Prática 4 e 5

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG 
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
 
Prática 4 e 5: 
Extração e medida da atividade de enzimas amilolíticas e determinação 
da sua atividade - tempo e temperatura 
 
 
 
 
 
Júlia Gonzalez - 86756 
Lisliane Kickofel - 71591 
Simone Soares - 47475 
 
 
 
Profª ​​Márcia Luvielmo 
 
 
 
 
 
Rio Grande 
 2018 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
As enzimas são substâncias orgânicas específicas compostas por polímeros 
de aminoácidos, que atuam como catalisadores no metabolismo dos seres vivos. 
Há muito tempo as enzimas são utilizadas como catalisadores em uma série de 
reações. Por exemplo, a utilização do malte da cevada já era usado para 
conversão do amido em açúcares fermentescíveis antigamente (SPIER, 2005). 
As enzimas são denominadas de acordo com o substrato sobre o qual 
atuam, portanto, o termo amilase indica a ação sobre o amido (amilo), que contém 
dois tipos de polissacarídeos: a amilose (15-20%) e a amilopectina (80-85%). A 
produção de enzimas amilolíticas teve início no século passado, em decorrência do 
interesse industrial da produção de glicose a partir de materiais amiláceos. As 
amilases promovem a hidrólise do amido a açúcares redutores, sendo detectadas 
há mais de um século em grande variedade de materiais biológicos. Essas 
enzimas são designadas amilolíticas porque promovem a degradação do amido 
(SANTANA, 2012). 
As enzimas são consideradas catalisadores biológicos, formados por longas 
cadeias de moléculas pequenas ligadas entre si (aminoácidos). São, portanto, um 
tipo de proteína com atividade catalítica, sendo encontrada em todos os seres 
vivos. Sua principal função é viabilizar a atividade das células, quebrando 
moléculas ou juntando-as para formar novos compostos, sob condições 
específicas para cada substrato. A interação enzima-substrato ocorre no interior de 
uma cavidade chamada sítio ativo. A substância que sofrerá a ação da enzima 
será transformada pelos resíduos de aminoácidos presentes no plano do sítio ativo 
(LEHNINGER, 1985). 
As enzimas podem ser extraídas de células vegetais e animais. Além disso, 
são altamente específicas por um substrato característico; diminuem a energia de 
ativação e por isso aumentam a velocidade de uma reação química; e agem em 
condições brandas de temperatura e pH. (LEHNINGER, 1985). 
O mecanismo de atuação da enzima se inicia quando ela se liga ao 
reagente, mais propriamente conhecido como substrato. É formado um complexo 
enzima-substrato, instável, que logo se desfaz, liberando os produtos da reação. A 
 
 
enzima permanece intacta embora tenha participado da reação. Na formação das 
estruturas secundária e terciária de uma enzima, acabam surgindo certos locais na 
molécula que servirão de encaixe para o alojamento de um ou mais 
substratos.​(LEHNINGER, 1985). 
 
Figura 1​​. Atividade enzimática através do modelo encaixe induzido. 
 
 
 A atividade catalítica depende da integridade da conformação proteica. Se 
uma enzima é quebrada em seus aminoácidos constituintes, a atividade catalítica é 
perdida. As estruturas proteicas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias de 
uma enzima são essenciais para a sua atividade catalítica (LEHNINGER, 1985). 
 As enzimas são essenciais para os sistemas vivos. Sob condições 
biológicas normais, as reações não catalisadas tendem a ser muito lentas, além 
disso, muitas reações envolvem intermediários carregados, que torna desfavorável 
a formação, ou requerem a colisão de duas ou mais moléculas com a orientação 
precisa para que ocorra a reação. Uma enzima contorna esse problema 
fornecendo um ambiente específico onde uma reação é energeticamente mais 
favorável. A característica que distingue uma reação catalisada por uma enzima é 
a de ela ocorrer no interior de uma cavidade na enzima, chamada sítio ativo. A 
molécula que se liga ao sítio ativo é denominada substrato (LEHNINGER,1985). 
 O amido, representado na figura 2, é um homopolisacarídeo não-redutor 
constituído essencialmente por dois polissacarídeos, a amilose e amilopectina. São 
constituídos pela molécula α-glicose, porém são ligeiramente diferentes. A amilose 
corresponde a um polímero de cadeia normal com mais de 1000 moléculas de 
α-glicose unidas por meio de uma ligação α-1,4 glicosídica e está presente na 
 
 
proporção de 20 a 30%. Já a amilopectina é constituída por cadeias longas e muito 
ramificadas de unidades de α-glicose unidas entre a ligação α-1,4 glicosídica. A 
ramificação é resultado de ligações cruzadas entre o carbono número 1 de uma 
unidade de glicose e o carbono número 6 de outra unidade formando ligação α-1,6 
glicosídica e corresponde 70 a 80% restantes do amido.​ ​(SPIER, 2005) 
 
Figura 2.​​ Representação da estrutura do amido. 
 
 
A α-amilase e amiloglucosidase são enzimas capazes de romper as ligações 
α-1,4 e α-1,6 do amido, a partir da extremidade não redutora, até a formação da 
glicose. Essas enzimas são chamadas de enzimas amilolíticas e possuem diversas 
aplicações, como por exemplo, na indústria têxtil, alimentícia, ração animal, 
indústria química e farmacêutica (SPIER, 2005). 
As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido e seus 
derivados, pertencendo à classe das hidrolases, dentre as quais encontram-se a 
α-amilase, a βamilase e a amiloglucosidase. Esta última produz glicose a partir do 
amido, a β-amilase produz maltose e a α-amilase dá origem às dextrinas. Estas 
enzimas possuem grande importância biotecnológica com aplicações em 
alimentos, fermentação, indústria têxtil e de papel. Amilases podem ser obtidas de 
diversas fontes, incluindo plantas, animais e microrganismos. Atualmente, grande 
quantidade de amilases microbianas estão disponíveis comercialmente e tem 
substituído quase completamente a hidrólise química do amido (GUPTA et al., 
2003). As amilases são classificadas como endoamilases ou exoamilases 
conforme seu ponto de atuação. 
 
 
A α-Amilase pertencem à classe das endoamilases, atuando ao acaso ao 
longo das cadeias de amilose e amilopectina hidrolisando as ligações α-1,4 e 
liberando malto-oligossacarídeos. 
As ligações -(1,6) não são quebradas por esta enzima. Também α 
chamadas de enzimas dextrinizantes, estas enzimas são divididas em duas 
categorias, de acordo com o grau de hidrólise do substrato: a-amilases 
sacarificantes que hidrolisam de 50 a 60% do substrato, e as liqueficantes, que 
quebram 30 a 40% do substrato. De maneira geral, esta enzima ataca os grânulos 
de amido, formando dextrinas que serão hidrolisadas pela β-amilase (MC KNIGHT 
e MAZZIEIRO, 2000). A ação da -amilase sobre a amilose consiste no ataque α 
aleatório e rápido do substrato, resultando em maltose e maltotriose e em seguida 
uma etapa mais lenta permite a formação de glicose e maltose. A hidrólise da 
amilopectina pela a-amilase produz oligossacarídeos contendo ligações -(1,6), α 
além de glicose e maltose. A β-amilase trata-se de uma exoenzima que hidrolisa 
ligações β-(1,4) a partir da extremidade não redutora, produzindo maltose, não 
sendo capaz de hidrolisarligações -1,6 dos substratos ramificados, ou seja, esta α 
enzima é bloqueada por ramificações ou outras irregularidades na cadeia. Assim, a 
amilopectina é apenas parcialmente degradada pela β-amilase (MC KNIGHT e 
MAZZIEIRO, 2000). 
Figura 3.​​ Representação esquemática da ação das enzimas amilolíticas 
α-amilase, β-amilase, glicoamilase, isolamilase e pululanase. 
 
 
 
 
A atividade enzimática pode ser influenciada pelos fatores de temperatura, 
concentração de substrato, pH e a presença ou ausência de inibidores​. A 
velocidade de uma reação enzimática aumenta com o aumento da temperatura, 
mas a partir de uma determinada temperatura a velocidade da reação diminui 
bruscamente. O aumento de temperatura provoca maior agitação das moléculas e, 
portanto, maiores possibilidades delas se chocarem para reagir. Porém, se for 
ultrapassada certa temperatura, a agitação das moléculas se torna tão intensa que 
as ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompem e ela se 
desnatura. Para cada tipo de enzima existe uma temperatura ideal, na qual a 
velocidade da reação é máxima, permitindo o maior número possível de colisões 
moleculares sem desnaturar a enzima. A maioria das enzimas humanas tem sua 
temperatura ótima entre 35 e 40 ºC ​(​CISTERNAS, 2001). Além disso, à medida 
que aumenta a concentração do substrato, a enzima satura-se e a velocidade 
atinge o valor máximo (V​máx​), a saturação acontece, porque, à medida que é 
aumentada a concentração do substrato, aumenta também a quantidade de 
enzima presente sob a forma de complexo enzima-substrato, todos os sítios ativos 
estão ocupados com o substrato (LEHNINGER, 1985). 
A atividade enzimática é descrita através de velocidade máxima (V​máx​) e 
também da constante de Michaelis-Menten (K​m​) que representa a concentração do 
substrato a qual se detecta uma velocidade de reação igual à metade de 
velocidade máxima. Cada enzima possui um K​m para um cada substrato e este 
parâmetro é utilizado para demonstrar à força de ligação de um substrato a uma 
enzima (CISTERNAS, 2001). 
A aplicabilidade da lei de Michaelis-Menten pode ser verificada calculando 
(V) para valores de [S], usando as constantes V​m e K​m e comparando com a 
aplicabilidade da lei de Michaelis-Menten, usando as constantes V​m e K​m e 
comparando com a curva experimental. O processo acima não é tão preciso, uma 
vez que o valor de Km pode somente ser estimado de uma maneira aproximada, 
um método mais preciso consiste em aplicar a lei de tal forma que permita a 
obtenção de uma linha reta no gráfico (CISTERNAS, 2001). 
 
 
A forma mais comum de se determinar os parâmetros cinéticos (K​m e V​máx​) 
pode ser descrita pela equação de Michaelis-Menten, representada na forma 
inversa, pode ser vista na Equação 1, que representa uma equação do tipo: y = m 
x + b, em que 1/V toma o lugar do y e 1/[S] toma o lugar da coordenada x, a 
inclinação da reta é igual a K​m​/V​máx e o intercepto no eixo y é igual a 1/V​máx 
(CAMPBELL, 2007). 
 
 v
1 = 1v máx +
Km
v máx
1
[S] (1) 
 
A equação de Michaelis-Menten é chamada de equação de Lineweaver-Buk 
representada na Figura 3. 
 
Figura 4.​​ Gráfico de Lineweaver-Buk 
 
Fonte:​​ CAMPBELL, 2007 
 
2. OBJETIVO 
 
Os objetivos da aula é determinar o K​m de enzimas amilolíticas, identificar a 
que tem maior afinidade pelo substrato amiláceo e avaliar para assim determinar a 
temperatura e o tempo ótimo de ação da enzima. 
 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
3.1 Material - Parte 1 e 2 
 
● Extrato enzimático de malte; 
● Solução padrão de amido solúvel 
(1 mg mL​-1​); 
● Tampão fosfato pH 6; 
● Ácido acético 0,2 M; 
● NaOH 1 M; 
● 3,5 DNS; 
● Água destilada 
● Banho maria; 
● Recipiente para banho de gelo; 
● Tubos de ensaio; 
● Pêra de sucção; 
● Pipetas; 
● Espectrofotômetro. 
 
3.2 Métodos 
 
3.2.1 Parte 1 - Estudo da temperatura de reação enzimática para a 
enzima 
 
Tabela 1.​​ Procedimento para a reação enzimática 
Tubo 
Solução de 
amido 1% 
(mL) 
Tampão 
pH 6 
(mL) 
Água 
(mL) 
Extrato 
enzimático de 
malte (mL) 
Banho a 
55 °C 
(min) 
Banho 
maria (°C/5 
min) 
1 (B) 0 2,0 0,4 0,1 20 100 
2 0,1 1,9 0,4 0,1 20 100 
3 0,2 1,8 0,4 0,1 20 100 
4 0,5 1,5 0,4 0,1 20 100 
5 1,0 1,0 0,4 0,1 20 100 
6 1,5 0,5 0,4 0,1 20 100 
7 2,0 0 0,4 0,1 20 100 
 
Após o banho-maria, resfriar os tubos. 
 
 
 
3.2.2 Parte 1 - Quantificação de açúcares redutores 
 
Para a quantificação de açúcares redutores utilizou-se a curva padrão de 
glicose realizada em uma aula anterior. 
 
Tabela 2. ​​Procedimento para quantificação de açúcares redutores 
Tubo 
Meio da 
reação 
(mL) 
NaOH 
(mL) 
3,5 
DNS 
(mL) 
Banho a 
100 °C 
(min) 
Resfriar 
(min) Água Diluição 
1 (B) 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
2 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
3 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
4 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
5 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
6 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
7 2,5 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
 
 
3.2.3 Parte 2 - Temperatura ótima de reação 
Tabela 3.​​ Estudo da temperatura de reação enzimática para a enzima 
Tubo 
Solução 
de amido 
1% (mL) 
Tampã
o pH 6 
(mL) 
Água 
(mL) 
Extrato 
enzimático 
de malte 
(mL) 
Temperatura 
(°C) 
Tempo 
(min) 
Banho 
maria 
(°C/5 min) 
1 0,5 0,1 0,3 0,1 -15 Geladeira 15 100 
2 0,5 0,1 0,3 0,1 Temperatura ambiente 15 100 
 
 
3 0,5 0,1 0,3 0,1 37 15 100 
4 0,5 0,1 0,3 0,1 55 15 100 
5 0,5 0,1 0,3 0,1 70 15 100 
 
3.2.4 Parte 2 - Tempo ótimo de reação 
 
Tabela 4.​​ Estudo do tempo de reação enzimática para a enzima 
Tubo 
Solução 
de amido 
1% (mL) 
Tampão 
pH 6 
(mL) 
Água 
(mL) 
Extrato 
enzimático 
de malte 
(mL) 
Temperatura 
(°C) 
Tempo 
(min) 
Banho 
maria 
(°C/5 min) 
1 0,5 0,1 0,3 0,1 55 5 100 
2 0,5 0,1 0,3 0,1 55 15 100 
3 0,5 0,1 0,3 0,1 55 25 100 
4 0,5 0,1 0,3 0,1 55 35 100 
5 0,5 0,1 0,3 0,1 55 50 100 
6 0,5 0,1 0,3 0,1 55 60 100 
 
3.2.5 Parte 2 - Quantificação de açúcares redutores 
 
Para a quantificação de açúcares redutores utilizou-se a curva padrão de 
glicose realizada em uma aula anterior. 
 
Tabela 5. ​​Procedimento para quantificação de açúcares redutores 
Tubo 
Meio da 
reação 
(mL) 
NaOH 
(mL) 
3,5 
DNS 
(mL) 
Banho a 
100 °C 
(min) 
Resfriar 
(min) Água Diluição 
1 (B) 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
2 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
3 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 
 
 
3 mL de H​2​O 
4 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
5 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
6 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
7 1 1 3 5 5 10 1 mL de amostra: 3 mL de H​2​O 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Utilizou-se a curva padrão da glicose preparada em outra aula para 
quantificação dos açúcares redutores tanto na parte 1, como na parte 2. 
 
Figura 5.​​ Gráfico da curva padrão de glicose para posterior quantificação de 
açúcares redutores 
 
 
 3.1 Parte 1: 
Para o cálculo da concentração de amido, utilizou-se a seguinte relação, 
considerando a diluição realizada (como exemplo, usou-se o tubo 2): 
 
 
 
10 mg 1 mL 
x 0,1 mL 
x = 1 mg 
 
Lembrando que o volume total de diluição foi primeiramente 16,5 mL e logo 
3 mL. 
 
[S] = = 0,0606 mg/mL1 mg16,5 mL 
 
[S] = = 0,0202 mg/mL1 mg3 mL 
 
Para calcular a concentração de açúcares redutores, foi utilizado a equaçãoda reta da curva mostrada na Figura 2, onde y é a absorbância e x é a 
concentração. Já a velocidade, foi calculada a partir da concentração de açúcares 
redutores dividido pelo tempo de reação (20 minutos). O mesmo cálculo foi 
realizado para os outros tubos. 
 
Tabela 6. Dados obtidos da reação enzimática do extrato de malte e os valores de 
absorbância e concentração de açúcares redutores 
Tubo [S] amido 
AR 
(mg/mL) 
Velocidad
e 1/[S] 1/v Abs 1 Abs 2 Média 
Sem o 
branco 
1 0 - - - - 0,016 0,015 0,016 - 
2 0,0202 0,0200 0,00203 49,5 492,6 0,061 0,067 0,064 0,046 
3 0,0404 0,0406 0,00380 24,8 263,2 0,159 0,201 0,180 0,165 
4 0,1010 0,0760 0,00616 9,9 162,3 0,374 0,387 0,381 0,365 
5 0,2020 0,1232 0,00857 4,9 116,7 0,663 0,632 0,648 0,632 
6 0,3030 0,1714 0,00965 3,3 103,6 0,925 0,915 0,920 0,905 
7 0,4040 0,1929 0,00136 2,5 735,3 0,104 0,104 0,104 0,089 
 
 
 
A partir dos dados obtidos, plotou-se os gráficos de Michaelis-Menten e 
Lineweaver-Buk para a posterior determinação de K​m​. 
 
Figura 6.​​ Gráfico de Michaelis-Menten (v vs [S]) 
 
 
Pelo gráfico de Michaelis-Mentem o valor obtido de K​m foi de 0,059, no qual 
a V​máx é dividida pela metade e então é traçado uma linha, sendo o valor 
encontrado um valor aproximado. 
 
Figura 7.​​ Gráfico de Lineweaver-Buk (1/v vs 1[S]) 
 
 
 
 
Através da equação da reta obtida pela curva de Lineweaver-Buk, foi 
possível determinar o K​m​, ao igualar a zero e encontrar o valor de x. 
 
0 = 8,3144 x + 74,029 
x = - 8,904 
 
Utilizando a Equação 2 abaixo, determinou-se o valor de K​m​. 
 
 x = − 1Km (2) 
 
O valor encontrado de K​m​ por Lineweaver-Buk foi de 0,112. 
 
3.2 Parte 2: 
 
Para a temperatura ótima de reação, foram obtidos os seguintes valores de 
absorbância de cada temperatura, que podem ser observadas na Tabela 7. 
 
Tabela 7.​​ Absorbâncias obtidas para cada temperatura testada 
Tubo Temperatura (°C) 
Absorbância 
1 
Absorbância 
2 Média 
1 - 15 0,283 0,289 0,286 
2 25 0,351 0,349 0,35 
3 37 0,491 0,488 0,490 
4 55 0,495 0,506 0,501 
5 70 0,179 0,267 0,223 
 
Para a determinação da concentração de açúcares redutores, utilizou o 
gráfico da curva padrão da glicose, da Figura 3. No qual a equação da reta é: 
 
y = 5,6579 x - 0,0651 
 
 
 
Onde y é a absorbância e x a concentração dos açúcares redutores. 
Sendo assim, a concentração obtida pode ser observada na Tabela 8 
abaixo. 
 
Tabela 8. Concentração de açúcares redutores obtidos através da curva padrão de 
glicose para cada temperatura testada 
Tubo Temperatura (°C) 
Concentração de açúcares 
redutores (mg/mL) 
1 - 15 0,0621 
2 25 0,0734 
3 37 0,0981 
4 55 0,1001 
5 70 0,0509 
 
A partir das concentrações obtidas, plotou-se um gráfico para melhor 
visualizar a temperatura ótima da reação enzimática. 
 
Figura 8. ​​Gráfico da influência da temperatura sobre as enzimas do extrato 
de malte com o tempo de reação de 15 minutos 
 
 
 
 
Dentre as temperaturas testadas, aquela que obteve a maior concentração 
de açúcares redutores, ou seja, a temperatura em que a enzima teve a sua melhor 
atuação e foi considerada a temperatura ótima foi a de 55°C. A temperatura de 37 
°C possuiu uma boa atuação e a diferença foi pouquíssima em relação a de 55 °C, 
para uma melhor avaliação é sugerido posteriores testes com temperaturas entre 
37 a 55 °C para um menor gasto de energia e uma reação eficiente com a menor 
temperatura ótima. 
Como já citado anteriormente, a velocidade da maioria das reações 
químicas aumenta quando a temperatura aumenta, devido a agitação das 
moléculas. Para as reações enzimáticas, entretanto, as elevações além de certa 
temperatura reduz drasticamente a velocidade de reação. No qual, a temperatura 
ótima para a maioria das enzimas se situa entre 35 a 40 °C. A redução da 
velocidade de reação acima da temperatura ótima é devida a desnaturação das 
enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura tridimensional característica (NAIDEK, 
2016). 
Para a avaliação do tempo ótimo, foram obtidos as seguintes absorbâncias, 
que podem ser vistas na Tabela 9. 
 
Tabela 9.​​ Absorbâncias obtidas para cada tempo testado 
Tubo Tempo (min) 
Absorbância 
1 
Absorbância 
2 Média 
1 5 0,412 0,412 0,412 
2 15 0,479 0,479 0,479 
3 25 0,491 0,505 0,498 
4 35 0,471 0,465 0,468 
5 50 0,480 0,523 0,502 
6 60 0,433 0,482 0,458 
 
Vale ressaltar, que a concentração de amido para o estudo da temperatura 
e o tempo ótimo, foi de 0,5 mg/mL. 
 
 
Para a determinação da concentração de açúcares redutores, realizou-se o 
mesmo procedimento da temperatura ótima. Ou seja, através da equação da reta 
da curva padrão de glicose. 
 
Tabela 10. Concentração de açúcares redutores obtidos através da curva padrão 
de glicose para cada tempo testado 
Tubo Tempo (min) 
Concentração de açúcares 
redutores (mg/mL) 
1 5 0,0843 
2 15 0,0962 
3 25 0,0995 
4 35 0,0942 
5 50 0,1002 
6 60 0,0923 
 
A partir das concentrações obtidas, plotou-se um gráfico para melhor 
visualizar o tempo ótimo da reação enzimática. 
 
Figura 9. ​​Gráfico da influência do tempo sobre as enzimas do extrato de 
malte na temperatura de reação de 55 °C 
 
 
 
 
Dentre os tempos testados, o tempo de 25 e 50 minutos obtiveram a maior 
concentração de açúcares redutores, ou seja, o tempo em que a enzima possui 
uma melhor atuação, porém visando diminuir o tempo, o tempo considerado ótimo 
foi de 25 minutos. Assim como, é possível observar que o tempo não tem tanta 
influência na reação enzimática, pois a concentração de açúcares redutores foram 
todas muito próximas. 
 
4. CONCLUSÃO 
 
Através da realização das práticas, obteve-se o valor de K​m pelo método de 
Michaelis-Menten e de Lineweaver-Buk, sendo eles 0,059 e 0,112, 
respectivamente. Além disso, determinou-se a temperatura ótima de 55°C (com o 
tempo de reação de 15 minutos) para a ação das enzimas do extrato de malte 
sobre o amido e o tempo ótimo, ou seja, melhor desempenho de hidrólise a 55°C 
em 25 minutos. 
 
5. REFERÊNCIAS 
 
LEHNINGER, A. L. ​PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA​​. 2. ed. São Paulo: Editora 
Sarvier,1985 
 
CISTERNAS, J.R.; VARGAS, J.; MONTE, O. ​Fundamentos de Bioquimica 
Experimental. ​​São Paulo: Editora Atheneu, 2ª Ed., 2001 
 
CAMPBELL, Mary K. ​Bioquímica​​. 3. ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2007 
 
SPIER, M. R. PRODUÇÃO DE ENZIMAS AMILOLÍTICAS FÚNGICAS α-AMILASE 
E AMILOGLUCOSIDASE POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO. 
Dissertação de mestrado​​, 2005. Disponível em: 
<https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/handle/1884/4684/Disserta%E7%E3o%20de
%20Mestrado%20-%20Michele%20Rigon%20Spier.pdf;jsessionid=47CC74D13B5
F3F52BAC164E34A81A878?sequence=1> 
 
SANTANA, RSM. Produção de enzimas amilolíticas através da fermentação em 
estado sólido. ​Tese de Doutorado​​. Universidade estadual do sudoeste da Bahia, 
 
 
Itapetininga, BA, 2012. Disponível em: 
<http://www2.uesb.br/ppg/ppgecal/wp-content/uploads/2017/04/RENATA-MAFRA.p
df> 
 
NAIDEK, K. Cinética Enzimática, 2016. Disponível em: 
<http://www.joinville.udesc.br/portal/professores/karine/materiais/Aula_09.pdf> 
 
Guandalini, Natália Capeletti G931e Estudo da produção de enzimas amilolíticas 
pelo fungo Metarhizium ansiopliae utilizando resíduos amiláceos como substrato / 
Natália Capeletti Guandalini. – Campinas, SP:, 2007. Disponível em: 
<http://repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/255479/1/Guandalini_NataliaCapeletti_M.pdf>