça;
· Água quente e fria;
· Solução de ácido cítrico 10% (pH 1,9);
· Solução de bicarbonato de sódio 0,1% (pH 8,5),
· Solução de ácido ascórbico 5%,
· Solução de metabissulfito de sódio 1%.
4. Procedimental Experimental.
O procedimento consistiu em quatro passos:
1- Realizou-se o tratamento térmico em que se colocou 3 fatias de batata e maçã em água fervente, retirando-as após 1, 2 e 5 minutos de aquecimento. Retiraram-se as fatias da água com uma pinça e deixaram-nas em repouso em uma placa de Petri. Para o controle colocou-se fatias de maçã e batata em água fria por 60 segundos.
2- Para se conhecer o efeito do pH mergulharam-se fatias de maçã e batata em soluções de ácido cítrico e outras duas em bicarbonato de sódio por 60 segundos, transferindo-as para duas placas de Petri em seguida.
3- Para o efeito do ácido ascórbico se adicionoufatias de maçã e batata em uma solução de ácido ascórbico 5% por 60 segundos, seguida de transferência das mesmas para uma placa de Petri.
4- Para o efeito do metabissulfito de sódio mergulhou-se as fatias de maçã e batata em uma solução de metabissulfito de sódio 1% por 60 segundos, e depositou-os em outra placa de Petri.
Os resultados foram analisados após 24 horas. 
5. Resultados e Discussões.
	Escurecimento Enzimático
	Água Fria (Controle)
	Água Quente (1, 2 e 5 min)
	Ácido Cítrico 10%
	Bicarbonato de sódio 0,1%
	Ácido Ascórbico 5%
	Metabissulfito de sódio 1%
	Maçã
	+ + + +
	+ / + ++ /+
	+ + +
	+ +
	+
	-
	Batata
	+ + +
	+ /+ + / + 
	+ +
	+ + 
	+ + 
	-
Legenda: Natural (-), muito claro (+), claro (+ +), escurecendo (+ + +), escuro (+ + + +), muito escuro (+ + + + +).
Observou-se em todos os casos que a maçã escurece rapidamente e de forma mais perceptível que a batata, isso se deve a maior quantidade de enzimas na maçã. 
O calor necessário para inativar a enzima completamente resulta em perda de caracteres organolépticos, no sabor e textura. A inativação por água quente se mostrou eficiente quando o alimento manteve contato por 5 minutos, porém houve perda dos caracteres essenciais, ficando com consistência mais amolecida. 
Nas frutas que tiveram seu escurecimento retardado com o uso do ácido cítrico e o ácido ascórbico (presentes no suco de limão) ocorreu uma diminuição na velocidade do processo de escurecimento por consequência da redução da quinona à forma fenólica, essa redução aos seus precursores fenólicos leva à oxidação irreversível do ácido ascórbico, que impede temporariamente o escurecimento (MARSHALL, KIM e WEI, 2000). Esses resultados foram condizentes com os resultados encontrados por VILAS BOAS, 2004. O ácido ascórbico age diretamente na enzima, complexando o centro catalítico do grupo prostético da PPO, causando sua inibição (SAPERS e MILLER, 1998). O ácido cítrico pode agir como redutor do pH ou como quelante do cobre (centro catalítico) da enzima PPO.
Enquanto os ácidos diminuem o pH, os sulfitos interagem diretamente com intermediários formados durante a ação enzimática e impedem a reação de formação de pigmento escuro. Eles são potentes inibidores das PPOs, geralmente utilizados na forma de bissulfito de sódio e metabissulfito de sódio (Araújo, 2004). A partir dessas análises constata-se que o metabissulfito de sódio foi o que apresentou melhor atuação na inibição do escurecimento enzimático de forma irreversível, sem modificar os caracteres do alimento. 
6. Conclusão.
Pode-se, através desta aula, verificar que as enzimas que promovem o escurecimento em presença de oxigênio e compostos fenólicos são de grande importância para o processamento de produtos vegetais, principalmente frutas, legumes e verduras, pois podem gerar compostos escuros que mudam a cor e o sabor destes, diminuindo a aceitação sensorial. Portanto, aprender alguns processos simples de inativação enzimática poderá contribuir para diminuir a perda de alimentos durante o preparo e consumo. Dentre eles, conclui-se que o mais eficaz é o metabissulfito de sódio e o ácido ascórbico, o segundo a depender do tempo de exposição, já que não inibe irreversivelmente. 
7. Referências Bibliográficas.
CABELLO, C. Extração e pré-tratamento químico de frutanos de Yacon. Revista Ciência, Tecnologia de Alimento. Campinas, vol. 25, n 02: 202-207, abr/jun. 2005.
ARAUJO, J. M. A. Química de Alimentos,3. Ed.
COULTATE, T.P. Alimentos: a química de seus componentes. 3ed. Porto Alegre: ARTMED, 2004.
CLERICI, M.T.P.S., et al. Escurecimento enzimático: uma aula prática. Revista de Ensino de Bioquímica, v.12, n.2, 2014. 
Relatório nº2: Extração, concentração e identificação de protease do abacaxi (bromelina: EC 3.4.4.24)
1. Introdução
O abacaxi é uma fruta cultivada nas regiões tropicais e subtropicais que é amplamente consumido em todo o mundo, sendo o Brasil o terceiro maior produtor desse alimento. Ele é principal representante da família Bromeliaceae na qual é encontradoum conjunto de isoenzimas proteolíticas denominado de bromelina. Proteases (ou enzimas proteolíticas) é um grupo de enzimas que catalisam a quebra das ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.(ABÍLIO, 2009).
A atividade proteolítica da bromelina lhe oferece grande aplicabilidade tanto em indústrias alimentícias como amaciadores de carnequanto em farmacêuticas como cicatrizante. Seu uso vai desde amaciamento de carnes, clarificação de cervejas, fabricação de queijos, preparo de alimentos infantis e dietéticos, no pré-tratamento de soja, no tratamento do couro, na indústria têxtil, no tratamento da lã e da seda, e até no tratamento de distúrbios digestivos, feridas e inflamações, preparo de colágeno hidrolisado (CESAR, 2005).
2. Objetivo
Extrair, identificar e observar a ação da atividade da enzima bromelina EC: 3.4.4.24.
3. Reagente e materiais
· Abacaxi;
· Tábua;
· Faca;
· Gral;
· Pistilo;
· Solução tampão fosfato com pH 6,0;
· Solução de acetona p.a.;
· Álcool a 70%;
· Centrifuga;
· Papel de filtro;
· Freezer;
· Tubo de ensaio;
· Banho-maria;
· Bacia;
· Gelo.
4. Procedimento experimental
Primeiramente, pesou-se 50g do abacaxi incluindo o fruto e o talo. Em seguida, com o intuito de extrair as enzimas, foi adicionado 50 mLde tampão fosfato pH 6,0 e triturado com auxilio de gral e pistilo. Homogeneizou-se. Posteriormente, filtrou-se com papel de filtro para obter o extrato bruto da enzima e reservou 5mL do mesmo. 
Para isolar a protease (bromelina), foi realizado a precipitação com acetona p.a. em uma proporção de 2:1 (acetona por extrato bruto de enzima), adicionou-se álcool a 70% e centrifugou-se a solução a 10.000 rpm por 10 minutos. Em seguida, descartou-se o sobrenadante da solução e retirou-se toda a acetona p.a. restante secando a solução e ressuspendeu-se o “pellet” em 500 µL de tempão fosfato com um pH de 6,0.
À dois tubos contendo 5 mL de solução de gelatina a 2,0% de substrato solidificado na geladeira, adicionou-se 0,5mL da enzima concentrada por precipitação. Em outro tubo, não se adicionou enzima (controle negativo). Em outros três tubos adicionaram-se 2,5mL do extrato bruto da enzima. Em outros três tubos, colocou-se 2,5mL do extrato bruto da enzima fervido por 10 minutos.Incubou-se todos esses tubos à 37º por 30 minutos. Após a incubação dos tubos de ensaio colocaram-nos em banho de gelo por 20 minutos.
5. Resultados e discussões
Observando-se os tubos após o banho de gelo, foi possível perceber que no tubo do controle negativo houve gelificação do conteúdo evidenciando que a gelatina estava apta para realizar os testes. Nos tubos aos quais foram adicionados a enzima concentrada e o extrato bruto, observou-se que o conteúdo continuou líquido. Esse fato deve-se à ação da bromelina que degradou a gelatina e impediu que ela gelificasse.
Já nos tubos aos quais foram adicionados o extrato bruto fervido, o conteúdo gelificou. Quando elevamos a temperatura, as enzimas presentes no extrato bruto foram desnaturadas e a capacidade de quebra do colágeno foi corrompida, propiciando a gelificação.
6. Conclusões
Portanto, foi possível perceber que a enzima possui atividade proteolítica uma vez que nos tubos que ela estava presente, o colágeno presente na gelatina foi degradado e o conteúdo dos tubos se apresentou liquefeito. Também foi possível observar que, com o aquecimento da enzima, a mesma foi desnaturada perdendo seu poder sobre o colágeno.
7. Referências bibliográficas
ABÍLIO, G., M., F. et al. Extração, atividade da bromelina e análise de alguns parâmetros químicos em cultivares de abacaxi. Rev. Bras. Frutic. vol.31 no.4 Jaboticabal Dec. 2009.
CESAR, A.,C., W. Análise de Viabilidade Econômica de um Processo de Extração e Purificação da Bromelina do Abacaxi. Tese de doutorado. Campinas, SP. 2005
Relatório n°03: Curva de calibração para dosagem colorimétrica de açúcares redutores pelo método do ácido dinitrossalicílico (DNS)
1. Introdução
Os carboidratos capazes de reduzir sais de cobre e prata em soluções alcalinas, conhecidos como açúcares redutores, apresentam grupamentos aldeídicos ou cetônicos livres. Assim, todos os monossacarídeos são redutores e o mecanismo de oxido-redução envolve a formação de um enediol, função fortemente redutora em meio alcalino, que interconvertealdoses e cetoses (DEMIATE et al., 2002). Já os dissacarídeos não possuem essa característica sem sofrerem hidrólise da ligação glicosídica, sendo, então, denominados de açúcares não redutores (DEMIATE et al., 2002). 
O método colorimétrico mais amplamente empregado para determinação de açúcares redutores utiliza o ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) como agente oxidante. Essa metodologia consiste na redução do DNS (cor amarela) para um composto, que pode ser detectado por espectrofotômetro a 540 nm, que é o ácido 3-amino-5-nitrossalicílico (composto avermelhado) na presença do açúcar, que neste caso é a glicose, na qual o grupo aldeído deste açúcar redutor é oxidado a uma carboxila (DEOTI et al.; 2013; NELSON; COX, 2014).
2. Objetivos
A finalidade experimental foi construir uma curva de calibração de glicose (absorbância versus concentração de glicose) pelo método do ácido dinitrossalicílico, e determinação da equação da reta e do coeficiente de correlação a partir da regressão linear.
3. Reagentes e materiais
· Reagente ácido dinitrossalicílico (DNS)
· Solução de glicose a 2%
· Micropipetas
· Banho-maria
· Água destilada
· Tubos de ensaio
· Bolas de gude
· Suporte para tubos de ensaio
· Termômetro 
· Espectrofotômetro
· Vortex
· Pipeta volumétrica
· Peras
4. Procedimento experimental
Inicialmente, uma solução de glicose a 2% foi preparada, sendo feitas diluições dessa solução para se obter soluções com concentração de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 g/L. Posteriormente, em um tubo de ensaio, colocou-se 0,5 mL das soluções de concentração conhecida e 1 mL do reagente DNS (previamente preparado) utilizando uma micropipeta e em triplicata com homogeneização dos tubos. Os mesmos foram colocados em banho-maria fervente durante 5 minutos. 
Após esfriar, o volume dos tubos foi completado para 10 mL com água destilada com o auxílio de uma pipeta volumétrica. Além disso, também foi preparado o branco conforme descrito acima, porém sem a adição do açúcar e sim 0,5 mL de água destilada. Em seguida, os tubos foram bastante homogeneizados em um vortex e foi feita a leitura das absorbâncias em espectrofotômetro a 540 nm, sendo anotados os valores obtidos para construção da curva de calibração.
	Concentração (g/L)
	Absorbância
	Absorbância2
	Absorbância3
	Média das Absorbâncias
	Desvio Padrão
	0,2
	0,0830
	0,1280
	0,1260
	0,1123
	0,02076
	0,4
	0,2950
	0,2980
	0,2980
	0,2970
	0,00141
	0,6
	0,4750
	0,0476
	0,4710
	0,3312
	0,20054
	0,8
	0,6230
	0,0624
	0,6380
	0,4411
	0,26787
	1
	0,7870
	0,7790
	0,7710
	0,7790
	0,00653
5. Resultados e discussões
A tabela abaixo apresenta os valores, em triplicata, das absorbâncias encontradas para cada concentração, incluindo a média e o desvio. Já o gráfico demonstra as médias das absorbâncias (y) versus as concentrações (x) com a equação da reta e o coeficiente de correlação.
Tabela 1: Valores de absorbância para cada concentração com a respectiva média das triplicatas e o desvio padrão amostral (DPA).
	
	Gráfico1: Representação da absorbância x concentração de glicose com a equação da reta e o coeficiente de correlação.
6. Conclusões
O método do ácido dinitrossalicílico (DNS) é rápido, prático e eficaz, para dosagem de açúcares redutores e a partir da curva de calibração obtida com sua respectiva equação da reta, é possível determinar qualquer concentração de glicose utilizando o método do DNS. Além disso, o coeficiente de correlação (R2) encontrado aproxima-se de 1.
7. Referências bibliográficas
DEMIATE, I. M.; WOSIACKI, G.; CSELUSNIAK, C.; NOGUEIRA, A. Determinação de açúcares redutores e totais em alimentos comparação entre método colorimétrico e titulométrico. Ciências Exatas e da Terra, C. Agrárias e Engenharias, 8 (1), p. 65 - 78, 2002.
NELSON, D. L; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: ArtMed, 2014. 1328 p.
DEOTI, J. R.; SANTOS, A. A.; JÚNIOR, S. L. A. Nova metodologia de dosagem de açúcares redutores confere maior velocidade à análise de parâmetros de processos fermentativos. Anais do 3° SEPE e 3ª Jornada de Iniciação Científica, vol. 3, 2013.
Relatório nº4: Efeito da temperatura na atividade enzimática (Invertase)
1. Introdução
A temperatura é um importante determinante da atividade enzimática. Seguindo o comportamento das reações químicas, a velocidade da atividade enzimática aumenta quando se aumenta a temperatura. Entretanto, a velocidade da reação aumenta até um máximo, após determinada temperatura a velocidade declina rapidamente. Isso ocorre por que a estrutura tridimensional das enzimas se rompe, impossibilitando-a de formar o complexo enzima-substrato. A atividade enzimática é a quantidade da enzima necessária para produzir 1µL de açúcar redutor por minuto.(GOULART et al., 2003)
Para otimização das reações biológicas, mediadas por catalisadores, é necessário uma temperatura adequada que varia de acordo com o tipo de enzima. Baixas temperaturas podem causar inativação e altas temperaturas podem causar desnaturação enzimática.Invertase é uma enzima muito utilizada na indústria de alimentos e bebidas e pode ser empregada para a produção de açúcar invertido a partir da sacarose. A sacarose é comumente obtida a partir de leveduras, sendo sintetizada também pelas abelhas, as quais a utilizam para fazer o mel a partir do néctar. (MASTROENI et al., 2008)
2. Objetivo
Analisar o efeito de diferentes temperaturas na atividade de uma enzima. Determinar a temperatura ótima para a enzima invertase.
3. Reagentes e Materiais
· Tubos de ensaio
· Banho-Maria
· Solução de Sacarose 2%
· Tampão Acetato 100 mMpH 4,4
· Enzima invertase
· Solução DNS 
· Água destilada
· Espectrofotômetro
· Micropipetas
· Vortex
4. Procedimento experimental
Primeiramente adicionou 100 µL de solução de sacarose e 850 µL do tampão em cada tubo de ensaio e deixou-os em banhos-maria de diferentes temperaturas (25, 37, 45, 55, 65 e 75 ºC), -todos em triplicata- até entrarem em equilíbrio térmico. 
Acrescentou-se 50 µL de invertase em cada tubo de ensaio e deixou-os reagindo durante 10 minutos. Adicionou-se 1mL da solução de DNS, incubado em seguida por 5 minutos em água fervente. Completou-se o volume do tubo de ensaio para 10 ml com água destilada. Homogeneizou-se a solução nos tubos no vortex e procedeu a leitura em um espectrofotômetro (540 nm). 
5. Resultados e Discussões 
Os valores médios de absorbância obtidos pela análise no espectrofotômetro estão expostos na Tabela abaixo.
	Temperatura
	Absorbância
	25ºC
	0.356 A
	37ºC
	0.750 A
	45ºC
	0.762 A
	55ºC
	0.980 A
	65ºC
	0.827 A
	75ºC
	0.358 A
Tabela1: Valores médios de absorbância para cada temperatura analisada.
Gráfico 1: Temperatura x atividade enzimática da invertase
T (ºC)
Abs
A concentração da enzima para a absorbância na qual a atividade enzimática foi maior é dado por meio da equação da curva de calibração com DNS já obtida através dos ensaios anteriores. Na qual y é o valor da absorbância obtida, e x é o valor da concentração .
Equação: y= -0,029 + 0,475*x 
 0,980= -0,029 + 0,475*x x = 1,009 = 2,124 g/L
 0,475 
Atividade enzimática = x *fator
Na qual o fator é 100/150 x 1000/50 x 1x10 = 1,33 ; x é a concentração obtida anteriormente.
Então, atividade enzimática = 2,124 x 1,33= 2,825 U/mL
6. Conclusões
Concluimos que a enzima invertase apresentou uma temperatura ótima em torno de 55ºC onde atividade enzimática máxima da reação foi obtida.
7. Referências bibliográficas
1-GOULART, A. J. ADALBERTO, P. R. Purificação parcial de invertase a partir de Rhizopussp. Em fermentação semi-sólida. Alimentos e Nutrição Araraquara, vol.14, nº 2 (2003)
2-MASTROENI, M. F. Bioquímica: Práticas Adaptadas/Marcos Fábio Mastroeni, Regina Maria Gern. São Paulo: Editora Atheneu, 2008.
Relatório nº 5: Efeito do pH na atividade enzimática (Invertase)
1. Introdução
Invertase ou – D- frutofuranosidase é a principal enzima utilizada na indústria alimentícia para a hidrólise da sacarose, a qual atua no terminal não redutor do resíduo -d- frutofuranosídeo em frutofuranosídeos. A invertase catalisa também reações de transferência com outros aceptores, além da água. Isso resulta na formação de oligossacarídeos constituídos por unidades de glicose e frutose.1
A ação catalítica de uma reação enzimática é alcançada dentro de limites muito estreitos de pH. Cada reação tem um pH ótimo, que para a maioria das enzimas se situa entre 4,5 e 8,0, e no qual a enzima apresenta sua atividade máxima. O valor do pH ótimo varia de acordo com as várias enzimas e os diferentes substratos sobre os quais atuam . Valores baixos ou altos de pH podem causar desnaturação protéica considerável e conseqüente inativação enzimática. Por isso, é muito útil saber em que faixa de pH a enzima é mais estável, já que o pH de máxima estabilidade nem sempre coincide com o de máxima atividade. 2
2. Objetivo
	Analisar a atividade enzimática em diferentes valores de pH e descobrir o pH ótimo para atividade da enzima invertase em tampão fosfato e acetato.
 3. Reagentes e Materiais
-Solução Acetato (0,2 M);
- Solução Fosfato (0,2 M); 
- Solução de sacarose 2%;
- Solução de DNS; 
- Enzima invertase; 
- Micropipetas;
- Tubos de ensaio; 
- Água destilada;
- Banho-maria;
- Espectrofotômetro.
4. Procedimento experimental
Prepararam-se as soluções tampões de acetato e fosfato e adicionou-se nos tubos de ensaio, em triplicata, para cada valor de pH (4,0; 4,4; 5,0; 5,6; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5), 100 µL da solução de sacarose 2% e 880 µL do tampão acetado ou fosfato, conforme a faixa de pH desejada. Para o preparo dos dois brancos, um para o tampão acetato e outro para o tampão fosfato, adicionou-se 100 µL da solução de sacarose 2%, 880 µL do tampão e 20 µL de água destilada.
Incubou-se os tubos à 50 ºC e acrescentou-se 50 µL de invertase em cada tubo, cujo tempo foi de reação de 5 minutos. Em seguida, incorporou-se em todos os tubos 1mL de DNS e colocou-se por mais 5 minutos em água fervente. Completou-se o volume para 10 mL com água destilada, homogeneizou-se os tubos e realizou-se a leitura em espectrofotômetro à 540 nm.
5. Resultados e discussões
Preparo das soluções tampão:
TAMPÃO ACETATO
Solução Estoque:
A: 0,2 M de solução de ácido acético (11,55 mL em 1000 mL)
B: 0,2 M de solução de acetato de sódio (16,4 g de C2H3O2Na ou 27,2 g de C2H3O2Na.3H2O em 1000 mL)
x mL de A + y mL de B, diluídos para um total de 100 mL:
	X
	Y
	pH
	41,0
	9,0
	4,0
	30,5
	19,5
	4,4
	14,8
	35,2
	5,0
	4,8
	45,2
	5,6
Cálculos:
TAMPÃO FOSFATO
Concentração = (41,0 x 0,2)/100 + (9,0 x 0,2)/100 = 0,1 M = 100 mM/L
Concentração = (30,5 x 0,2)/100 + (19,5 x 0,2)/100 = 0,1 M = 100 mM/L
Concentração = (14,8 x 0,2)/100 + (35,2 x 0,2)/100 = 0,1 M = 100 mM/L
Concentração = (4,8 x 0,2)/100 + (45,2 x 0,2)/100 = 0,1 M = 100 mM/L
TAMPÃO FOSFATO
A: 0,2 M de solução de fosfato de sódio monobásico (27,8 g em 1000 mL)
B: 0,2 M de solução de fosfato de sódio dibásico (53,65 g de Na2HPO4.7H2O ou 71,7 g de Na2HPO4.12H2O em 1000 mL).
x mL de A + y mL de B, diluídos para um total de 200 mL:
	X
	Y
	pH
	87,7
	12,3
	6,0
	68,5
	31,5
	6,5
	39,0
	61,0
	7,0
	16,0
	84,0
	7,5
Cálculos:
Concentração = (87,7 x 0,2)/200 + (12,3 x 0,2)/200 = 0,1 M = 100 mM/L
Concentração = (68,5 x 0,2)/200 + (31,5 x 0,2)/200 = 0,1 M = 100 mM/L
Concentração = (39,0 x 0,2)/200 + (61,0 x 0,2)/200 = 0,1 M = 100 mM/L
Concentração = (16,0 x 0,2)/200 + (84,0 x 0,2)/200 = 0,1 M = 100 mM/L
	
Desse modo, todas as soluções foram preparadas na faixa de concentração de 100 mM/L. 
 Medida da absorbância
Foram realizadas leituras no espectrofotômetro para cada valor de pH. As médias das leituras foram resumidas na Tabela 1.
Tabela 1. Medidas de absorbâncias para cada valor de pH.
	pH
	Média da absorbância
	4,0
		0,9850
	4,4
	0,8050
	5,0
	0,7923
	5,6
	0,5317
	6,0
	0,3770
	6,5
	0,2573
	7,0
	0,0123
	7,5
	0,0030
 Cálculo da concentração de glicose	
	A partir da curva de calibração para dosagem colorimétrica de açúcares redutores, obtida pelo método do ácido dinitrossalicílico (DNS) calculou-se a concentração de glicose.
Equação da curva: 
			
Substituindo-se em y os valores da absorbância, obteve-se as concentração de glicose (x) para cada valor de pH, conforme mostrado na tabela 2.
Tabela 2. Valores de absorbância (y) e concentração (x) para diferentes valores de pH.
	pH
	Absorbância (y)
	Concentração (x)
	4,0
	0,9850
	1,0541
	4,4
	0,8050
	1,4968
	5,0
	0,7923
	1,4841
	5,6
	0,5317
	1,2235
	6,0
	0,3770
	1,0688
	6,5
	0,2573
	0,9491
	7,0
	0,0123
	0,7041
	7,5
	0,0030
	0,6948
Cálculo da atividade enzimática:
	Para se realizar o cálculo da atividade enzimática (U/mL), utilizou-se a quantidade da enzima necessária para produzir 1μL de açúcar redutor por minuto.
obs.: U = x. fator, cujo fator = 100/150 x 1000/50 x 1/10 = 1,33 (nestas condições de reação). Ao se multiplicar o fator 1,33 pela concentração x, obteve-se os valores da atividade enzimática, como mostrado na tabela 3.
Tabela 3. Atividade enzimáticapara diferentes valores de pH.
	pH
	AtividadeEnzimática
	4,0
	0,8433
	4,4
	1,1974
	5,0
	1,1872
	5,6
	0,9788
	6,0
	0,8550
	6,5
	0,7592
	7,0
	0,5632
	7,5
	0,5558
 Gráfico pH (x) versus atividade enzimática (y)
A partir do gráfico nota-se que o aumento do pH de 4,0 para 4,4 e de 5,0 para 5,6 foi acompanhado pelo aumento da atividade enzimática, sendo o pH ótimo de 5,6. Em ph maior, observa-se uma severa diminuição da atividade enzimática.
6. Conclusões
Após os experimentos e cálculos realizados, e partindo do princípio de que o pH ótimo para uma enzima é aquele em que sua atividade é máxima, conclui-se que o pH ótimo para a enzima invertase é 5,6.
7. Referências
1 Alimentos Funcionais e Nutracêuticos. Disponível em <http://www.insumos.com.br/funcionais_e_nutraceuticos/materias/86.pdf> Acesso em 12 de Outubro de 2016
2 VICENTE A. A. Preparação de Açúcar invertido por meio de Invertase Imobilizada em Sílica. Dissertação de Mestrado. Instituto de Química. Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2000.
Relatório nº 6: Efeito da Concentração do Substrato na Atividade da Invertase
1. Introdução
A concentração do substrato em uma reação enzimática influi diretamente na atividade da enzima. O estudo das reações enzimáticas e de uma série de propriedades das enzimas baseia-se em medidas da velocidade da reação. Essa velocidade é diretamente proporcional á concentração do reagente. A reação catalisada enzimaticamente processa-se em duas etapas: na primeira, a enzima (E) liga-se reversivelmente ao substrato (S) formando um complexo enzima-substrato (ES). Na segunda fase, é liberado o produto e a enzima.
Com concentrações maiores de substrato, as velocidades da reação tornam-se cada vez maiores, porque no equilíbrio da primeira etapa, existirá cada vez mais complexo ES. Mas se a quantidade de substrato for ainda maior, a concentração de E será praticamente nula, encontrando-se toda a enzima disponível sob a forma de ES. Nessas condições, haverá a maior concentração possível de ES, que é praticamente igual a concentração da enzima utilizada, e a reação será processada na maior velocidade possível. Essa concentração de substrato é dita saturante e, a partir dela, novos aumentos de concentração de substrato não terão efeito perceptível sobre a velocidade da reação, que atingiu o seu valor máximo, o Vmax da reação.
Em todas as concentrações de substrato, sempre existirá uma determinada concentração que originará uma concentração de ES igual à metade da máxima possível. Desse modo, o uso dessa concentração de substrato levará ao estabelecimento do equilíbrio da primeira etapa quando 50% das enzimas se encontrarem em sua forma livre e 50% na forma ES. 
Pode-se dizer então, que nessas condições, a velocidade será a metade da V max, cuja concentração corresponde à constante de Michaelis-Menten, Km, valor que indica a afinidade que enzima apresenta pelo substrato.
2. Objetivo
Submeter concentrações crescentes de sacarose à hidrólise, com concentração constante da enzima, visando verificar em qual concentração de substrato ocorre a saturação da enzima invertase.
3. Reagentes e Materiais
· Tampão acetato 100 mM pH= 5,5
· Sacarose (0,5%, 0,75%, 1,0 %, 1,25%, 1.5%, 1,75%, 2,0%, 2,25% e 2,5%)
· Enzima Invertase
· Solução de DNS
· Água destilada
· Micropipetas
· Tubos de ensaio
· Suporte para tubos de ensaio
· Banho maria
· Vortex mixer
· Espectrofotômetro
4. Procedimento Experimental
Em tubos de ensaio foram adicionados 850 uL de tampão acetato 100 mM e 100 uL de sacarose para cada concentração desta. Incubou-se a reação a 50 oC por 1 minuto. Acrescentou-se 50 uL da enzima invertase e deixou-se reagir por 10 minutos. Para realização do branco, foram colocados 50 uL de água destilada no lugar da enzima. ​Após esse tempo, foi adicionado me cada tubo 1 mL de solução de DNS. Aqueceu-se em banho de água fervente por 10 minutos, e após resfriamento, completou-se o volume do tubo para 10 mL com água destilada. Os tubos foram homogeneizados e então realizou-se leitura em espectrofotômetro a 540 nm. O ensaio foi feito em triplicata.
5. Resultados e discussões
y= 2,0232x + 0,7450
Cálculo de Km
Km = b/a
Km = 0,7450/2,0232
Km = 0,3682
O valor teórico de Km para a enzima invertase é de 14,09 g/L (41,02mM). Nesse experimento foi obtido um valor diferente do teórico. Possivelmente por se tratar de uma aula de laboratório, as condições não são as ideais para determinar um valor condizente com os descritos na literatura.
Cálculo de Vmax
Vmax = 1/ a
Vmax = 1/ 2,0232 
Vmax = 0,4942
6. Conclusões
Portanto, os valores encontrados não estão condizentes com a literatura. Isso se deve, principalmente ao fato de ser uma aula prática onde se tem muitas pessoas na sala e inexperiência com esse tipo de experimento. 
7. Referência
MARZZOCO A.; TORRES B. B. Bioquímica Básica. 3 Edição. São Paulo. Guanabara Koogan. 2007. 64-67 p.
Concentração da glicoseX Absorbância
0.2	0.4	0.6	0.8	1	0.11233333333333334	0.29699999999999999	0.33119999999999999	0.44113333333333332	0.77900000000000003	Concentração da glicose (g/L)
Absorbância(540nm)
25	37	45	55	65	75	0.35600000000000021	0.75000000000000044	0.76200000000000045	0.98	0.8270000000000004	0.35800000000000021	Atividade Enzimática X pH
AtividadeEnzimática	4	4.4000000000000004	5	5.6	6	6.5	7	7.5	0.84330000000000005	1.1974	1.1872	0.9788	0.85499999999999998	0.75919999999999999	0.56320000000000003	0.55579999999999996	pH
Atividade Enzimática
0,00,20,40,60,81,01,2
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
[sacarose]/ %
V / U/mL