Material 1 (Microbiologia Industrial)

Prévia do material em texto

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Prof. Reinaldo Bastos
Curso de Biotecnologia
Ementa
Formulação de meios de cultura para fermentação.
Manutenção de culturas. Testes de rendimento e seleção.
Monitoramento de micro-organismos durante processosMonitoramento de micro-organismos durante processos
fermentativos. micro-organismos e processos de produção
de etanol, ácidos orgânicos, proteínas,aminoácidos,
enzimas, antibióticos, solventes, polissacarídeos e lipídeos.
Programação
1) Introdução a processos microbiológicos industriais
2) Bioquímica microbiana, formulação de meios de cultura e tipos de micro-
organismos de interesse industrial
3) Balanços de massa e energia nos cultivos microbianos
4) Estequiometria, balanço do grau de redução dos substratos, requerimento de 
nutrientes e oxigênionutrientes e oxigênio
5) Cinética dos processos microbiológicos
6) Monitoramento dos processos fermentativos, cálculo de velocidades de 
transformação, produtividade e rendimento
6) Tecnologia das fermentações (cultivos submersos e em estado sólido)
7) Fermentações industriais (produção de etanol, ácidos orgânicos, proteínas, 
antibióticos, polissacarídeos, lipídios e tratamento biológico de resíduos)
Avaliações: 17/10 e 05/12/2013 (90% da nota final) + trabalho extra-classe
Bibliografia
Bibliografia
Borzani et al. Biotecnologia Industrial: Fundamentos, Vol. I - IV, Ed. Edgard Blücher, 
2001.
Bailey & Ollis. Biochemical Engineering. 2ª ed. 1986, Ed. McGraw-Hill. New York. 
Doran, P. Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. 5a. ed. 2000. 
Levenspiel, O. Engenharia das reações químicas. Edgar Blücher Ltda. 2000. 
Shuler & Kargi. Bioprocess Engineering - Basic Concepts. Prentice Hall 
International Series. 1992. 
Aiba, Humphrey & Milis. Biochemical Engineering. Academic Press. 1965.
Crueger & Crueger. Biotecnologia: Manual de Microbiologia Industrial. Editorial 
Acribia. 1993.
Roels, J.A. Energetics and kinetics in biotechnology. Elsevier Biomedical Press. 
1983.
Rhodes & Fletcher. Principios de Microbiologia Industrial. Editorial Acribia. 1969.
Stanbury, P.F.; Whitaker, A. & Hall, S. Principles of Fermentation Technology. 
Elsevier Science. 2003.
Definições
� Engenharia Bioquímica/Bioengenharia: campo de atividade multidisciplinar de 
aplicação das ciências da engenharia (cinética, termodinâmica e fenômenos de 
transporte) nos processos biotecnológicos, os quais envolvem micro-organismos e/ou 
enzimas
� Biorreatores (fermentador, dorna): recipientes onde ocorrem reações bioquímicas, ou � Biorreatores (fermentador, dorna): recipientes onde ocorrem reações bioquímicas, ou 
seja, catalisadas por enzimas ou envolvendo crescimento de micro-organismos. 
� Processos submersos: processos biotecnológicos onde o biocatalisador (enzimas ou 
micro-organismos) encontram-se em suspensão num meio líquido. Normalmente são 
consideradas biorreações numa única fase (homogêneos)
� Processos em estado sólido: envolvem o crescimento de micro-organismos na 
ausência de água livre, utilizando-se suportes sólidos (processo heterogêneo)
� Processos com catalisadores imobilizados: biorreações com enzimas ou micro-
organismos confinados num espaço físico definido (processo heterogêneo)
Definições e terminologia
� Fermentação: processo bioquímico de catabolismo, ou seja, conversão anaeróbia 
de compostos orgânicos complexos tais como carboidratos em moléculas mais simples 
tais como alcoóis e ácidos orgânicos. Ex: fermentação alcoólica/etanólica; ou seja, 
processo de conversão anaeróbia da glicose em etanol realizado principalmente por 
Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
� Substrato (mosto): compostos que são consumidos para obtenção de energia nos 
cultivos microbianos
� Produto: moléculas produzidas devido ao metabolismo microbiano; encontram-se 
no vinho (mosto fermentado) e vinho delevurado (sem micro-organismos)
� micro-organismos: metabolismo heterotrófico (aeróbio ou anaeróbio) ou autotrófico
Engenharia Bioquímica/Bioengenharia
Microbiologia Industrial
Louis Pasteur Alexander FlemingMaud Menten Leonor Michaelis
Jacques Monod
Engenharia Bioquímica/Bioengenharia
Microbiologia Industrial
James Watson & Francis Crick
Walter Borzani - EP/USP Vitalis Moritz - EQ/UFRJ
Histórico
� 6000 a.C. : Bebidas alcoólicas no Egito
� 4000 a.C. : Pão, queijo e iogurte
� 1150 d.C. : Produção de vinagre a partir de vinhos
� Século XIV: Estabelecimento da indústria de vinagre
� 1700: Invenção do microscópio por Antonie von Leeuvenhoek
�1789: Lavoisier demonstra que a fermentação produz etanol e CO�1789: Lavoisier demonstra que a fermentação produz etanol e CO2
� 1810: Gay-Lussac propõe balanço de massa da produção de etanol a partir de 
glicose
� 1837: Erxleben, De La Tour, Schawnn & Kützing demonstram que as leveduras são 
causadoras da fermentação
� 1857: Pasteur descobre que as leveduras são seres vivos
� 1894: Obtenção de culturas puras de leveduras por Hansen, Müller-Thurgau & 
Wortman
� 1897: Buchner descobre que extrato de leveduras apresenta a propriedade de 
transformar açúcar em etanol – Marco Inicial da Bioquímica
� 1900: Produção de diversos bioprodutos (acetona, glicerol, butanol e ácido cítrico)
Histórico
� 1928: Descobrimento da penicilina por Fleming
� 1945: Engenharia Bioquímica
- Descoberta de diversos antibióticos
- Produção industrial da penicilina- Produção industrial da penicilina
- Desenvolvimento de reatores com sistema de aeração e assepsia
� 1975 aos tempos atuais
- Desenvolvimento da engenharia genética e técnicas de biologia molecular
- Utilização de micro-organismos engenheirados
- Engenharia metabólica: aumento do rendimento dos processos biotecnológicos 
por mudanças nas reações/rotas metabólicas existentes ou inclusão de novas 
rotas através da técnica de DNA recombinante
Estágios cronológicos da microbiologia industrial
Estágio Produtos 
principais
Processo Seleção de micro-organismos
Pré 1900 Álcool
Vinagre
Batelada, em tanques de madeira e cobre
Batelada, barris e bandejas
Culturas puras usadas 
primeiramente na cervejaria 
Calsberg em 1886
Fermentações inoculadas com 
vinagre
1900 – 1940 Levedura de 
panificação, ácido 
cítrico, ácido 
láctico e acetona
Batelada e sistemas semi-contínuos em 
tanques de aço de centenas de metros 
cúbicos
Uso de culturas puras
láctico e acetona
1940 – dias atuais Penicilina e outros 
antibióticos, 
aminoácidos, 
nucleotídeos, 
enzimas
Tanques mecanicamente aerados, operados 
assepticamente, com eletrodos de pH e 
oxigênio, processos contínuos e em batelada
Seleção programada de micro-
organismos e mutações
1964 – dias atuais Proteínas 
unicelulares a 
partir de resíduos
Tanques pressurizados, configurações para 
contornar problemas de transferência de 
calor, processos contínuos com reciclos
Linhagens geneticamente 
modificadas
1979 – dias atuais Proteínas 
heterólogas e 
anticorpos 
monoclonais
Fermentadores adaptados para células 
animais com sensores de controle
Introdução de genes em 
células microbianas e animais 
(técnica do DNA 
recombinante)
Distribuição das Empresas de Biotecnologia por Segmentos de Mercado
Multinacionais
Instrumentação
Distribuição de Empresas de Biotecnologia por 
Região
Distribuição de Empresas de Biotecnologia por 
Estado
Análise e monitoramento de processos industriais
Balanço de massa
CentrífugaSubstatos
Água (A) Biomassa
CO2
Cuba
Biorreator
Água (A) Biomassa
Inóculo
Meio contendo os 
produtos
Produto final
Estequiomentria
Análise e monitoramento de processos industriais
Cinética
Análise e monitoramento de processos industriais
CÉLULASMICROBIANAS 
O que são? 
Como trabalham? 
Como podemos modificá-las e adaptá-las? 
Como podemos equacionar o seu trabalho em processos industriais? 
���� Parâmetros de transformação
���� Balanços de massa e energia���� Balanços de massa e energia
���� Equações cinéticas e reatores
Exemplos de aplicações 
industriais de micro-organismos
Agentes de fermentação em diversos processos
Leveduras na produção etanol
Fungos filamentosos na produção de enzimas, ácido cítrico, antibióticos
Diversas bactérias na indústria de alimentos, farmacêutica e tratamento Diversas bactérias na indústria de alimentos, farmacêutica e tratamento 
de efluentes
Produção de single-cell protein
Leveduras, fungos filamentosos e microalgas
Fixadores de nitrogênio na agricultura
Bactérias do gênero Rhizobium
Controle biológico de pragas
Produção de vacinas
Exemplos de micro-organismos e 
produtos obtidos
� Leveduras do gênero Saccharomyces: para bebidas alcoólicas e etanol
� Acetobacter sp. : produção de vinagre
� Aspergillus niger : ácido cítrico, amiloglicosidase� Aspergillus niger : ácido cítrico, amiloglicosidase
� Lactobacillus: ácido lático, bebidas lácteas
� Propionibacterium: cianocobalamina (B12)
� Penicillium chrysogenum : penicilina G
� Xanthomonas campestris: goma xantana
� Corynebacterium glutami: glutamato monossódico
� Escherichia coli e Bacillus megaterium: penicilina G acilase (E.C. 3.5.1.11)
Exemplos de micro-organismos e 
produtos obtidos
� A venda de antibióticos movimentou R$ 760 milhões no Brasil, 
representando 40% dos medicamentos consumidos
� Na safra 2010/2011 foram produzidos no Brasil 27,6 bilhões de litros de 
álcool (8 bilhões de litros de anidro e 19,6 de hidratado), contra 60 bilhões 
de litros nos EUA 
� Ácido cítrico: 1,4 milhão ton/ano
� Ácido acético: 5 milhões ton/ano
Critérios para a escolha de micro-organismos 
de interesse industrial
� Características nutricionais (projeto do meio de cultivo)
� Condições físico-químicas adequadas para instalação 
industrial (pH, temperatura, aeração, agitação)
� Elevada rendimento dos substratos nos produtos de 
interesse industrial (baixa produção de substâncias incompatíveis)
�Adequação do micro-organismo com o equipamento
� Estabilidade do micro-organismo
micro-organismos engenheirados
Obtenção de um produto microbiano ou 
enzimático 
Conhecimento prévio do catalisador
Enzima:
- Estrutura e estabilidade no armazenamento- Estrutura e estabilidade no armazenamento
micro-organismo:
Forma de preservação da cultura 
- congelado com crioprotetores
- liofilização
- repiques em slants
- criotubos (esporos)
Isolamento, preservação e propagação de micro-
organismos de interesse industrial
� National Collection of Type Cultures (NCTC) – London, UK
� American Type Culture Collection (ATCC) – Rockville/MD, USA
� Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSM) – Braunschweig, � Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSM) – Braunschweig, 
Germany
�Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM) – Institute Pasteur, 
Paris, France
�Japan Collection of Microorganisms (JCM) – Saitama, Japan
� Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia André Tosello – Campinas, Brasil
Inóculo
Escalonamento do inóculo em fase laboratorial
× A cultura pura adquirida vai sendo sucessivamente escalonada para
volume maiores de mosto esterilizado, na proporção aproximada de 1: 5,
aumentando gradativamente o teor de açúcar fermentescível a fim de
adaptar a levedura a pressões osmóticas crescentes
De acordo com STANBURY et al. (2003), os cinco principais grupos de 
“fermentações” industriais mais importantes são:
Obtenção de um produto microbiano ou 
enzimático 
� processos em que o produto é a própria massa microbiana 
� produção de enzimas microbianas
� produção de metabólitos microbianos
� obtenção de produtos recombinantes
� biotransformação ou bioconversão de compostos
micro-organismo (fase biótica)
Cinética do crescimento do micro-organismo
Obtenção de um produto microbiano ou 
enzimático 
� Cinética do crescimento do micro-organismo
� Escolha das fontes de carbono e nitrogênio, adição de 
sais (enxofre, fósforo) e micronutrientes (vitaminas)
� Determinação experimental ou teórico dos 
rendimentos e produtividades
� Meios de cultivo complexas
� Fontes típicas
Soro do queijo, extrato de levedura, água de maceração de milho 
Obtenção de um produto microbiano 
ou enzimático 
Soro do queijo, extrato de levedura, água de maceração de milho 
� Fontes sintéticas : custo maior 
Ex: Glicose, glicerol, sulfato de amônia, aminoácidos, vitaminas 
puras, solução de sais inorgânicos , hidrolisados protéicos 
Autotróficos: CO2 (anabolismo)
Heterotróficos: fontes orgânicas (catabolismo)
Obtenção de produtos microbianos
Produtos da redução microbiana de piruvato:
A) ácido láctico (Streptococcus, Lactobacillus)
B) Clostridium propionicum
C) Leveduras, Acetobacter, Zymomonas
D) Clostridia
E) Klebsiella
F) Leveduras
G) Bactérias do ácido butírico
H) Bactérias do ácido propiônico
Obtenção de produtos microbianos
Relações entre as rotas metabólicas principais e o metabolismo secundário
Estudo cinético
Cinética de crescimento do micro-organismo
� Cinética de consumo dos substratos e formação dos produtos
Condições de cultivo:Condições de cultivo:
- pH
- temperatura
- concentração limitada de substratos e nutrientes
Carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, cálcio, magnésio, sódio, zinco, ...
Relações C/N e N/P 
- disponibilidade de oxigênio
- efeito de inibidores
�Cinética de consumo de substrato
Determinação experimental (empírica) ou teórica de YX/S
Estudo cinético
�Cinética de formação do produto
� Associada (YP/X)
� Não associada
pH
Temperatura
Inibição
Produção de metabólitos primários ou secundários
Estudo cinético
Escolha do tipo de reator
Biocatalisador livre ou imobilizado?
Superfície (líquido ou semi-sólido) ou submerso?
- Submerso: forma de agitar o líquido
Fluxo tubular?
Se imobilizado, em leito fixo ou fluidizado?
Mistura?
- Agitação mecânica (maioria dos casos para dissolução dos gases e mistura dos 
sólidos)
- Outras configurações
Fluxo em vórtice
Fluidizado
Air-lift
Confinados entre membranas
Escolha do tipo de reator
Escolha do tipo de operação
� Descontínua
– Flexível, bom controle do produto por lote, baixa contaminação, baixa 
produtividade (altos tempos mortos)produtividade (altos tempos mortos)
� Contínua
– Alta produtividade, risco de contaminação e mutação, difícil controle de 
qualidade
� Semi-contínua 
– Ocorre em tanques grandes descontínuos
– Permite manter baixa concentração de nutrientes (evita repressão 
catabólica)
Separação do produto
Separação entre meio de cultura (caldo de fermentação) e micro-organismos 
(filtração e centrifugação)
Se o produto é biomassa ?– Se o produto é biomassa ?
– Produto intracelular ?
– Produto extracelular ?
Relação entre o preço de venda e a concentração do 
bioproduto após as etapas de downstream
Fornecimento de O2
- Aeróbio restrito, aeróbio facultativo e anaeróbio
- O2 : aceptor final de elétrons nos cultivos aeróbios
- Submerso: borbulhamento de ar (difusão e aeração forçada)
- Superfície (apenas difusão)
Solubilidade de oxigênio em água pura e 1atm Solubilidade de oxigênio em água pura e 1atm 
de pressão de ar (0,209atm de O2)
Esterilização de meios e equipamentos
� Esterilização:
– Vapor úmido (mínimo 20 minutos/120°C ) e seco (acima de 150 °C )
– O aumento da temperatura e do tempo aumenta a perdade 
nutrientes termo sensíveis (vitaminas)
– Binômio tempo-temperatura– Binômio tempo-temperatura
� Pasteurização (eliminação de patogênicos)
62°C/30 minutos ou 75oC/15 segundos
- Desinfecção
- Filtração
Processos não térmicos (UV, micro-ondas, alta pressão, fluidos supercríticos, 
aplicação de campos elétricos/magnéticos)
Processo Químico Típico
Preparo
Reação
Reagentes Matéria-prima
Separação 
Estocagem
Produtos
Subprodutos Efluentes
BioprocessoBioprocesso típicotípico
Células
Preparo
Biorreação
Preparo 
do inóculo Esterilização
Meio de 
Cultura
upstream
Produtos
Subprodutos Efluentes
Recuperação e 
Purificação de 
Bioprodutos
downstream
Comparação entre processos químicos e Comparação entre processos químicos e 
bioquímicosbioquímicos
Características Reator Químico Biorreator
Concentração, Pressão não diluída, Alta diluída, Baixa
Temperatura -100 a 1200°C 15 a 40 °C 
Acidez, Alcalinidade Extremo Pequena faixaAcidez, Alcalinidade Extremo Pequena faixa
(Valor de pH) (3 a 8)
Taxa de reação Alta Baixa
Tempo de vida do meses, anos geralmente curto
catalisador
Seletividade freqüentemente alta moderada a baixa
Reator sistemas pequenos e compactos alto, volumoso
Produtividade Alta Baixa
Modo de operação contínuos, descontínuos
especialidades descontínuos
Escalas de biorreatores
� Até 1 a 2 m3 : micro-organismos patogênicos, crescimento de 
células animais e vegetais e bioprodutos ligados à área de 
saúde (vacinas)saúde (vacinas)
� 10 a 100 – 200 m3 : Produção de enzimas, antibióticos e 
vitaminas
� Até milhares de m3 : Processos que não exigem muita assepsia 
(fermentação alcoólica, tratamento biológico de resíduos)
Escalas de biorreatores
Desafio
Escalonamento de Processos
Escala Processo Fase do Volume da Concentração
produto fermentação do produto
Etanol L Larga variação 7 - 12%
Polissacarídeos L+S 40 - 200 m3/ bat 3%
Ácidos orgânicos S 50 - 250 m3/ bat 10%
Escala de produção de vários processosEscala de produção de vários processos
L
a
r
g
a
Penicilina G, V L 40 - 200 m3/ bat 3 - 5%
Cefalosporina L 50 - 200 m3/ bat 3%
Estreptomicina L 40 - 200 m3/ bat 1,5%
Enzimas extracelulares L 10 - 200 m3/ bat 0,05 - 1%
Enzimas intracelulares S 40 - 100 m3/ bat << 0,1%
Glucose isomerase S 40 - 200 m3/ bat 3 - 5%
Vitamina B12 S 40 - 100 m3/ bat 0,005%
M
é
d
i
a
P
e
q
u
e
n
a
Propagação do inóculo e escala de produção 
industrial
Propagação do inóculo e escala de produção 
industrial
Exemplo de processo microbiológico industrial
Produção de biomassa
Processo de fabricação de levedura de panificação
6% açúcares
25-30ºC/ 24-48 horas
ar filtrado e esterilizado