LABORATORIO DE CITOLOGIA Ciencias Biologicas

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LABORATORIO DE CITOLOGIA - Ciencias Biologicas
ROTEIRO 1
Microscópio Óptico Composto - MOC
O microscópio é uma ferramenta muito utilizada e indispensável para os estudos em diversas áreas, o MOC tem a finalidade de ampliar as imagens, para que elas possam ser estudadas e analizadas.
O MOC é composto pelas seguintes partes:
1- Pé ou Base: suporta o microscópio para que ele tenha estabilidade.
2- Braço ou Coluna: peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio. 
3- Tubo ou Canhão: cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objectivas. 
4- Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador. Apresenta geralmente 2 pinças destinadas a imobilizar as preparações. 
5- Parafuso Macrométrico: engrenagem cuja rotação é responsável por movimentos verticais da platina, rápidos e de grande amplitude. Permite afastar ou aproximar a platina das objectivas rapidamente. É indispensável para fazer a focagem. 
6- Parafuso Micrométrico: Afasta ou aproxima a platina das objectivas ao imprimir-lhe movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio. 
7- Revólver: disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objectivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objectiva. 
8- Charriot: Movimenta a lâmina de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina como um todo.
9- Sistema de Oculares e Sistema de Objectivas: o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objecto. A ampliação total dada pelo microscópio é igual ao produto da ampliação da objectiva pela ampliação da ocular. 
10- Ocular: capta a imagem ampliada pela objectiva, ampliandoa, através do seu sistema de lentes e permite a sua observação pelo olho humano. As oculares mais usadas são as de ampliação 10X.
11- Objectivas: Ampliam a imagem do objecto a ser observado, através do sistema de e lentes que a compõem. 
12- Fonte Luminosa: existem vários tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada (iluminação artificial), ou um espelho que reflicta a luz solar (iluminação natural). Os dois tipos de iluminação tem virtudes e defeitos, mas destinam-se os dois à iluminação da preparação, possibilitando assim a sua visualização. 
13- Diafragma: regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio. 
14- Condensador: distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz que atravessa o diafragma.
O óleo de imersão só deve ser usado com a objetiva de 100x.
OBSERVAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS BUCAIS
Materiais:
- Microscópio Óptico Composto (Microscópio de Luz)
- Espátula de Madeira descartável
- Lámina de vidro
- Lamínula
- Azul de Metileno
- Papel de Filtro
Fizemos a coleta utilizando a espátula de madeira raspamos dentro da boca, nas bochechas e retiramos o material biológico, esse material foi depositado na lâmina e pingamos uma gota de azul de metileno sobre o material, não podemos demorar muito tempo para fazer esse processo para que não ocorra alteração nos resultados. A seguir devemos posicionar a lamínula sobre a lâmina formando um ângulo de 45o e somente depois baixar a lamínula para que ela fique sobre a lâmina, de forma que não ocorra a formação de bolhas.
Em alguns segundos acontece uma reação química entre as células e o corante azul de metileno e formam sais. 
Iniciamos a observação no microscópio, utilizando o parafuso macrométrico para a observação, mexendo no parafuso micrométrico continuamos fazendo nossas observações 100x - 400x.
Pudemos observar que o núcleo e sua morfologia celular encontra-se em uma tonalidade azul mais intensa e o citoplasma possui uma tonalidade azul mais clara. Também pudemos observar os limites plasmáticos, células epiteliais (que podem ser observadas de frente, de perfil, isoladas e aglomeradas), e granulações inespecíficas no citoplasma entre outros grânulos sobre as células (bactérias). Quanto menor a higiene bucal, maior a quantidade de bactérias.
Externamente a nossa pele é coberta por uma camada de escleroproteina chamada queratina, externamente ela é formada por dois tecidos, externamente tecido epitelial e internamente tecido conjuntivo. Já a nossa parede interna da boca é chamada mucosa, que também é formada por tecido epitelial e conjuntivo, mas nāo contém a camada de queratina.
Esse mesmo exercício foi repetido sem a utilização do azul de metileno, dessa forma tivemos que trabalhar com o diafragma e a iluminação para fazermos nossas observações.
ROTEIRO 2, 3 e 4
Interpretação tridimensional de cortes macro e microscopicamente e preparação de esfregaço para sangue periférico segundo a técnica de Leishman.
Materiais: 
- Microscópio óptico composto - MOC (Microscópio de luz) 
- Lâmina de fígado corada por H&E 
- Lâmina de fígado corada por H + PAS 
- PAS = Ácido Periódico + Reativo de Schiff
Procedimento: 
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X Fígado por H&E 
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X: Fígado por H + PAS.
Pudemos observar o fígado corado por H&E, Hematoxilina + PAS e só por PAS. A Hematoxilina é um corante básico (alcalino), age sobre as estruturas ácidas como o núcleo, por isso deixa o núcleo roxo, porque produz um sal roxo mais água. Enquanto que a Eusina produz uma cor rosada e água.
O fígado corado por H + Pas evidencia o glicogênio.
Interpretação de cortes Interpretação tridimensional de cortes histológicos bidimensionais.
Materiais Peciolo de mamona, ovos cozidos, abacate.
Tipos de cortes Transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial.
Conhecimentos adquiridos Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
ROTEIRO 5
Preparação da lâmina para sangue periférico esfregaço de sangue, método de coloração Leishman
O esfregaço, distensão ou extensão sanguínea é um teste que serve para que se possa identificar anormalidades nas céluas do sangue, e dessa forma apontar doenças, investigar distúrbios e parasitas, como o Plasmodium, causador da malária.
O teste é feito quando colocamos uma fina camada de sangue sobre uma lâmina e observamos no microscópio, após prepará-la e usar os corantes para identificação.
Material: 
Sangue periférico, lâmina, álcool, lanceta estéril, lâmina extensora, cronómetro., suporte para coloração, água destilada ou deionizada.
Técnica: Leishman 
O leishmam é uma técnica de coloração para fazer os esfregaço. É composto de eosina azul de metileno e álcool metílico.
Os corantes utilizados para executar a técnica do esfregaço tem o pH dependente da solução, os tons apresentados são vermelhos (ácido) e azulados (base). 
Seqüência na preparação da lâmina:
1- Fazer a assepsia do dedo em algodão embebido com álcool; 
2- Furar o dedo utilizando uma microlanceta; 
3- Colocar a gota de sangue na extremidade de uma lâmina histológica breviamante limpa; 
4- Utilizando-se de outra lâmina histológica, fazer corretamente o esfregaço deixando uma película de sangue sobre a lâmina; Segurar a lâmina, contendo a gota de sangue, com os dedos polegar e indicador da mão esquerda; Inclinar uma outra lâmina histológica a 450 , segurandocom os dedos polegar e indicador, da mão direita. Levar a lâmina inclinada até o início da gota de sangue; Quando a lâmina toca na gota, o sangue escorre em seu bordo. Ai deve-se fazer voltar a lâmina inclinada para trás, formando-se então a película de sangue. 
5- Deixar secar ao ar;
6- Colocar a lâmina sobre um suporte na pia; 
7- Cobrir o esfregaço com Leishman e deixar por 4 minutos; 
8- Sem retirar o Leishman, adicionar água destilada e deixar por 7 minutos; 
9- Escorrer a lâmina na pia; 
10- Lavar a lâmina com água destilada; 
11- Deixar secar ao ar;
12- Observar a lâmina com 1000x de aumento, utilizando a objetiva de imersão; 
Técnica de Panóico para esfregaço do sangue
São três os corantes utilizados:
Corante I - Solução de triarilmetano 0,1% (10”) agente fixador
Corante II - Solução de xantenos 0,1% (8”) corante dos glóbulos vermelhos
Corante III - Solução de tiazinas 0,1% (5”) corante dos glóbulos brancos e das plaquetas.
Após essa passagem pelos corantes é só deixar secar e observar as células sanguíneas, os corantes são utilizados para que se possa atingir todas as células. Os corantes possuem afinidades de estrutura celular por combinação, é isso que proporciona as diferentes cores e facilita a visualização.
Essa técnica pode ser utilizada para diagnóstico de anemias (ferropriva e talassêmica), anemias microcíclica e perniciosa, além de trombositose, malária, leucemia, linfomas ou insuficiência da medula óssea entre outras.
Quando fazemos o esfregaço podemos detectar a presençaa de paiquilócitos no sangue, que são formas anormais dos eritrócitos em 10% ou mais da população total destes. Isso nos ajuda a diferenciar os tipos de anemia. Os poiquilócitos podem ser desenvolvidos por alterações bioquímicas nas membranas dos eritrócitos, alterações enzimáticas, envelhecimento do eritrócito, defeitos na molécula de hemoglobina, etc.
Observação de Sangue periférico 
1- Observar com 1000x de aumento. 
2- Utilizar o óleo de imersão 
3- Observar as hemácias (também denominados eritrócitos ou glóbulos vermelhos), leucócitos (também denominado glóbulos brancos) e as plaquetas. 
O número de hemácias varia de 4,5 a 6 milhões por mm^3 de sangue, o número de leucócitos de 8.000 a 10.000 por mm^3 de sangue e o de plaquetas de 150.000 a 400.000 por mm^3 de sangue. 
1- Hemácias 
São os glóbulos vermelhos, a quantidade de hemácias é muito maior que a de leucócitos e plaquetas, daí a predominância das mesmas no campo microscópico. As hemácias que são células que não possuem núcleo, quando adultas, para poderem carregar maior quantidade de oxigênio, elas ficam rosa amareladas pela eosina.
2- Leucócitos 
Os leucócitos são os glóbulos brancos, eles são capazes de absorver outras células e bactérias. Eles atacam os invasores, produzem anticorpos e identificam organismos. Os núcleos de todos os leucócitos ficam púrpura pelo azul de metileno. 
- Linfócitos 
Os linfócitos podem ser pequenos ou grandes. 
Eles são divididos em granulares que são maiores e são chamados de Natural Killers, e linfócitos T e B, os T estimulam ou inibem a produção dos anticorpos pelos linfócitos B. O seu núcleo ocupa quase toda célula e o citoplasma azulado fica mais na periferia.
- Monócitos 
Os monócitos servem para defender o organismo de corpos estranhos como bactérias e vírus, removem partículas estranhas e células tumorais, eles geralmente apresentam o núcleo em forma de feijão ou de rim, são células grandes e com o citoplasma bem azulado.
- Eosinófilo
Os eosinófilos também eliminam bactérias e vírus, mas estão mais presentes em processos alérgicos e infeções por parasitas. São granulados grandes e ficam vermelho em contato com a eosina.
- Basófilos
Os basófilos liberam histamina (vasodilatação) e heparina (anticoagulante) em reações alérgicas e anafiláticas, dessa forma atuam sobre as infecções.
Os basófilo fica bem escuros em contato com o corante o que pode mascarar o núcleo, também estão presentes no citoplasma.
 - Neutrófilos 
Os neutrófilos também tem a função de ingerir bactérias, fungos e células anormais ou infectadas. Eles possuem núcleos em forma de bastão (mais novos) ou segmentados (mais velhos), quanto maior o número de segmentos, mais velha é a célula, por isso seus valores que aparecem nos exames indicam a quanto tempo o corpo está lutando contra a infecção. Os grânulos dos neutrófilos se coram em salmão por uma mistura de corantes.
8- Plaquetas 
As plaquetas que na realidade são fragmentos de megacariócitos tem a função de participar do processo de coagulação. Elas ficam vermelhas na presença dos corantes, são menores do que as hemácias., e são achatadas. Além disso tem um ciclo de vida curto, após o qual são eliminadas.
Conhecimentos adquiridos
Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
Aprendemos a técnica de leishmam de coloração para fazer os esfregaço. Essa técnica é muito importante para diagnóstico de anemias microcíticas (ferropriva e talassêmica), anemias microcíclica e perniciosa, além de trombositose, malária, leucemia, linfomas ou insuficiência da medula óssea entre outras; embora a tecnologia na área biomédica e médica tenha se desenvolvido tanto, essa técnica ainda é muito importante e necessária.
Quando fazemos o esfregaço podemos detectar a presençaa de paiquilócitos no sangue, que são formas anormais dos eritrócitos em 10% ou mais da população total destes. Isso nos ajuda a diferenciar os tipos de anemia. Os poiquilócitos podem ser desenvolvidos por alterações bioquímicas nas membranas dos eritrócitos, alterações enzimáticas, envelhecimento do eritrócito, defeitos na molécula de hemoglobina, etc.
A técnica do esfregaço deve ser executada corretamente, seguindo-se todos os passos, inclusive a cronometragem do tempo para que o resultado seja preciso.
Aspectos citológicos da mesma matéria (fígado) corado por técnicas diferentes de coloração
Materiais: 
- Microscópio óptico composto - MOC (Microscópio de luz) 
- Lâmina de fígado corada por H&E 
- Lâmina de fígado corada por H + PAS 
- PAS = Ácido Periódico + Reativo de Schiff
Procedimento: 
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X Fígado por H&E 
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X: Fígado por H + PAS.
Pudemos observar o fígado corado por H&E, Hematoxilina + PAS e só por PAS. A Hematoxilina é um corante básico (alcalino), age sobre as estruturas ácidas como o núcleo, por isso deixa o núcleo roxo, porque produz um sal roxo mais água. Enquanto que a Eusina produz uma cor rosada e água.
O fígado corado por H + Pas evidencia o glicogênio.
Interpretação de cortes Interpretação tridimensional de cortes histológicos bidimensionais.
Materiais Peciolo de mamona, ovos cozidos, abacate.
Tipos de cortes Transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial.
Conhecimentos adquiridos Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
Essas técnicas de coloração nos permitem visualizar com clareza o núcleo, o citoplasma e o tecido conjuntivo celular. A hematoxilina torna o núcleo de azul e a eosina  torna o tecido conjuntivo e o citoplasma em diferentes tonalidades de vermelho, rosa ou laranja.
Através dessa técnica de coloração pudemos diferenciar as partes basófilas (ácidas,pela hematotoxina) das acidófilas ou eosilófilas (bases, pela eosina).
Hematoxilina se comporta como um cátion e tem caráter básico, é considerada, portanto, um corante básico. Componentes que contém muitos ácidos tem afinidade pela Hematoxilina e são substãncias chamadas de basófilas (núcleo, egastoplasma). 
Eosina é um corante de caráter ácido, considerada um corante ácido. Componentes que são muito básicos tem afinidade pela Eosina e são chamados de substâncias acidófilas (citoplasma, mitocôndrias, fibras colágenas).
Hematoxilina e Eosina evidenciam características estruturais, mas não todos os componentes de uma célula, por esse motivo. outras técnicas de coloração se fazem necessárias.
A Coloração de Prata pode evidenciar linfonodos, ela forma pontos negros na estrutura de suas fibras reticulares.
Algumas vezes pode-se utilizar associação de corantes para atingir diferentes resultados.
Já o corante de Ácido Periódico Schiff ou PAS marca polissacarídeos como o Glicogênio, assim como Alcian Blue, é um corante básico usado para contrastes; marca carboidratos nas células. Ele oxída a glicose produzindo aldeídos, forma uma cor púrpura-magenta
Pudemos observar que se faz necessário a utilização de diferentes técnicas de coloração para evidenciar diferentes características e problemas nos tecidos.
PREPARAÇÃO DO MERISTEMA APICAL
interfase + mitose
Preparação da raiz de cebola para observação da interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase.
Materiais
Cebola, Becker, papel alumínio, água, pinça, pincel, bisturi, vidro de relógio, cadinho, placa de Petri, tubo de ensaio, bico de Bunsen ou lamparina, pregador, corante orceina e ou frasco com orceina lático acético, papel de filtro, microscópio e óleo de imersão.
Descrição do procedimento
1- Pingamos 3 gotas de orceína lático acético a 2% em uma lâmina limpa colocada sobre a bancada.
2- Colocamos uma ponta de raiz de ceblola na làmina com auxílio de uma pinça.
3- Cobrir a làmina com a lamínula.
4- Segurar a lâmina sobre a chama, a cerca de 5 cm de distância da chama, por 3”. Repetir o mesmo procedimento 3 vezes.
5- Se for necessário pode-se acrescentar mais uma gota de orceína na borda da lamínula.
6- Pressionar levemente a lamínula com a ponta da pinça para que a raiz seja esmagada. A pressão dever ser suficiente para esmagar as raízes sem quebrar a lamínula.
7- O excesso de orceína lático/acética deverá ser retirado colocando-se a lâmina entre um pedaço de papel filtro dobrado e passando-se o dedo sobre ele.
Como produzir a raíz para análise
1- Cortar as raízes velhas com uma gilete e deixar a cebola apoiada em um recipiente com água onde somente a parte inferior do bulbo toque a água. Dentro de cerca de 24 horas, quando as raíses estiverem com cerca de 1 cm (entre 0,5 cm e 1 cm), secionar a extremidade (cerca de 2 mm) com o auxílio de uma lâmina de barbear ou de pinça de ponta fina entre 16 e 17 horas que é o pico de desenvolvimento da divisão celular.
2- Após a retirada das extremidades das raízes mergulhá-las no fixador Carnoy, que é uma mistura de três partes de etanol 95% e uma parte de ácido acético glacial. O material deve permanecer no fixador por um período de 12 a 24 horas. Depois desse período, as pontas da raiz são transferidas para uma solução de álcool 70% e conservadas em geladeira.
 3- Para preparar a Orceína lático/acética a 2% (corante/fixador), deveremos misturar em um erlenmeyer de 250ml, 45 ml de ácido lático e 55 ml de ácido acético glacial. Aquecer a 50o C em placa ou em banho-maria, em seguida adicionar 2g de orceína em 100 ml da mistura acima sob agitação (Becker com peixinho sobre um agitador magnético a 50°C). Essa mistura deverá ser deixada sob agitação continua durante aproximadamente 12 horas, durante esse período, solução deverá permanecer tampada com papel alumínio para evitar evaporação. Após esse período, filtrar a solução em filtro de papel e armazena-lá em frasco de vidro escuro ou embrulhado em papel alumínio para evitar o contato com a luz.
Conhecimentos adquiridos
Meristema Apical é um conjunto de células ainda não diferenciadas, que possuem características embrionárias, e tem como função a formação dos tecidos primários do vegetal. Elas se dividem através de atividade meristemática.
Pudemos perceber que a orceína funciona como fixador e como corante e que o aquecimento distende os cromossomos facilitando a sua visualização no microscópio.
Pudemos observar a mitose, que é o processo de divisão celular pelo qual as células eucariontes origina, numa sequência ordenada, células iguais a elas.
A mitose tem quatro fases prófase, metáfase, anáfase e telófase. Os cromossomos se duplicam na interfase (na 1a fase da divisão celular os cromossomos já estão duplicados
Prófase: é a fase inicial da divisão celular, os cromossomos se condensam passando da forma difusa observada na interfase para estruturas altamente empacotadas, características da célula em divisão. A cromatina começa a se auto condensar e o nucléolo desparece.
Metáfase: os cromossomos ficam centralizados na célula o que favorece a condensação máxima. 
Anáfase: os cromossomos que estão duplicados são separados e migram para a sua cromátide irmã, eles vão em direção a polos opostos. É a fase mais curta da mitose, dura apenas alguns minutos. 
Todas as cromátides começam a se separar ao mesmo tempo, após a separação, as cromátides irmãs passam a ser referidas como cromossomos filhos. 
Telófase: cromossomos filhos chegaram aos pólos e começam a passar por um processo de descondensação. O nucléolo e membrana voltam a fazer prte do processo, e a célula finalmente se divide por completo.
A interfase é a fase do ciclo celular mais frequente, pois nem todas as células estão em divisão ao mesmo tempo. A fase mais rara é a anáfase, por ser muito rápida.
Todo esse processo da mitose pode ser resumido como a divisão de uma célula mãe para gerar duas células filhas, idênticas à mãe tanto no formato quanto no número de cromossomos.
1- 
Microscópio Óptico Composto - MOC
 
O microscópio é uma ferramenta muito utilizada e indispensável para os estudos em diversas áreas, o MOC tem a finalidade de ampliar as imagens, para que elas possam ser estudadas e analizadas.
 
O MOC é composto pelas seguintes partes:
 
1- Pé ou Base: suporta o microscópio para que ele tenha estabilidade.
 
2- Braço ou Coluna: peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio.
 
3- Tubo ou Canhão: cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objectivas.
 
4- Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador. Apresenta geralmente 2 pinças destinadas a imobilizar as preparações.
 
5- Parafuso Macrométrico: engrenagem cuja rotação é responsável por movimentos verticais da platina, rápidos e de grande amplitude. Permite afastar ou aproximar a platina das objectivas rapidamente. É indispensável para fazer a focagem.
 
6- Parafuso Micrométrico: Afasta ou aproxima a platina das objectivas ao imprimir-lhe movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio.
 
7- Revólver: disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objectivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objectiva.
 
8- Charriot: Movimenta a lâmina de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina como um todo.
 
 
9- Sistema de Oculares e Sistema de Objectivas: o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objecto. A ampliação total dada pelo microscópio é igual ao produto da ampliaçãoda objectiva pela ampliação da ocular.
10- Ocular: capta a imagem ampliada pela objectiva, ampliandoa, através do seu sistema de lentes e permite a sua observação pelo olho humano. As oculares mais usadas são as de ampliação 10X.
 
11- Objectivas: Ampliam a imagem do objecto a ser observado, através do sistema de e lentes que a compõem.
 
12- Fonte Luminosa: existem vários tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada (iluminação artificial), ou um espelho que reflicta a luz solar (iluminação natural). Os dois tipos de iluminação tem virtudes e defeitos, mas destinam-se os dois à iluminação da preparação, possibilitando assim a sua visualização.
 
13- Diafragma: regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio.
 
14- Condensador: distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz que atravessa o diafragma.
 
O óleo de imersão só deve ser usado com a objetiva de 100x.
 
 
 
OBSERVAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS BUCAIS
 
Materiais:
- Microscópio Óptico Composto (Microscópio de Luz)
- Espátula de Madeira descartável
- Lámina de vidro
- Lamínula
- Azul de Metileno
- Papel de Filtro
 
Fizemos a coleta utilizando a espátula de madeira  raspamos dentro da boca, nas bochechas e retiramos o material biológico, esse material foi depositado na lâmina e pingamos uma gota de azul de metileno sobre o material, não podemos demorar muito tempo para fazer esse processo para que não ocorra alteração nos resultados. A seguir devemos posicionar a lamínula sobre a lâmina formando um ângulo de 45o e somente depois baixar a lamínula para que ela fique sobre a lâmina, de forma que não ocorra a formação de bolhas.
Em alguns segundos acontece uma reação química entre as células e o corante azul de metileno e formam sais.
Iniciamos a observação no microscópio, utilizando o parafuso macrométrico para a observação, mexendo no parafuso micrométrico continuamos fazendo nossas observações 100x - 400x.
Pudemos observar que o núcleo e sua morfologia celular encontra-se em uma tonalidade azul mais intensa e o citoplasma possui uma tonalidade azul mais clara. Também pudemos observar os limites plasmáticos, células epiteliais (que podem ser observadas de frente, de perfil, isoladas e aglomeradas), e granulações inespecíficas no citoplasma entre outros grânulos sobre as células (bactérias). Quanto menor a higiene bucal, maior a quantidade de bactérias.
Externamente a nossa pele é coberta por uma camada de escleroproteina chamada queratina, externamente ela é formada por dois tecidos, externamente tecido epitelial e internamente tecido conjuntivo. Já a nossa parede interna da boca é chamada mucosa, que também é formada por tecido epitelial e conjuntivo, mas nāo contém a camada de queratina.
Esse mesmo exercício foi repetido sem a utilização do azul de metileno, dessa forma tivemos que trabalhar com o diafragma e a iluminação para fazermos nossas observações.
2-
Tivemos a oportunidade de conhecer o microscópio e suas partes, e aprender na prática como ele funciona.
Aprendemos técnicas de utilização de corantes para auxiar a observação de materiais no microscópio.
Observamos células bucais, as estruturas celulares como núcleo e citoplasma.
Pudemos observar que o núcleo e sua morfologia celular encontra-se em uma tonalidade azul mais intensa e o citoplasma possui uma tonalidade azul mais clara. Também pudemos observar os limites plasmáticos, células epiteliais (que podem ser observadas de frente, de perfil, isoladas e aglomeradas), e granulações inespecíficas no citoplasma entre outros grânulos sobre as células (bactérias). Quanto menor a higiene bucal, maior a quantidade de bactérias.
3-
Interpretação tridimensional de cortes macro e microscopicamente e preparação de esfregaço para sangue periférico segundo a técnica de Leishman.
 
Materiais:
- Microscópio óptico composto - MOC  (Microscópio de luz)
- Lâmina de fígado corada por H&E
- Lâmina de fígado corada por H + PAS
- PAS = Ácido Periódico + Reativo de Schiff
 
Procedimento:
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X Fígado por H&E
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X: Fígado por H + PAS.
 
Pudemos observar o fígado corado por H&E, Hematoxilina + PAS e só por PAS. A Hematoxilina é um corante básico (alcalino), age sobre as estruturas ácidas como o núcleo, por isso deixa o núcleo roxo, porque produz um sal roxo mais água. Enquanto que a Eusina produz uma cor rosada e água.
O fígado corado por H + Pas evidencia o glicogênio.
 
Interpretação de cortes                                                                                                                                                           Interpretação tridimensional de cortes histológicos bidimensionais.
Materiais                                                                                                                                                                                           Peciolo de mamona, ovos cozidos, abacate.
Tipos de cortes                                                                                                                                                                      Transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial.
Conhecimentos adquiridos                                                                                                                                                            Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
 
Preparação da lâmina para sangue periférico esfregaço de sangue, método de coloração Leishman
 
O esfregaço, distensão ou extensão sanguínea é um teste que serve para que se possa identificar anormalidades nas céluas do sangue, e dessa forma apontar doenças, investigar distúrbios e parasitas, como o Plasmodium, causador da malária.
O teste é feito quando colocamos uma fina camada de sangue sobre uma lâmina e observamos no microscópio, após prepará-la e usar os corantes para identificação.
 
Material:
Sangue periférico, lâmina, álcool, lanceta estéril, lâmina extensora, cronómetro., suporte para coloração, água destilada ou deionizada.
 
 
 
 
Técnica: Leishman
 
O leishmam é uma técnica de coloração para fazer os esfregaço. É composto de eosina azul de metileno e álcool metílico.
 
Os corantes utilizados para executar a técnica do esfregaço tem o pH dependente da solução, os tons apresentados são vermelhos (ácido) e azulados (base).
 
 
 
Seqüência na preparação da lâmina:
 
1- Fazer a assepsia do dedo em algodão embebido com álcool;
2-  Furar o dedo utilizando uma microlanceta;
3- Colocar a gota de sangue na extremidade de uma lâmina histológica breviamante limpa;
4- Utilizando-se de outra lâmina histológica, fazer corretamente o esfregaço deixando uma película de sangue sobre a lâmina; ü Segurar a lâmina, contendo a gota de sangue, com os dedos polegar e indicador da mão esquerda; ü Inclinar uma outra lâmina histológica a 450 , segurando com os dedos polegar e indicador, da mão direita. Levar a lâmina inclinada até o início da gota de sangue; ü Quando a lâmina toca na gota, o sangue escorre em seu bordo. Ai deve-se fazer voltar a lâmina inclinada para trás, formando-se então a película de sangue.
5- Deixar secar ao ar;
6- Colocar a lâmina sobre um suporte na pia;
7- Cobrir o esfregaço com Leishman e deixar por 4 minutos;
8- Sem retirar o Leishman, adicionar água destilada e deixar por 7 minutos;
9- Escorrer a lâmina na pia;
10- Lavar a lâmina com água destilada;
11- Deixar secar ao ar;
12- Observar a lâmina com 1000x de aumento, utilizando a objetiva de imersão;
 
 
 
Técnica de Panóico para esfregaço do sangue
 
São três os corantes utilizados:
Corante I - Solução de triarilmetano 0,1% (10”) agente fixador
Corante II - Solução de xantenos0,1% (8”) corante dos glóbulos vermelhos
Corante III - Solução de tiazinas 0,1% (5”) corante dos glóbulos brancos e das plaquetas.
Após essa passagem pelos corantes é só deixar secar e observar as células sanguíneas, os corantes são utilizados para que se possa atingir todas as células. Os corantes possuem afinidades de estrutura celular por combinação, é isso que proporciona  as diferentes cores e facilita a visualização.
Essa técnica pode ser utilizada para diagnóstico de anemias (ferropriva e talassêmica), anemias microcíclica e perniciosa, além de trombositose, malária, leucemia, linfomas ou insuficiência da medula óssea entre outras.
 
Quando fazemos o esfregaço podemos detectar a presençaa de paiquilócitos no sangue, que são formas anormais dos eritrócitos em 10% ou mais da população total destes. Isso nos ajuda a diferenciar os tipos de anemia. Os poiquilócitos podem ser desenvolvidos por alterações bioquímicas nas membranas dos eritrócitos, alterações enzimáticas, envelhecimento do eritrócito, defeitos na molécula de hemoglobina, etc.
 
 
Observação de Sangue periférico
1- Observar com 1000x de aumento.
2- Utilizar o óleo de imersão
3- Observar as hemácias (também denominados eritrócitos ou glóbulos vermelhos), leucócitos (também denominado glóbulos brancos) e as plaquetas.
 
O número de hemácias varia de 4,5 a 6 milhões por mm^3 de sangue, o número de leucócitos de 8.000 a 10.000 por mm^3 de sangue e o de plaquetas de 150.000 a 400.000 por mm^3 de sangue.
 
1- Hemácias
São os glóbulos vermelhos, a quantidade de hemácias é muito maior que a de leucócitos e plaquetas, daí a predominância das mesmas no campo microscópico. As hemácias que são células que não possuem núcleo, quando adultas, para poderem carregar maior quantidade de oxigênio, elas ficam rosa amareladas pela eosina.
 
2- Leucócitos
Os leucócitos são os glóbulos brancos, eles são capazes de absorver outras células e bactérias. Eles atacam os invasores, produzem anticorpos e identificam organismos. Os núcleos de todos os leucócitos ficam púrpura pelo azul de metileno.
 
- Linfócitos
Os linfócitos podem ser pequenos ou grandes.
Eles são divididos em granulares que são maiores e são chamados de Natural Killers, e linfócitos T e B, os T estimulam ou inibem a produção dos anticorpos pelos linfócitos B. O seu núcleo ocupa quase toda célula e o citoplasma azulado fica mais na periferia.
 
- Monócitos
Os monócitos servem para defender o organismo de corpos estranhos como bactérias e vírus, removem partículas estranhas e células tumorais, eles geralmente apresentam o núcleo em forma de feijão ou de rim, são células grandes e com o citoplasma bem azulado.
 
- Eosinófilo
Os eosinófilos também eliminam bactérias e vírus, mas estão mais presentes em processos alérgicos e infeções por parasitas. São granulados grandes e ficam vermelho em contato com a eosina.
 
-  Basófilos
Os basófilos liberam histamina (vasodilatação) e heparina (anticoagulante) em reações alérgicas e anafiláticas, dessa forma atuam sobre as infecções.
Os basófilo fica bem escuros em contato com o corante o que pode mascarar o núcleo, também estão presentes no citoplasma.
 
 - Neutrófilos
Os neutrófilos também tem a função de ingerir bactérias, fungos e células anormais ou infectadas. Eles possuem núcleos em forma de bastão (mais novos) ou segmentados (mais velhos), quanto maior o número de segmentos, mais velha é a célula, por isso seus valores que aparecem nos exames indicam a quanto tempo o corpo está lutando contra a infecção. Os grânulos dos neutrófilos se coram em salmão por uma mistura de corantes.
 
8- Plaquetas
As plaquetas que na realidade são fragmentos de megacariócitos tem a função de participar do processo de coagulação. Elas ficam vermelhas na presença dos corantes, são menores do que as hemácias., e são achatadas. Além disso tem um ciclo de vida curto, após o qual são eliminadas.
 
 
Conhecimentos adquiridos
 
Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
Aprendemos a técnica de leishmam de coloração para fazer os esfregaço. Essa técnica é muito importante para diagnóstico de anemias microcíticas (ferropriva e talassêmica), anemias microcíclica e perniciosa, além de trombositose, malária, leucemia, linfomas ou insuficiência da medula óssea entre outras; embora a tecnologia na área biomédica e médica tenha se desenvolvido tanto, essa técnica ainda é muito importante e necessária.
 
Quando fazemos o esfregaço podemos detectar a presençaa de paiquilócitos no sangue, que são formas anormais dos eritrócitos em 10% ou mais da população total destes. Isso nos ajuda a diferenciar os tipos de anemia. Os poiquilócitos podem ser desenvolvidos por alterações bioquímicas nas membranas dos eritrócitos, alterações enzimáticas, envelhecimento do eritrócito, defeitos na molécula de hemoglobina, etc.
 
A técnica do esfregaço deve ser executada corretamente, seguindo-se todos os passos, inclusive a cronometragem do tempo para que o resultado seja preciso.
 
 
 
4-
Conhecimentos adquiridos
 
Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
Aprendemos a técnica de leishmam de coloração para fazer os esfregaço. Essa técnica é muito importante para diagnóstico de anemias microcíticas (ferropriva e talassêmica), anemias microcíclica e perniciosa, além de trombositose, malária, leucemia, linfomas ou insuficiência da medula óssea entre outras; embora a tecnologia na área biomédica e médica tenha se desenvolvido tanto, essa técnica ainda é muito importante e necessária.
 
Quando fazemos o esfregaço podemos detectar a presençaa de paiquilócitos no sangue, que são formas anormais dos eritrócitos em 10% ou mais da população total destes. Isso nos ajuda a diferenciar os tipos de anemia. Os poiquilócitos podem ser desenvolvidos por alterações bioquímicas nas membranas dos eritrócitos, alterações enzimáticas, envelhecimento do eritrócito, defeitos na molécula de hemoglobina, etc.
 
A técnica do esfregaço deve ser executada corretamente, seguindo-se todos os passos, inclusive a cronometragem do tempo para que o resultado seja preciso.
5-
Materiais:
- Microscópio óptico composto - MOC  (Microscópio de luz)
- Lâmina de fígado corada por H&E
- Lâmina de fígado corada por H + PAS
- PAS = Ácido Periódico + Reativo de Schiff
 
Procedimento:
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X Fígado por H&E
- Observar com aumento de 40X, 100X e 400 X: Fígado por H + PAS.
 
Pudemos observar o fígado corado por H&E, Hematoxilina + PAS e só por PAS. A Hematoxilina é um corante básico (alcalino), age sobre as estruturas ácidas como o núcleo, por isso deixa o núcleo roxo, porque produz um sal roxo mais água. Enquanto que a Eusina produz uma cor rosada e água.
O fígado corado por H + Pas evidencia o glicogênio.
Interpretação de cortes                                                                        Interpretação tridimensional de cortes histológicos bidimensionais.
Materiais                                                                                                            Peciolo de mamona, ovos cozidos, abacate.
Tipos de cortes                                                                                       Transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial.
Conhecimentos adquiridos                                                                         Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagentecomo pH da estrutura.
Através dessa técnica de coloração podemos visualizar com clareza o núcleo, o citoplasma e o tecido conjuntivo celular. A hematoxilina torna o núcleo de azul e a eosina  torna o tecido conjuntivo e o citoplasma em diferentes tonalidades de vermelho, rosa ou laranja.
Através dessa técnica de coloração pudemos diferenciar as partes basófilas (ácidas, pela hematotoxina) das acidófilas ou eosilófilas (bases, pela eosina).
Hematoxilina se comporta como um cátion e tem caráter básico, é considerada, portanto, um corante básico.  Componentes que contém muitos ácidos tem afinidade pela Hematoxilina e são substãncias chamadas de basófilas (núcleo, egastoplasma).
 
Eosina é um corante de caráter ácido, considerada um corante ácido. Componentes que são muito básicos tem afinidade pela Eosina e são chamados de substâncias acidófilas (citoplasma, mitocôndrias, fibras colágenas).
Hematoxilina e Eosina evidenciam características estruturais, mas não todos os componentes de uma célula, por esse motivo. outras técnicas  de coloração se fazem necessárias.
A Coloração de Prata pode evidenciar linfonodos, ela forma pontos negros na estrutura de  suas fibras reticulares.
Algumas vezes pode-se utilizar associação de corantes para atingir diferentes resultados.
Já o corante de Ácido Periódico Schiff ou  PAS marca polissacarídeos como o Glicogênio, assim como Alcian Blue, é um corante básico usado para contrastes; marca carboidratos nas células. Ele oxída a glicose produzindo aldeídos, forma uma cor púrpura-magenta.
6-
Conhecimentos adquiridos                                                                          
Tivemos a oportunidade de aprender vários tipos de cortes, como transversal, longitudinal mediano e excêntrico, oblícuo e tangencial, e a interpretação dos mesmos. Também as alterações de coloração das células numa relação do reagente como pH da estrutura.
Essas técnicas de coloração nos permitem visualizar com clareza o núcleo, o citoplasma e o tecido conjuntivo celular. A hematoxilina torna o núcleo de azul e a eosina  torna o tecido conjuntivo e o citoplasma em diferentes tonalidades de vermelho, rosa ou laranja.
Através dessa técnica de coloração pudemos diferenciar as partes basófilas (ácidas, pela hematotoxina) das acidófilas ou eosilófilas (bases, pela eosina).
Hematoxilina se comporta como um cátion e tem caráter básico, é considerada, portanto, um corante básico.  Componentes que contém muitos ácidos tem afinidade pela Hematoxilina e são substãncias chamadas de basófilas (núcleo, egastoplasma).                                                                                               
 
Eosina é um corante de caráter ácido, considerada um corante ácido. Componentes que são muito básicos tem afinidade pela Eosina e são chamados de substâncias acidófilas (citoplasma, mitocôndrias, fibras colágenas).
Hematoxilina e Eosina evidenciam características estruturais, mas não todos os componentes de uma célula, por esse motivo. outras técnicas  de coloração se fazem necessárias.
A Coloração de Prata pode evidenciar linfonodos, ela forma pontos negros na estrutura de  suas fibras reticulares.
Algumas vezes pode-se utilizar associação de corantes para atingir diferentes resultados.
Já o corante de Ácido Periódico Schiff ou  PAS marca polissacarídeos como o Glicogênio, assim como Alcian Blue, é um corante básico usado para contrastes; marca carboidratos nas células. Ele oxída a glicose produzindo aldeídos, forma uma cor púrpura-magenta
Pudemos observar que se faz necessário a utilização de diferentes técnicas de coloração para evidenciar diferentes características e problemas nos tecidos.
7-
PREPARAÇÃO DO MERISTEMA APICAL
interfase + mitose
Preparação da raiz de cebola para observação da interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase.
 
Materiais
Cebola, Becker, papel alumínio, água, pinça, pincel, bisturi, vidro de relógio, cadinho, placa de Petri, tubo de ensaio, bico de Bunsen ou lamparina, pregador, corante orceina e ou frasco com orceina lático acético, papel de filtro, microscópio e óleo de imersão.
 
Descrição do procedimento
 
1- Pingamos 3 gotas de orceína lático acético a 2% em uma lâmina limpa colocada sobre a bancada.
 
2- Colocamos uma ponta de raiz de ceblola na làmina com auxílio de uma pinça.
 
3- Cobrir a làmina com a lamínula.
 
4- Segurar a lâmina sobre a chama, a cerca de 5 cm de distância da chama, por 3”. Repetir o mesmo procedimento 3 vezes.
 
5- Se for necessário pode-se acrescentar mais uma gota de orceína na borda da lamínula.
 
6- Pressionar levemente a lamínula com a ponta da pinça para que a raiz seja esmagada. A pressão dever ser suficiente para esmagar as raízes sem quebrar a lamínula.
 
7- O excesso de orceína lático/acética deverá ser retirado colocando-se a lâmina entre um pedaço de papel filtro dobrado e passando-se o dedo sobre ele.
 
 
 
Como produzir a raíz para análise
 
1- Cortar as raízes velhas com uma gilete e deixar a cebola apoiada em um recipiente com água onde somente a parte inferior do bulbo toque a água. Dentro de cerca de 24 horas, quando as raíses estiverem com cerca de 1 cm (entre 0,5 cm e 1 cm), secionar a extremidade (cerca de 2 mm) com o auxílio de uma lâmina de barbear ou de pinça de ponta fina entre 16 e 17 horas que é o pico de desenvolvimento da divisão celular.
 
2- Após a retirada das extremidades das raízes mergulhá-las no fixador Carnoy, que é uma mistura de três partes de etanol 95% e uma parte de ácido acético glacial. O material deve permanecer no fixador por um período de 12 a 24 horas. Depois desse período, as pontas da raiz são transferidas para uma solução de álcool 70% e conservadas em geladeira.
 
 3-  Para preparar a Orceína lático/acética a 2% (corante/fixador), deveremos misturar em um erlenmeyer de 250ml, 45 ml de ácido lático e 55 ml de ácido acético glacial. Aquecer a 50o C em placa ou em banho-maria, em seguida adicionar 2g de orceína em 100 ml da mistura acima sob agitação (Becker com peixinho sobre um agitador magnético a 50°C). Essa mistura deverá ser deixada sob agitação continua durante aproximadamente 12 horas, durante esse período, solução deverá permanecer tampada com papel alumínio para evitar evaporação. Após esse período, filtrar a solução em filtro de papel e armazena-lá em frasco de vidro escuro ou embrulhado em papel alumínio para evitar o contato com a luz.
 
 
Conhecimentos adquiridos
 
Meristema Apical é um conjunto de células ainda não diferenciadas, que possuem características embrionárias, e tem como função a formação dos tecidos primários do vegetal. Elas se dividem através de atividade meristemática.
 
Pudemos perceber que a orceína funciona como fixador e como corante e que o aquecimento distende os cromossomos facilitando a sua visualização no microscópio.
 
Pudemos observar a mitose, que é o processo de divisão celular pelo qual as células eucariontes origina, numa sequência ordenada, células iguais a elas.
A mitose tem quatro fases prófase, metáfase, anáfase e telófase. Os cromossomos se duplicam na interfase (na 1a fase da divisão celular os cromossomos já estão duplicados
 
Prófase: é a fase inicial da divisão celular, os cromossomos se condensam passando da forma difusa observada na interfase para estruturas altamente empacotadas, características da célula em divisão. A cromatina começa a se auto condensar e o nucléolo desparece.
 
Metáfase: os cromossomos ficam centralizados na célula o que favorece a  condensação máxima.
 
Anáfase: os cromossomos que estão duplicados são separados e migram para a sua cromátide irmã, eles vão em direção a polos opostos. É a fase mais curta da mitose, dura apenas alguns minutos.
 
Todas as cromátides começam a se separar ao mesmo tempo, após a separação, as cromátides irmãs passam a ser referidas como cromossomos filhos.
 
Telófase: cromossomos filhos chegaram aos pólos e começam a passar por um processo de descondensação. Onucléolo e membrana voltam a fazer prte do processo, e a célula finalmente se divide por completo.
 
A interfase é a fase do ciclo celular mais frequente, pois nem todas as células estão em divisão ao mesmo tempo. A fase mais rara é a anáfase, por ser muito rápida.
 
Todo esse processo da mitose pode ser resumido como a divisão de uma célula mãe para gerar duas células filhas, idênticas à mãe tanto no formato quanto no número de  cromossomos.
 
 
8- 
Conhecimentos adquiridos
 
Meristema Apical é um conjunto de células ainda não diferenciadas, que possuem características embrionárias, e tem como função a formação dos tecidos primários do vegetal. Elas se dividem através de atividade meristemática.
 
Pudemos perceber que a orceína funciona como fixador e como corante e que o aquecimento distende os cromossomos facilitando a sua visualização no microscópio.
 
Pudemos observar a mitose, que é o processo de divisão celular pelo qual as células eucariontes origina, numa sequência ordenada, células iguais a elas.
A mitose tem quatro fases prófase, metáfase, anáfase e telófase. Os cromossomos se duplicam na interfase (na 1a fase da divisão celular os cromossomos já estão duplicados
 
Prófase: é a fase inicial da divisão celular, os cromossomos se condensam passando da forma difusa observada na interfase para estruturas altamente empacotadas, características da célula em divisão. A cromatina começa a se auto condensar e o nucléolo desparece.
 
Metáfase: os cromossomos ficam centralizados na célula o que favorece a  condensação máxima.
 
Anáfase: os cromossomos que estão duplicados são separados e migram para a sua cromátide irmã, eles vão em direção a polos opostos. É a fase mais curta da mitose, dura apenas alguns minutos.
 
Todas as cromátides começam a se separar ao mesmo tempo, após a separação, as cromátides irmãs passam a ser referidas como cromossomos filhos.
 
Telófase: cromossomos filhos chegaram aos pólos e começam a passar por um processo de descondensação. O nucléolo e membrana voltam a fazer prte do processo, e a célula finalmente se divide por completo.
 
A interfase é a fase do ciclo celular mais frequente, pois nem todas as células estão em divisão ao mesmo tempo. A fase mais rara é a anáfase, por ser muito rápida.
 
Todo esse processo da mitose pode ser resumido como a divisão de uma célula mãe para gerar duas células filhas, idênticas à mãe tanto no formato quanto no número de  cromossomos.