RESUMO Clonagem de DNA

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Clonagem de DNA
Características do processo de clonagem do DNA
clonagem de DNA fazer diversas cópias idênticas de uma molécula de DNA (de uma sequência de DNA específica) 
Clonagem de DNA ou DNA complementar
DNA genômico ntrons (regiões não codificantes do DNA)
 éxons (regiões codificantes)
DNA é transcrito pelo RNA polimerase tipo II em mRNA, esse mRNA será traduzido em proteínas pelo ribossomo, o que significa que as quantidades de mRNA são diretamente proporcionais aos níveis de expressão de proteínas. Esse cDNA é obtido quando o mRNA é submetido à ação daenzima transcriptase reversa e DNA polimerase, o qual produz as cópias de cDNA a partir do mRNA.
Sequência de mRNA nucleotídeos A, U, G, C em DNA A, T, C, G
Técnica de vetores plasmidiais ou PCR
Observar a presença ou a ausência de um certo gene, é mais vantajoso utilizar a técnica de PCR, seguida por revelação em eletroforese em gel de agarose.
Realizar estudos e a produção de proteínas recombinantes, deve-se utilizar os vetores plasmidiais, os quais serão capazes de utilizar a maquinaria celular para a produção das proteínas codificadas em seu DNA.
Etapas do processo de clonagem do DNA
A mais simples envolve inserir um fragmento de DNA em um elemento que se autorreplica, geralmente os plasmídeos.
vetores plasmidiais pequenos DNAs fita- -dupla circulares que ocorrem, normalmente, em células bacterianas. (DNA-móvel - podem ser transferidos entre bactérias para o compartilhamento de genes). 
Para realizar a clonagem de um gene, é necessário inseri-lo nesse plasmídeo, deve-se cortar o DNA circular para obter um DNA, para realizar essa clivagem enzimas de restrição.
Tipos de enzimas de restrição
Tipo I reconhece uma sequência específica de DNA, mas realiza um corte que pode ser de até mil bases de distância do local de reconhecimento.
Tipo II reconhece uma sequência específica de DNA e realiza um corte exatamente nessa sequência.
Tipo III reconhece uma sequência específica de DNA, mas realiza um corte em outro local específico.
As enzimas de restrição utilizadas na construção de plasmídeos são as do tipo II.
O corte promovido por elas pode gerar dois tipos de extremidade de DNA cegas ou coesivas.
Extremidades cegas podem ser encaixadas em qualquer outra extremidade cega. 
vantagem do uso de enzimas que geram extremidades coesivas cada extremidade do DNA pode ter um sítio de restrição diferente e estas só poderão ser ligadas quando encontrarem uma sequência complementar.
Após a clivagem, os fragmentos complementares são capazes de se ligar, mas a junção entre as extremidades 5’ e 3’ permanece aberta A ligação entre esses dois fragmentos é promovida pela DNA ligase. 
Transformação pode ser realizada pela eletroporação aplicação de uma corrente elétrica que gera poros na membrana celular, permitindo a entrada do DNA plasmidial, ou choque térmico, o qual utiliza altas temperaturas, seguidas por resfriamento, e desestabiliza a membrana celular
Quando diversos genes são clonados em plasmídeos e inseridos em bactérias, eles podem ser armazenados, formando uma biblioteca de DNA.
Quando a gama de fragmentos representa o genoma de um organismo, ela passa a ser chamada de biblioteca genômica.
Uma alternativa que aumenta as quantidades de genes que codificam proteínas é a criação de uma biblioteca de cDNA
.
PCR fornece uma abordagem mais rápida e direta para a clonagem de genes
A PCR simula a síntese de DNA que ocorre dentro das nossas células
Termociclador equipamento utilizado para a reação de PCR
 desnaturação, anelamento, extensão.
DNA polimerase responsável por fazer as cópias do DNA, adicionando nucleotídeos complementares à sequência molde.
Oligonucleotídeos iniciadores (primers) pequenas sequências de DNA fita simples, sendo complementares às extremidades do gene que será amplificado. oligonucleotídeos iniciadores se ligarão ao DNA na fase de anelamento e darão um sinal à DNA polimerase para que ela realize sua atividade.
Nucleotídeos para que a DNA polimerase consiga realizar sua função, adicionamos à reação os nucleotídeos A, T, C e G, os quais serão incorporados à fita de DNA que está sendo sintetizada.
Tampão será a matriz em que a reação ocorrerá.
Eletroforese técnica de separação de moléculas de acordo com seu tamanho.
O DNA é carregado negativamente, eles serão atraídos para o polo positivo e repelidos pelo polo negativo.
gel de agarose matriz que serve como uma rede para filtrar diferentes fragmentos de DNA, quanto maior for o fragmento, menor será a velocidade com que ele migrará pelo gel, enquanto os fragmentos menores passarão por essa rede com maior facilidade e mais rapidez.
Uso das moléculas geradas a partir do processo de clonagem
armazenamento de informações
diagnóstico de doenças
possíveis aplicações é a construção de bibliotecas de genes e genomas
Quando um gene codifica para certa proteína, esta pode ser expressa utilizando um plasmídeo capaz de produzi-la com a ajuda da maquinaria celular de uma bactéria. Essa proteína purificada pode ser utilizada para futuros estudos científicos, em uma reação, como a Taq polimerase ou um anticorpo, medicamento como a insulina e a glucocerebrosidase, por exemplo.
Doença de Gaucher doença genética rara (autossômica recessiva) que se caracteriza pela ausência da glucocerebrosidase, uma proteína responsável pelo processamento de glicolipídios derivados da membrana celular. A falta dessa enzima traz consequências sérias, como aumento do fígado e do baço, anemia e efeitos neurológicos. Para o tratamento dessa doença, basta administrar uma dose de glucocerebrosidase.
Clonagem de DNA também pode ser utilizada para diagnosticar doenças, principalmente as infecciosas.