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Southern Blot

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SOUTHERN BLOT
Técnicas de biologia molecular
FRANCIELE CARDOSO DE VARGAS
JÚLIO THADEU IOMES
UNIVERSIDADE DO PLANALTO CATARINENSE
GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA – 2ª FASE
BIOLOGIA MOLECULAR
SOUTHERN BLOT
 Idealizada por Edwin Southern, em 1975;
 é uma técnica de hibridização utilizada na detecção de sequências específicas de DNA;
 a metodologia utilizada atualmente segue os princípios básicos da técnica, passando apenas por modificações com o intuito de acelerar o processo.
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2012)
OBJETIVO DA TÉCNICA
 Detectar uma sequência de DNA específica em uma amostra complexa de DNA;
 empregada na descoberta e mapeamento do gene e detecção de mutações em amostras;
 método definitivo de detecção de integração transgene e da recombinação homóloga bem sucedida no gene.
(BROWN, 2001)
MÉTODO
 O DNA é digerido com enzimas de restrição;
 os fragmentos resultantes são separados por eletroforese em gel de agarose;
 os fragmentos de DNA são desnaturados in situ, com a imersão do gel em uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) e o uso de uma solução tampão para estabilizar a desnaturação (0,3 mol/L NaCl)
 são transferidos por capilaridade para uma membrana de nylon ou de nitrocelulose, criando uma réplica perfeita do gel.
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2012)
MÉTODO
 O DNA é ligado a um filtro pelo calor ou pela luz UV;
 após a lavagem do excesso da sonda de hibridização, que não ligou-se ao DNA complementar criado no filtro, a posição na qual a ligação específica ocorreu pode ser detectada por uma autorradiografia do filtro;
 o padrão de hibridização gerado será comparado com a região do gel original que contém as sequências de DNA de interesse. 
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2012)
CAMPOS DE APLICAÇÃO
ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DO FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO
Identificação de polimorfismos, que determinam a alteração no padrão de clivagem (devido a mutações pontuais em sítios de restrição) obtido a partir de uma determinada região do DNA.
O tratamento do DNA genômico de diferentes indivíduos com uma única enzima de restrição nem sempre dá o mesmo conjunto de fragmentos porque alguns sítios de restrição são polimórficos, estando presentes em alguns indivíduos mas ausentes em outros.
Uma alteração pontual na sequência de nucleotídeos altera a restrição em uma sequência não reconhecida pela enzima de restrição. 
CAMPOS DE APLICAÇÃO
ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DO FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO
CAMPOS DE APLICAÇÃO
ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DO FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO
Autorradiografia de uma membrana de hibridização revelando marcadores RFLP. Indivíduos homozigotos para alelos A1(3, 5, 6, 7, 8,9) e Homozigotos para os alelos A2 (1, 2,4) de um loco RFLP são identificados.
CAMPOS DE APLICAÇÃO
ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DO FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO
A anemia falciforme é uma doença genética em que ambos os genes no paciente substituem um T por um A na posição do meio do códon 6. Isto converte o códon GAG (glutamato) ao códon GTG (para a valina) e elimina e sequência reconhecida (CTGAGG que é comum aos códons 5, 6 e 7) e é cortada por uma das enzimas de restrição. 
Quando o gene normal (beta a) é digerido com uma enzima de restrição e os fragmentos são separados por eletroforese a sonda liga-se a um pequeno fragmento (entre as setas vermelhas). 
Quando é o gene doente (beta s) a enzima não pode cortá-lo neste sítio, então a sonda liga-se a um fragmento muito maior. Neste exemplo, uma mudança de um único nucleotídeo produz o RFLP. Isto é uma causa comum de RFLP’s e estes polimorfismos são atualmente referidos como SNP’s (polimorfismo de nucleotídeo único)
CAMPOS DE APLICAÇÃO
ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DO FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO
Homozigoto para o alelo normal da hemoglobina, fragmento que será detectado pela sonda: 1,2 kb. 
Indivíduo portador do alelo de anemia falciforme, dois fragmentos: 1,2 kb e 1,4 kb (um proveniente do cromossomo que tem a sequência normal e o outro proveniente do cromossomo com a sequência da anemia falciforme) 
Indivíduo homozigoto para a anemia falciforme: fragmento de 1,4 kb.
ARTIGO
ARTIGO
 Objetivo: verificar se a técnica de Southern Blot/Hibridização em associação à reação em cadeia da polimerase (PCR) aumenta a sensibilidade na detecção de DNA de hemoplasmas em gatos domésticos.
 Foram utilizadas amostras de DNA extraídas a partir de 149 animais.
 1 amostra teve resultado certamente positivo para hemoplasma pela análise do esfregaço sanguíneo.
 18 amostras apresentaram resultado PCR-positivo para o DNA de hemoplasmas. 
 A técnica de Southern Blot mostrou que 24 amostras apresentaram resultado positivo para hemoplasmas, confirmando os 18 resultados PCR-positivos.
RESULTADOS
CONCLUSÃO
 O método de Southern Blot com sondas específicas mostrou-se mais sensível do que a PCR realizada isoladamente, sendo complementar para o diagnóstico das infecções causadas por hemoplasmas felinos.
 A técnica de SB/Hibridização de DNA associada à PCR é indicada para a obtenção de resultados mais fidedignos em estudos que envolvem o diagnóstico molecular de infecções por hemoplasmas e, possivelmente, outros agentes infecciosos, por aumentar a sensibilidade de detecção.
REFERÊNCIAS
BROWN, Terence A. Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques. Encyclopedia of life sciences. Nature, 2001. 
MACIEIRA, Daniel B. et. al. Uso da técnica de Southern Blot/Hibridização associada à reação em cadeia da polimerase para aumentar a sensibilidade no diagnóstico das infecções por hemoplasmas em gatos domésticos. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 18, n. 1, p. 1-6, dez, 2009. Disponível em: < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1984-29612009000500001>. Acesso em: 29 nov. 2016.
ZAHA, Arnoldo; FERREIRA, Henrique Bunselmeyer; PASSAGLIA, Luciane M. Biologia molecular básica, 4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.
Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição – RFLP. Disponível em <http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-extras/marcadores-moleculares/polimorfismo-no-comprimento-de-fragmentos-de-restri%C3%A7%C3%A3o-rflp/>. Acesso em 26 de novembro de 2016.
Técnicas de análise de DNA aplicadas a diagnóstico. Disponível em <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAjM4AB/tecnicas-analise-dna>. Acesso em 26 de novembro de 2016.
Diagnóstico molecular. Disponível em <http://www.resumosetrabalhos.com.br/diagnostico-molecular.html>. Acesso em 26 de novembro de 2016.
Southern Blott. Disponível em: <https://www.ufpe.br/biolmol/Genetica-Medicina/southern_blot.htm>. Acesso em 29 de novembro de 2016. 
Southern blotting análise de DNA. Disponível em <http://docplayer.com.br/2724540-Southern-blotting-analise-de-dna-northern-blotting-analise-de-rna-western-blotting-analise-de-proteinas.html>. Acesso em 29 de novembro de 2016

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