Clonagem Resumo

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CLONAGEM DE DNA
OBJETIVO? – inserir esse gene dentro do plasmidio para isso é necessário cortar o vetor e inserir o gene. (vetor- enzimas de restrição). Criando poros na membrana para inserir o DNA.
Tendo um plasmidio aberto com pontas de nucleotídeo complementares, no caso do DNA isola o meu gene , que também possui pontas com nucleotídeos complementares. Essa pontas encaixam perfeitamente, de modo que a união dessas moléculas eu obtenha um plasmidio ligado a molécula de DNA. 
Isso só acontece devido a complementariedade dos nucleotídeos nas pontas produzidas por enzimas de restrição, essas pontas são seladas por uma enzima chamada de LIGASE.
OQUE É UM PLASMIDIO RECOMBINANTE?
R: Plasmídeos ligados a outra molécula de DNA.
Esse plasmídeo é inserido na bactéria, onde ela irá se multiplicar rapidamente, fazendo copias idênticas ocorrendo a clonagem.
VETORES DE CLONAGEM
R: CARREADOR DA MOLECULA DE DNA(BACTERIAS/LEVEDURAS E VIRUS).
CLONAGEM RECOMBINANTE-
OQUE É CLONAGEM GENICA?
Quando fragmentos de DNA chamado de inserto é inserido em uma molécula de DNA chamada de vetor, uma molécula de DNA recombinante 
PORQUE CLONAR?
Sequenciamento, sintetização de proteínas para uso terapêutico e produção de vacinas.
MAPA DO VETOR
SETOR DE ENZIMA DE RESTRIÇÃO: - escolha da enzima a ser clonada
REGIAO PROMOTORA- responsável por iniciar a transcrição do gene de interesse 
ORIGEM DA REPLICAÇÃO- sequencia especifica ao plasmídeo na qual tem o inicio da replicação do DNA.
SITIOS DE CLONAGEM- insere a informação desejada, local da inserção da sequencia a ser clonada, próximo a um sitio de restrição.
MARCADOR DE SELETIVIDADE- permite a identificação da bactéria que recebeu o plasmídeo, são genes que codificam proteínas que degradam antibióticos.
CLONAGEM E AMPLIFICAÇÃO – para iniciar a clonagem é necessário amplificar o gene de interesse por reações de pcr, utilizando primers específicos. Amplificar o gene de interesse por reações de pcr ( DNA genomico produto de pcr com um gene sintético da pcr, depois de 30 a 40 ciclos). 
Esses primers irão se ligar ao DNA polimerase, sintetizando a sequencia complementar sentido 5’ linha 3’, finalizando a reação de pcr para amplificação.
O DNA é cortado com enzimas de restrição, que também cortam o vetor, no caso o plasmídeo, em seguida o inserto e o vetor serão unidos por outra enzima a DNA ligase, formando plasmídeos recombinantes.
TRANSFORMAÇÃO PELO DNA 
Os plasmídeos recombinantes serão inseridos na bactéria por um processo chamado de transformação que pode ocorrer por eletroporação ou por choque térmico.
No interior da célula hospedeira o vetor multiplica produzindo copias idênticas, não só de si próprio, mas também do gene que ele carrega, quando a célula se divide, copias da molécula recombinante são repassadas ao genes, na qual o vetor se multiplica novamente.
SELEÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES – 
Depois de diversas divisões celulares é preciso selecionar as colônias recombinantes por meio de resistência a antibióticos.
RESULTADO: Sobrevivem apenas bactérias com resistência ao antibiótico, essas são as mesma que tem no genes a ser clonado, a partir dai é possível isolar a colônia recombinante para verificação da presença do inserto através de varias técnicas. EX: PCR
EXPRESSAO DE PROTEINAS
Uma vez confirmados, os plamidios recombinantes são purificados e inseridos em uma célula de expressão, onde o produto de interesse será gerado e posteriormente purificado.
Primers exepecifico – pequenas sequencias de DNA com especificidade que agem no gene de interesse.