Apostila microbiologia UFVJM

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UFVJM – MICROBIOLOGIA – DCB063 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 
Profa. Cíntia L. Ramos 
 
APOSTILA: PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA 
 
 
Colônias de Rhodotorula sp; Colônias de Penicillium; células de Pichia sp; 
Agaricus sp; Colônia de Bacillus; Células de Bacillus ; Conidióforo de 
Penicillium; Basidio e basidiósporos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2
REGRAS DO LABORATÓRIO 
 
 
 
 
 
1- 2- 
 
 
 
3 - 4- 
 
5- 6- 
 
 
 
 
 
 
 
3
INSTRUÇÕES DE COMPORTAMENTO NO LABORATÓRIO 
 
1- No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor. 
2- Limpar e desinfetar as bancadas e capelas no início e no final das aulas. 
3- Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como seringas, 
pipetas Pasteur, lâminas de aço e vidros em geral. 
4- Descartar o material utilizado nos locais apropriados. 
5- Todo material utilizado deve ser devidamente identificado. 
6- A alça de platina e agulha utilizadas na manipulação dos microrganismos devem ser 
esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas. Colocá-las sempre na posição 
vertical no suporte e não sobre a bancada. 
7- Nunca pipetar com a boca. 
8- Não sair com nenhum material das aulas. 
9- Não devolva o reagente ao frasco original. Nunca retire do frasco mais do que necessário. 
10- Leia o roteiro de aula prática antes de iniciar qualquer prática. Anote os resultados 
experimentais, discussões e conclusões. Faça todos os exercícios da apostila pois está será 
conferida no final de cada aula. 
11- Antes de deixar o laboratório em cada aula, ordenar todo o material usado, fechar a água, 
o gás e desligar o interruptor e a tomada do microscópio. Mantenha o laboratório 
organizado e limpo. Atenção especial com as bancadas, sua segurança pode estar em jogo; 
Estas normas têm como metas: 
 
· A segurança de cada um e de todos; 
· O bom funcionamento do laboratório; 
· A eficiência e eficácia na condução das práticas. 
 
4 
 
 
POR QUE ESTUDAR MICROBIOLOGIA? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA 
MICROBIOLOGIA DE 
PESQUISA BÁSICA 
MICROBIOLOGIA 
APLICADA 
TAXONOMIA 
MICROBIANA 
*Metabolismo 
*Genética 
*Ecologia 
*Imunologia 
*Epidemiologia 
*Etiologia 
*Controle de Infecções 
*Quimioterapia 
Microbiologia 
Ambiental 
*Tecnologia de 
 Alimentos 
E Bebidas 
*Microbiologia 
farmacêutica 
*Engenharia genética 
Bacteriologia 
Ficologia 
Micologia 
Parasitologia 
Virologia 
Fonte: Black, J.G. Microbiologia- 
Fundamentos e perspectivas. 4 ed. 2002 
5 
 
Índice 
 
 Temas das aulas Página 
1 Ubiquidade microbiana 9 
2 Preparações Microscópicas: Preparações a fresco e Preparações fixadas 
e coradas 12 
3 
 
Observação de leveduras: Morfologia, viabilidade, reprodução 18 
4 
 
Fungos filamentosos: Morfologia macroscópica e microscópica 24 
5 Cultivo de microrganismos: diluição e espalhamento (superfície e pour plate) 35 
6 Obtenção de Cultura Pura: Técnicas de estrias simples e compostas 40 
7 Metabolismo: respiração e fermentação 43 
8 e 9 Identificação bacteriana: Enterobactérias 
 
47 
10 e 11 Controle do crescimento microbiano: Métodos físicos e químicos 
 
52 
 
 
6
 
Introdução ao Laboratório de Microbiologia 
Materiais e Equipamentos 
 
 
O laboratório de Microbiologia apresenta alguns equipamentos e vidrarias comuns a 
outros laboratórios como de química ou analise clínicas. No entanto, algumas vidrarias são 
exclusivas no uso da Área de Microbiologia. Basicamente um laboratório deve possuir autoclave, 
microscópio, Câmara de Segurança Biológica (Capela de Fluxo Laminar), estufas de secagem e 
bacteriológica, BOD, refrigeradores, balanças analíticas etc. 
 
Objetivo 
1-Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia; 
 
Abaixo a descrição dos principais EQUIPAMENTOS: 
a. Autoclave - Câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o 
enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e 
pressão por quaisquer períodos de tempo. A autoclave é um equipamento indispensável ao 
laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, suspensões e descarte de 
material contaminado. 
b. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - Esteriliza a seco toda vidraria 
convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200o C por 1-2 horas. 
c. Refrigerador - Utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa 
temperatura, diminuindo o tempo de geração 
d. Estufa bacteriológica - Favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na 
temperatura adequada. 
e. Câmara de Segurança Biológica (Cabine de fluxo laminar) - Câmara asséptica, dotada de 
exaustor e lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos assegurando a 
assepsia do material. 
f. Microscópio óptico: Utilizado em observação de imagem ampliada até mil vezes por meio de 
dois conjuntos de lentes: as objetivas, que ficam próximas do objeto, e ampliam a imagem real; e 
as oculares, próximas do olho do observador, que ampliam a imagem novamente. É constituído 
 
 
7
por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de 
componentes constituintes do microscópio. A parte mecânica serve para dar estabilidade e 
suportar a parte óptica. É constituída por base ou pé, parafusos macro e micrométricos, haste ou 
braço, mesa ou platina, charriot, presilha, tambor ou revólver das objetivas canhão. A parte óptica 
é constituída por fonte de iluminação, lente condensadora ou condensador, botão do condensador, 
diafragma e pelas lentes oculares e objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do 
objeto. A ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela 
ampliação da ocular. Devido a estes componentes serem de alta precisão e porque o microscópio 
é um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção. 
 
 
 
g. Balança analítica – usada para se obter massas de sólidos e líquidos com alta exatidão. 
h. Bico de Bunsen – é um bico de gás, alimentado por um tubo de borracha, fixado em uma base 
metálica com entrada de ar, cuja chama é utilizada para técnicas de flambagem e esterilização de 
materiais contaminados. 
 
As principais VIDRARIAS são: 
 
 
8
Erlenmeyer, proveta, béquer, pipetas automáticas, Placas de Petri, tubos de ensaio, lâminas e 
lamínulas, Alça de Drigaslky, Pipeta de Pasteur, Câmara de Neubauer, alça de inoculação (ou de 
platina), pissetas. 
1)- 
 
2)- 
 
3)- 
 
4)- 
5)- 6)- 
 
7)- 8)- 
9)- 10)- 11)- 12)- 
 
Exercícios: 
1)- Descreva as funções das vidrarias citadas em aula. 
 
 
2)- Explique o funcionamento e o princípio do funcionamento do autoclave. 
 
 
3)- Explique o funcionamento e o princípio do funcionamento da Câmara de Segurança 
Biológica. 
 
 
9
 
 
 
Introdução 
O nosso meio ambiente está repleto de microrganismos. Podemos encontrá-los no ar, na água, no 
solo, nos vegetais, nos vários objetos e superfícies que nos circundam, etc. e é por isto que o 
trabalho em microbiologia deve ser executado em condições de assepsia que impeçam a 
contaminação dos meios usados com microrganismos adventícios. 
Objetivos 
1- Observar a ubiquidade dos microrganismos; 
2- Observar o crescimento de colônias microbianas em meios de culturas líquidos e sólidos. 
 
Materiais 
Placas contendo ágar Nutriente(AN) 
Placas contendo ágar Sabouraud (Sb) 
Tubos de ensaio contendo Caldo Nutriente 
Tubos de ensaio contendo Caldo Sabouraud 
Estufa à 37°C 
 
Procedimento: 
(Todo procedimento deverá ser realizado próximo à chama do bico de Bunsen). 
1. Uma placa de Petri contendo AN e outra contendo Sb serão expostas ao ar por 20 minutos. 
2. Um tubo de ensaio contendo Caldo Nutriente e outro contendo Caldo Sabouraud serão 
expostos ao ar por 20 minutos. 
3. Cada grupo receberá uma placa com AN e outra com Sb e também um tubo contendo 
Caldo Nutriente e outro com Caldo Sabouraud que serão expostos à diferentes ambientes a 
critério de escolha de cada grupo. Ex. cabelo, dedo, jaleco, unha, água, solo, etc. 
4. Todas placas e tubos deverão ser identificados com o nome do grupo, o ambiente 
pesquisado e data. 
5. As placas e tubos de NA serão incubadas em estufa à 37°C por 48h e as placas e tubo de Sb 
à temperatura ambiente por 5 dias. 
Prática 1 
Ubiquidade microbiana 
 
 
10
Caldos possuem mesma composição do meio, porém sem ágar. 
 
Agar Nutriente 
• Peptona – 1,0 g 
• NaCl – 0,5 g 
• Extrato de carne – 0,3 g 
• Agar – 1,5 g 
• Água destilada – qsp 100 mL 
• pH 7,2 – 7,4 
 
Agar Sabouraud 
• Peptona – 1,0 g 
• Extrato de levedura – 0,3 g 
• Glicose – 2,0 g 
• Agar – 1,5 g 
• Água destilada – qsp 100 mL 
• pH 6,5 
11 
 
Resultados 
1. Descrever aspecto (filamentoso ou cremoso), coloração, brilho (brilhante ou opaca) das colônias crescidas em Placa de Petri em 
cada meio de cultura. 
Ambiente AN Sb 
 Aspecto Coloração Brilho Aspecto Coloração Brilho 
Ar 
 
 
 
 
Verificar frente e verso das placas. 
12 
 
 
 
 
 
Introdução 
Microrganismos constituem um grupo de seres vivos de dimensões reduzidas e bastante 
variáveis de acordo com o grupo a que pertencem. Os procariotos (bactérias e arqueas) variam 
entre 200 nm e 2,0 µm de diâmetro e de 2 a 8 µm de comprimento. Os eucariotos (fungos, algas e 
protozoários) constituem o grupo mais heterogêneo variando de 10 µm a 100 µm (célula vegetal). 
Os vírus, cuja organização estrutural não corresponde a uma célula, variam de 27 nm 
(bacteriófago φX 174) até 300 nm (Pox vírus) de diâmetro. Levando-se em consideração que um 
ser humano seja capaz de perceber, a olho nu, estruturas com diâmetro de 0,2 mm, para 
observação dos microrganismos e seus detalhes, são necessários microscópios. Preparações 
microscópicas compreendem técnicas pelas quais espécimes microbianos são colocados sobre 
lâminas, para serem observados ao microscópio. Duas técnicas gerais permitem o exame 
microscópio. Uma é a suspensão de microrganismos em meio líquido, onde podem ser 
examinados vivos, com auxílio ou não de corantes vitais; na outra, as células microbianas são 
fixadas pelo calor e coradas com corantes químicos específicos. A visualização microscópica a 
fresco dos microrganismos é difícil, dado o reduzido tamanho destes e o índice de refração, que é 
próximo ao da água, o que os torna praticamente incolores quando em meio aquoso. Apesar da 
dificuldade de visualização, as preparações microscópicas a fresco são úteis para se observar o 
tamanho e a forma natural das células microbianas. As preparações fixadas provocam, distorções 
na morfologia das células, pela ação do calor e o efeito dos corantes sobre as células. 
Normalmente, para uma boa visualização da morfologia de uma célula bacteriana, são 
necessários aumentos de 1000 a 2000 vezes (objetiva de imersão – 100X). No entanto, para 
observação de motilidade, arranjo e morfologia de bactérias espiraladas, é necessária a 
observação a fresco. 
Preparações microscópicas compreendem técnicas de tratamento de espécimes 
microbianos em laminas a serem examinadas ao microscópio. Células microbianas podem ser 
examinadas vivas, a fresco, sobre lâminas, com auxílio ou não de corantes vitais (exemplo, azul 
de metileno) ou podem ser fixadas pelo calor sobre lâmina e coradas com corantes químicos 
Prática 2 
Preparações Microscópicas 
Preparações a fresco e Preparações fixadas e coradas 
 
 
13
específicos. A visualização microscópica a fresco é difícil devido ao tamanho reduzido e ao 
índice de refração dos microrganismos. Mas apesar disto é útil para observar a viabilidade e 
algumas atividades celulares, como motilidade e fissão binária, além de permitir observar o 
tamanho e a forma natural das células microbianas. 
Preparações microscópicas fixadas e coradas são úteis para visualizar os microrganismos 
e diferenciá-los em grupos, para fins de diagnostico ou de estudos de suas propriedades. Existem 
várias técnicas de preparação, desde as mais simples, como as preparações a fresco sem 
coloração, até as que exigem maiores cuidados na montagem, como é o caso das preparações 
fixadas e coradas. Nas preparações a fresco, em geral, são utilizados corantes que não 
comprometem a vitalidade das células (não tóxicos). O uso de compostos orgânicos coloridos ou 
corantes facilita a observação de células de microrganismos. Existem corantes que se ligam a 
elementos químicos específicos da célula microbiana, corantes que fluorescem, que mudam de 
cor na presença de reações químicas e corantes que facilitam a visualização. Em geral, os 
microbiologistas usam preparações coradas para mostrar as diferentes estruturas de 
microrganismos, para identificar suas estruturas internas e para ajudar a identificar 
microrganismos similares. Corante é geralmente um sal, em que um dos íons é um cromóforo. Se 
o cromóforo é positivo, o corante é básico ou catiônico, como por exemplo, o azul de metileno, o 
cristal violeta e a fucsina. Se o cromóforo é negativo, o corante é ácido ou aniônico, como por 
exemplo, o ácido pícrico. Corantes básicos são ideais para corar bactérias, porque os ácidos 
nucléicos e alguns componentes da parede celular apresentam carga negativa e atraem os 
cromóforos catiônicos. Nas técnicas de coloração simples, células microbianas são inicialmente 
espalhadas sobre a lâmina, formando um esfregaço; em seguida, são fixadas pelo calor e coradas 
com um único corante. Essa técnica é útil para visualizar a forma (cocos, bacilo ou espirilo) e o 
arranjo de células bacterianas. Algumas estruturas internas das células também podem ser 
visualizadas, como grânulos metacromáticos (polifosfato) e de glicogênio. Nesta aula prática, 
serão realizadas técnicas de coloração simples, para comparar forma e arranjo de diferentes 
células bacterianas. 
A técnica de coloração diferencial requer o uso de pelo menos três reagentes químicos, 
aplicados sequencialmente sobre o esfregaço fixado. O primeiro reagente é um corante que 
confere cor a todas as células; o segundo reagente é um descolorante, que pode ou não remover 
completamente o primeiro corante da célula ou de algumas de suas estruturas. As estruturas 
 
 
14
descoloradas podem adquirir a cor de um segundo corante, corante de contraste. Assim, grupos 
de células ou suas estruturas podem ser diferenciados, com base no corante que é retido. Técnicas 
de coloração diferencial permitem não só a visualização de estruturas como flagelo, cápsula, 
esporo e núcleo, mas também a separação de microrganismos em grupos. A técnica diferencial 
mais importante em bacteriologia é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grandes 
grupos, Gram-positivo e Gram-negativo, sendo importante para o diagnóstico e classificação das 
bactérias. A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro soluções. Cristal violeta (CV), 
primeiro corante que colore as células de roxo escuro. Lugol ou solução de Iodo (I), é a segunda 
solução, um mordente que aumenta a interação entre a célula bacteriana e o primeiro corante, 
formando um complexo insolúvel, Cristal violeta-Iodo (CV-I). Álcool, a terceira solução, é um 
descolorante.As bactérias Gram positivas, quando lavadas com descolorante, retêm o complexo 
CV-I e as bactérias Gram negativas perdem o complexo CV-I, ficando incolores. A ação do 
álcool como removedor do complexo CV-I da célula depende da concentração de lipídeos e da 
espessura da parede celular bacteriana. O último reagente é o corante de contraste, Safranina ou 
Fucsina, diferente na cor do cristal-violeta, que colore as bactérias Gram-negativas de rosa-
avermelhado, mas não altera a cor roxo-escura (azulada) das bactérias Gram-positivas. 
 
Objetivos 
1- Realizar preparo de lâminas a fresco de leveduras e fixada com coloração diferencial de 
bactérias para o exame microscópico. 
3- Diferenciar os grupos de bactérias corados por coloração de Gram 
4- Observar células de leveduras. 
 
Materiais 
Culturas bacterianas e levedura 
Azul de metileno 
Água destilada 
Solução de cristal violeta 
Solução de lugol 
Solução de fucsina 
Álcool 
Lâminas e lamínulas para microscopia 
Cuba para coloração de Gram 
Bico de Bunsen 
Alça de platina 
Microscópio óptico 
 
 
15
Procedimento 
Lâminas a fresco 
1. Coloque uma gota de azul de metileno sobre a lâmina; 
2. Transfira com a alça de repicagem, esterilizada em chama, uma pequena porção da 
cultura de levedura e misture ao corante fazendo movimentos circulares; 
3. Cubra o material com lamínula (adicionar com cuidado para não formar bolhas); 
4. Observar em microscópio óptico; 
 
Lâminas fixadas (Coloração de Gram) 
1. Coloque uma gota de água destilada sobre a lâmina; 
2. Transfira com a alça de repicagem, esterilizada em chama, uma pequena porção da 
cultura bacteriana e misture ao corante fazendo movimentos circulares (esfregaço); 
3. Deixe o esfregaço secar ao ar e então fixar na chama (3X); 
4. Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta por 3 minutos; 
5. Lavar cuidadosamente com água; 
6. Cobrir o esfregaço com lugol por 3 minutos; 
7. Lavar cuidadosamente com água; 
8. Descorar rapidamente o esfregaço com álcool; 
9. Corar o esfregaço com fucsina por 3 minutos; 
10. Lavar cuidadosamente com água, secar e observar ao microscópio óptico em 
objetiva de imersão (100X). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cristal Violeta 
1 minuto
Lave cuidadosamente com água
Lugol
1 minuto 
Lave cuidadosamente com água
Lave cuidadosamente com
etanol 95% e a seguir com água
Fucsina ou safranina 
3 minutos e lave com água 
Deixe a lamina secar a temperatura ambiente e 
e visualize com a objetiva de imersão 
Cristal Violeta 
3 minutos
Lave cuidadosamente com água
Lugol
3 minutos
Lave cuidadosamente com água
Lave cuidadosamente com
etanol 95% e a seguir com água
Fucsina ou safranina 
3 
Deixe a lamina secar a temperatura ambiente e 
e visualize com a objetiva de imersão (100X)
 
 
17
Resultados 
Anotar as observações no quadro abaixo. 
 
Exercícios 
1. Qual é a importância do Lugol (iodo) na coloração de Gram? 
 
 
 
 
 
 
2. Qual a função do álcool na técnica de coloração de Gram? 
 
 
 
 
 
3. Quais as características celulares que podem ser observadas quando preparo de laminas a 
fresco? 
 
 
 
 
 
 
Morfologia da 
colônia 
Tipo de 
Microrganismo 
(bactéria ou levedura) 
Forma 
celular 
Arranjo celular 
(se presente) 
Tipo de coloração 
(Gram ou a fresco) 
1- 
2- 
3- 
 
 
18
 
 
 
 
 
Introdução 
O termo levedura sempre foi associado à história do processo fermentativo. O 
significado da palavra levedura provém do latim “levere” e significa suspender, referindo-
se a produção de gás carbônico durante a fermentação, levantando a superfície líquida 
como uma espuma. 
Existem cerca de 800 espécies, distribuídas em 107 gêneros, de leveduras já 
identificadas e caracterizadas no mundo. Essas espécies foram estudadas com base em 
pequeno número de ambientes conservados. Isso provavelmente subestima a população real 
e diversidade de leveduras presentes na biosfera e ainda não estudadas, bem como 
representa um vasto campo de pesquisas na área de microbiologia. Esses fungos 
desempenham importantes funções em muitos ecossistemas, contribuindo 
significativamente para a biodiversidade. As leveduras são fungos unicelulares, 
pertencentes ao Reino Fungi, classificadas como Ascomycota ou Basidiomycota, que se 
reproduzem vegetativamente por brotamento ou fissão, não produzindo corpo de 
frutificação. A classificação nas divisões Ascomycota ou Basidiomycota é baseada em 
aspectos da sexualidade (asco ou basídio) sendo as categorias taxonômicas baseadas na 
morfologia, fisiologia e características genéticas. As leveduras podem ser classificadas em 
anamórficas ou mitóticas (reproduzem-se assexuadamente por brotamento ou fissão) e 
teleomórficas ou meióticas (reproduzem-se sexuadamente). Representam grupo muito 
heterogêneo de fungos unicelulares, que diferem amplamente nas características 
morfológicas e fisiológicas. Em leveduras, a reprodução assexuada é a forma primária de 
aumento do número de indivíduos na população. Há dois modos básicos de reprodução 
assexuada em leveduras conforme a espécie: fissão ou brotamento. No primeiro caso (por 
exemplo, em Schizosaccharomyces pombe) ocorre mitose nuclear seguida de simples 
divisão celular eqüitativa. No segundo (por exemplo, em Saccharomyces cerevisiae), 
paralelamente à mitose nuclear, forma-se na superfície da célula-mãe uma pequena 
Prática 3 
Observação de Leveduras: 
Morfologia, viabilidade e reprodução 
 
 
19
projeção - o broto - que, à medida que cresce, engloba material citoplasmático e um dos 
núcleos resultantes da mitose. Posteriormente, o broto libera-se da célula-mãe da qual é 
geneticamente idêntico. Na reprodução sexuada duas células haplóides de tipos sexuais 
diferentes podem se fundir formando uma célula com dois núcleos que eventualmente se 
fundem formando um núcleo diplóide. Este sofre meiose originando quatro núcleos 
haplóides e então quatro novas células se formarão, cada uma com um dos quatro núcleos 
haplóides. 
Esses microrganismos crescem em uma grande variedade de substratos, estão 
presentes em habitats naturais, podem crescer associados ao homem e animais e também 
estão presentes em indústrias ou ambientes de aplicação biotecnológica. 
 A biologia e a biodiversidade de leveduras são importantes para a caracterização e 
preservação de espécies, principalmente aquelas com potencial para aplicação 
biotecnológica. Provavelmente a mais difundida e conhecida aplicação biotecnológica de 
leveduras seja a capacidade metabólica de transformar substratos complexos em bebidas 
fermentadas (cerveja e vinho) e destiladas (uísque, rum e cachaça), bem como na 
fermentação de pães, em especial pela espécie. Durante a vinificação outros gêneros de 
leveduras podem ser observados, todavia em menor população que Saccharomyces ao final 
da fermentação, entre eles estão espécies de Aureobasidium, Metschnikowia, 
Hanseniaspora, Cryptococcus e Rhodotorula. 
 Várias leveduras cujo hábitat natural é o solo têm potencial para utilização como 
biorremediadoras e na associação com esporos de fungos micorrízicos favorecendo a 
simbiose. Outras espécies produzem carotenoides, algumas são empregadas na produção de 
lipídeos e derivados, outras estão envolvidas na produção e qualidade de alimentos 
fermentados indígenas, como cauim, e bebidas como café, chocolate e cachaça. 
 
Objetivos 
1- Observar morfologia de colônias de leveduras 
2- Diferenciar leveduras de brotamento e fissão e conhecer as estruturas de formação de 
ascose pseudomicélio. 
 
 
 
 
20
Materiais 
Isolados de leveduras que apresentem reprodução assexuada e sexuada. 
Azul de metileno 
Água destilada 
Microscópio ótico 
Lâminas e lamínulas 
Alça de platina 
 
Procedimento 
1. Limpe bem uma lâmina com papel; 
2. Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen; 
3. Quando a levedura estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de 
repicagem uma gota da cultura de leveduras para o centro da lâmina. Se a cultura 
estiver em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: 
Coloque uma gota de água destilada ou azul de metileno sobre a lâmina e colete o 
material assepticamente, raspando, levemente a superfície do ágar com a alça de 
repicagem (com cuidado para não retirar pedaços do meio de cultura, pois o 
crescimento do microrganismo ocorre somente na superfície); 
4. Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto à utilização 
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize o material, 
seqüencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X; 
5. Terminada a observação, desligue a luz; gire o revolver para encaixar a objetiva de 
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina; 
6. Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e 
desinfetante, colocadas na bancada lateral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
21
Resultados 
Desenhe as estruturas vegetativas e reprodutivas das leveduras observadas no microscópio. 
 
 
 
 
 
 
 
Observações: 
Morfologia da Colônia Morfologia das células Tipo de reprodução 
 
 
 
 
 
MORFOLOGIA DE COLONIAS DE LEVEDURAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22
 
 
 
CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS 
Reprodução Assexuada: Brotamento 
 
 
Reprodução assexuada: fissão 
 
 
Reprodução sexuada: ascósporos 
 
Colônias de leveduras em 
meio de cultura YEPG 
(extrato de levedura, 
peptona e glicose). 
Dias & Schwan, 2010 
 
 
23
 
Morfologia celular das leveduras 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dias & Schwan, 2010. 
Fotomicrografias de células de leveduras (parte inferior): a) células elipsóides de 
Kluyveromyces marxianus (microscopia eletrônica de varredura – MEV); b) Ascósporos de 
Saccharomyces cerevisiae (microscópio ótico, MO, 400x); c) células globosas de S. 
cerevisiae (MEV); d) células globosas de S. cerevisiae em brotamento unipolar (MO, 400x); 
e) células globosas de S. cerevisiae em brotamento multipolar (MO 400); f) células 
cilíndricas de Schizosaccharomyces pombe em fissão (contraste de fase, 100 x). Dias & 
Schwan, 2010. 
 
 
24
 
 
 
 
Introdução 
Os fungos filamentosos encontram-se amplamente distribuídos na natureza, 
proliferando como saprófitas, parasitas ou como simbiontes. São heterotróficos, 
multicelulares, geralmente aeróbios e apresentam reprodução assexuada e sexuada. Como 
saprófitas, degradam a matéria orgânica transformando-a em formas químicas simples que 
retornam ao solo. Se por um lado, os fungos saprófitas são úteis na reciclagem da matéria 
orgânica, por outro, podem causar a deterioração de alimentos, tecidos vegetais e 
ambientes. Como parasitas, causam doenças em vegetais e animais, inclusive no homem. 
Os fungos podem atuar ainda em associações simbióticas de grande importância, como as 
associações com outros organismos, tais como as algas, formando os liquens, ou com raízes 
das plantas, formando as micorrizas. 
Os fungos são caracterizados por uma distinta estrutura filamentosa, multinucleada, 
conhecida como micélio (podendo apresentar-se com aspectos de algodão). O micélio é 
formado por um conjunto de filamentos ramificados que se irradiam sobre ou dentro do 
substrato utilizado como alimento. Cada um desses filamentos recebe o nome de hifa. A 
hifa é constituída por uma parede tubular delgada e transparente, contendo no seu interior o 
protoplasma. As hifas podem ser cenocíticas, ou seja, o protoplasma é contínuo, ou podem 
ser septadas, quando o protoplasma é interrompido por paredes transversais denominadas 
septos. Os fungos de maior importância para o homem são aqueles classificados no reino 
Fungi, chamados de fungos verdadeiros, e alguns do reino Straminipila ou Chromista, 
principalmente do Filo Oomycota. A reprodução sexuada em fungos pode ocorrer de 
varias maneiras. Os esporos sexuados são formados pela fusão de duas células (gametas), 
pelo processo denominado plasmogamia, que reúne dois núcleos em um único citoplasma. 
A etapa seguinte é a fusão desses dois núcleos, no processo denominado cariogamia, com 
a formação de um núcleo diplóide. A terceira etapa, meiose ou divisão redutora separa o 
núcleo diplóide em núcleos haplóides, que são posteriormente delimitados por uma 
membrana e parede celular, dando origem aos esporos haplóides. Como regra geral, os 
Prática 4 
Fungos filamentosos: 
Morfologia macroscópica e microscópica 
 
 
25
esporos sexuados são produzidos menos freqüentemente e em menor número do que os 
esporos assexuados. Há quatro tipos de esporos sexuados de fungos: Zigósporos, 
Oósporos, Ascósporos e Basidiósporos. Quando estes são formados dentro de estruturas 
em forma de saco, conhecidas como ascos, os esporos recebem a denominação de 
ascósporos, e os fungos são incluídos na divisão Ascomycota. Tais esporos são 
freqüentemente encerrados em um corpo de frutificação, denominado ascocarpo. Os tipos 
básicos de ascocarpo são: Cleistotécio, Peritécio, Apotécio, Ascostroma. Os esporos 
sexuados dos fungos pertencentes a divisão Basidiomycota se desenvolvem em estruturas 
em forma de clava, os basídios. Esses esporos são denominados basidiósposros e 
geralmente ocorrem em número de quatro por basídio. Quando maduros, os basidiósporos 
localizam-se na parte externa dos basídios sobre os esterigmas. Em muitas espécies, os 
basídios e seus basidiósporos se organizam em corpos de frutificação altamente complexos, 
denominados basidiocarpos, conhecidos popularmente por cogumelos, orelhas-de-pau, 
bufos, etc. 
As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema 
importância, uma vez que a sua identificação depende, em grande parte, da observação de 
características morfológicas, como o tipo de micélio e de esporos sexuados e assexuados. A 
classificação dos fungos filamentosos baseia-se, principalmente, no tipo de micélio 
vegetativo que o fungo apresenta, isto é, cenocítico ou apocítico, e na presença de 
estruturas de reprodução sexuada e assexuada. 
 
Objetivos 
Observar as estruturas importantes para a identificação de alguns fungos, com 
ênfase nas estruturas que caracterizam cada filo, como tipo de hifa, tipo de esporo e 
estrutura onde os esporos são formados. 
 
Materiais 
Placas com culturas fúngicas 
Lâminas com estruturas de fungos para observação microscópica 
 
Procedimento: 
 
 
26
1. Observação de estruturas fúngicas em microscópio 
2. Observação das características macroscópicas das colônias fúngicas 
 
Resultados: 
Desenhar e identificar as estruturas observadas no microscópio. Anotar o aumento do 
microscópio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Descrever características macroscópicas das colônias: 
1. 
2. 
3. 
4. 
5. 
 
 
27
REINO FUNGI 
CARACTERÍSTICAS GERAIS DE FUNGOS 
 
Micélio: conjunto ou emaranhado de hifas 
Crescimento radial: formação de colônia fúngica 
Hifas: filamento tubular microscópico 
Tipos de hifas: 
-Hifas septadas 
-Hifas não septadasEsporo: unidade reprodutiva. 
Tamanho, forma e cores variadas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28
REINO Straminipila/Chromista- FILO Oomycota 
Características gerais 
 → Hifas não septadas 
 → Reprodução assexuada: Zoósporos 
 → Reprodução sexuada: Oósporos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29
 
REINO FUNGI 
REINO Fungi: FILO Zigomycota 
Características gerais 
 → Hifas não septadas 
 → Reprodução assexuada: esporangiósporos ou aplanósporos 
 → Reprodução sexuada: zigósporo 
Ex: Rhizopus stolonifer 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Zigósporo 
 
 
 
 
 
 
 
 
30
FILO Glomeromycota 
Fungos endomicorrízicos 
 Estruturas: arbúsculos, vesículas e esporos 
Micorriza: associação simbiótica entre fungos filamentosos e raízes de plantas 
Segmento de raiz colonizado por Glomus mosseae. Raiz clarificada com KOH e corada 
com azul de trípano para destacar o tecido fúngico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esporos : Gigaspora margarita (esporos claros), Scutellospora heterogama (esporos 
marrons) e Gigaspora gigantea (esporos amarelos). 
 
 
 
 
Azigósporo de Scutellospora gregaria 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hifa de sustentação Azigósporo de Acaulospora morrowae 
 
 
 
31
FILO Ascomycota 
Cacterísticas gerais – Ascomycota filamentoso: 
 → Hifas septadas 
 → Reprodução sexuada: ascósporos 
 → Reprodução assexuada: conídios 
 
Filo Ascomycota-Esporos assexuados 
Alternaria 
Conidióforos pigmentados, normalmente curtos ou alongados, produzindo em cadeia 
simples ou ramificada de conídios. A forma do conídio é variável, grosseiramente elíptica a 
ovalada. Causa a pinta preta do tomateiro e da batata. 
 
 
 
 
 
 
 
Aspergillus 
Conidióforos longos terminando em projeção tipo clava, lembrando baquetas. Da projeção 
irradiam-se fiálides, dispostas em camada simples ou dupla, das quais se projetam cadeias 
de conídios esféricos. Massa de conídios pode apresentar coloração variada. São saprófitas 
comuns em produtos armazenados. Alguns podem produzir toxinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32
Curvularia 
Conidios escuros geralmente com três septos transversais, curvos em ângulo. Os segmentos 
internos são normalmente maiores e mais pigmentados que os dois extremos. Causa 
mancha de folha de milho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fusarium 
Conidióforos hialinos de forma variável simples ou ramificados, neste caso curtos e 
irregulares ou terminando em tufos de fiálides. Conidióforos isolados ou reunidos em 
esporodóquio. Macroconídio com vários septos transversais, levemente curvos, lembrando 
uma canoa. Microconídios sem septos e hialinos. As diferentes espécies causam diferenças 
doenças em plantas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nigrospora 
Conidióforos curtos, com septos e 
inter-septos mais ou menos dilatados, 
normalmente pigmentados.Conídio 
esférico e negro localizando-se em 
uma vesícula situada no ápice do conidióforo. 
 
 
 
33
Penicillium 
Conidióforos longos, ramificando-se na parte terminal. Conídios esféricos e catenulados 
produzidos em fiálides dispostas em número variável na ramificação terminal do 
conidióforo (conjunto lembra vassoura). Massa de conídios com coloração esverdeada. 
Algumas espécies podem causar podridão em frutos cítricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pestalotia 
Conídios com 4 septos transversais, apresentando três secções intermediárias pigmentadas e 
as duas das extremidades, hialinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34
FILO Basidiomycota 
 Características gerais 
 → Hifas septadas 
 → Reprodução sexuada: basidiósporo 
 → Reprodução assexuada: conídios 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Basidiósporos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
35
 
 
 
 
 
Introdução 
Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob forma 
de populações mistas. Assim sendo, para que seja possível estudar as características das 
espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu isolamento em cultura pura. 
Uma porção representativa da amostra é transferida, com assepsia, para meio de cultura 
sólido (ágar) em placas de Petri. Células microbianas contidas na amostra, suficientemente 
separadas, são imobilizadas no gel de ágar contendo nutrientes e se multiplicam, formando 
um agregado de células idênticas denominadas colônia. Cultura pura aquela em que todos 
os indivíduos originaram-se a partir de uma única célula e são mantidas geneticamente 
idênticas. Quando uma cultura é formada por células de uma mesma espécie, porém, não 
necessariamente geneticamente idênticas, diz que essa cultura é axênica. Na prática, é 
muito difícil manter uma cultura pura, por causa das mutações que ocorrem numa 
população muito elevada de bactérias. Por isso, normalmente uma cultura inicialmente pura 
será, ao final do tempo de crescimento, uma cultura axênica. Apesar disso, é comum nos 
referirmos a essas culturas como sendo puras, pelo fato de terem sido obtidas a partir de 
uma única célula. Os estudos microbiológicos e suas aplicações são efetuados com a 
população dos microrganismos e não com uma única célula, sendo somente válidos se 
realizados com culturas puras. 
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura pura, 
as mais comumente utilizadas são a técnica do esgotamento e a técnica das diluições em 
placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que quando se 
espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter células 
individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras. As 
técnicas utilizadas são a de esgotamento do inóculo (estrias) e a técnica ‘de mistura’ por 
espalhamento (alça de Drigalsky) e derramamento (“pour-plate” ou profundidade). 
Normalmente numa população microbiana mista, a concentração de microrganismos é 
Prática 5 
Cultivo de microrganismos: diluição e espalhamento 
(superfície e pour plate) 
 
 
36
bastante elevada, sendo necessário fazer diluições sucessivas quando se deseja fazer a 
contagem em placas e determinar a população viável na amostra. Para isso, realizam-se 
quantas diluições forem necessárias para que cresça na placa de Petri um número final de 
colônias entre 30 e 300, o que facilitará a contagem e a estimativa da população microbiana 
presente. Nesse caso, também, o espalhamento não deve ser feito por meio de estrias, mas 
aplicando-se uma pequena alíquota conhecida (normalmente 0,1 mL) sobre a superfície do 
meio sólido e espalhando-se com alça de Drigalsky. Outra opção é a utilização da técnica 
“Pour Plate”, na qual aplica-se primeiro a alíquota (1 mL) e depois se verte o meio 
liquefeito e resfriado a 50oC, fazendo-se movimentos rotatórios até que a suspensão de 
células fique bem distribuída no meio de cultura. O resultado será expresso como UFC 
(Unidades Formadoras de Colônias) por mililitro da amostra. 
Nesta aula prática, será realizado o procedimento para obtenção de cultura pura pelo 
método do esgotamento do inoculo em superfície de Agar e os procedimentos para 
contagem de bactérias pela diluição em placas. 
 
Objetivos 
1- Realizar diluições seriadas de amostras microbianas para plaqueamento e contagem de 
colônias determinando Unidades Formadoras de Colônias por mL da amostra original 
(UFC/mL ou g) 
3- Executar rotina de plaqueamento;Materiais 
Amostras de solo ou leite 
Erlenmeyer com 90 mL de solução salina estéril 
Erlenmeyer com meios de cultura Ágar Nutriente fundido (~45°C); 
Placas com meios de cultura Ágar Nutriente 
Placas de Petri estéreis 
Alças de Drigalsky 
Pipetas (1 mL e 0,1 mL) 
Tubos de ensaio com 9 mL de solução salina estéril 
Estufa à 37°C 
 
 
37
Diluição seriada 
IMPORTANTE: Usar no máximo 100µL (0,1mL) de inoculo nas placas de Petri 
quando usado a técnica de espalhamento em superfície. 
 
 
 
Métodos de plaqueamento após realizada a diluição seriada 
 
 
 
 
38
Procedimento 
Contagem de bactérias pelo método das diluições em placas 
1. A partir da amostra original: solo (10g em 90 mL de solução salina) ou leite (1 mL 
em 9 mL de solução salina), realizar as diluições sucessivas, de 10-1 até 10-6 
conforme figura acima; 
2. Transferir 1 mL da amostra para tubo contendo 9 mL de solução salina estéril; 
3. Homogeneizar; 
4. A partir da diluição 10-4, proceder a inoculação de 0,1 mL em meio contendo ágar 
nutriente; 
5. Espalhar o inoculo pelo método de espalhamento em superfície utilizando o auxílio 
de uma alça de Drigalsky; Cuidado: Somente passe a alça no fogo (vidro muito 
quente pode estourar!) 
6. Incubar as placas a 37°C durante 24-48 horas. 
 
Resultados 
Faça a contagem das colônias obtidas nas placas que obtiverem entre 30 e 300 colônias e 
calcule a população total da amostra expressando a contagem em UFC/ mL (ou g) e 
preencha o quadro abaixo. 
 
Amostra/método 
de plaqueamento 
Diluição do tubo 
plaqueada 
Número de colônias 
obtidas (UFC) 
População total 
na amostra 
1 
2 
3 
4 
 
A ESTIMATIVA DA POPULAÇÃO É DADA PELA FÓRMULA: 
População da amostra (UFC/mL ou g) = Número de colônias obtidas x fator de diluição 
do tubo x fator de diluição da alíquota. 
 
 
 
 
39
Exercícios 
1- Por que os meios sólidos são preferidos para o isolamento dos microrganismos? 
 
 
 
2- Por que ao realizarmos contagem em placas consideramos somente aquelas onde tenham 
sido formadas entre 30 e 300 colônias? 
 
 
 
3- Quais são as diferenças entre culturas mistas, puras e axênicas? 
 
 
 
4- Qual é a finalidade das diluições seriadas, efetuadas durante o procedimento de 
enumeração de microrganismos? 
 
 
 
5- Uma amostra de água tem 108 cels/ml, qual a diluição necessária de modo que a 
estimativa de contagem na placa final seja de 100 UFC/ml? 
 
 
 
6- Com base no esquema abaixo, responda: a). Qual a diluição em cada etapa (A-F)? 
b). Qual a diluição total em cada uma das etapas (A-F)? 
 
 
 
40
 
 
 
 
Introdução 
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura pura, 
as mais comumente utilizadas são a técnica do esgotamento e a técnica das diluições em 
placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que quando se 
espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter células 
individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras. As 
técnicas utilizadas são a de esgotamento do inóculo (estrias) e a técnica ‘de mistura’ por 
espalhamento (alça de Drigalsky) e derramamento (“pour-plate” ou profundidade). 
Nesta aula prática, será realizado o procedimento para obtenção de cultura pura pelo 
método do esgotamento do inoculo em superfície de ágar, utilizando estrias simples ou 
compostas e os procedimentos para contagem de bactérias pela diluição em placas. 
 
Objetivo: 
Realizar a técnica de isolamento/purificação por estrias simples e composta de isolados 
obtidos na aula anterior. 
 
Materiais 
Placas com microrganismos da aula anterior 
Placas com Ágar Nutriente 
Alças de platina 
Estufa à 37°C 
 
Procedimento: 
1. Esterilize a alça de repicagem e espere esfriar atrás da chama; 
2. Transfira assepticamente uma colônia bacteriana utilizando alça de repicagem para a 
superfície do meio de cultura; 
3. Espalhe conforme uma das técnicas: estria simples ou estria composta; 
Prática 6 
Obtenção de Cultura Pura: 
Técnicas de estrias simples e compostas 
 
 
 
41
Fazer estrias no meio de cultivo Flambar a alça
Estria composta
Estria composta
Estria composta
Estria simples
Fazer estrias no meio de cultivo Flambar a alça
Estria composta
Estria composta
Estria composta
Estria simples
4. Flambe novamente a alça, deixe-a esfriar no suporte; 
5. Incube as placas em posição invertida, a 30oC, por 24 horas. Observe o crescimento 
de colônias isoladas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42
Resultado 
Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa estriada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Exercício: 
Indique uma colônia que você selecionaria para o isolamento. Se você não obteve uma 
colônia isolada, sugira as possíveis razões para essa falha e o que faria para corrigi-la. 
 
 
43
 
 
 
 
Introdução 
Metabolismo é a soma de todas as reações químicas realizadas pela célula para se 
manter viva e replicar. Estas reações podem liberar energia (CATABOLISMO) ou 
consumir energia (ANABOLISMO). A forma mais importante de armazenar energia é o 
ATP. As reações catabólicas “quebram” moléculas (preferencialmente carboidratos), 
gerando ATP para a “construção” de novas macromoléculas no anabolismo. Os dois 
principais tipos de catabolismo de carboidratos são a respiração, em que a glicose é 
completamente quebrada, e a fermentação, em que ela é parcialmente quebrada. A glicólise 
é a via mais comum para a oxidação da glicose e comum para os dois processos 
(fermentação e respiração). O ácido pirúvico é o produto final. Nesta via, dois ATPs e duas 
moléculas de NADH são produzidas a partir de uma molécula de glicose. 
 
Respiração celular 
Durante a respiração, moléculas orgânicas são oxidadas através da glicólise, ciclo de 
Krebs e cadeia transportadora de elétrons. Na respiração aeróbica, O2 funciona como o 
aceptor final de elétrons. Na respiração anaeróbica, o aceptor final d e elétrons é uma 
molécula inorgânica que não o O2. O clico de Krebs consiste na descarboxilação do ácido 
pirúvico produzindo uma molécula CO2 e um grupo acetil. Os grupos acetil de dois 
carbonos são oxidados e os elétrons são capturados pelo NAD+ e FAD para a cadeia de 
transporte de elétrons. A partir de uma molécula de glicose, a oxidação produz seis 
moléculas de NADH, duas moléculas de FADH2 e duas moléculas de ATP. A 
descarboxilação produz seis moléculas de CO2. Os elétrons são conduzidos á cadeia de 
transporte de elétrons pelo NADH. A cadeia de transporte de elétrons consiste de 
transportadores, incluindo flavo-proteínas, citocromos e ubiquinas. Para geração de ATP, 
prótons são bombeados através da membrana gerando uma força próton-motiva enquanto 
os elétrons se movem por meio de uma série de aceptores ou transportadores. A energia 
produzida a partir do movimento dos prótons pela membrana é utilizada pela ATPsintase 
para fazer ATP a partir de ADP e P. Em eucariotos, transportadores de elétrons estão 
Prática 7 
Metabolismo: respiração e fermentação 
 
 
 
44
localizados na membrana mitocondrial interna; em procariotos, transportadores de elétrons 
estão na membrana plasmática. 
Em procariotos aeróbicos, 38 moléculas de ATP podem ser produzidas pela 
oxidação completa de uma molécula de glicose na glicólise, no ciclo de Krebs e na cadeia 
de transporte de elétrons. Em eucariotos, 36 moléculas de ATP são produzidas da oxidação 
completa de uma molécula de glicose. 
Na pratica de hoje, utilizaremos o azul de metileno como indicador de reações de 
oxidação e redução,que ocorre no processo respiratório. O azul de metileno apresenta 
coloração azul na sua forma oxidada, e quando reduzido, torna-se translúcido. 
 
Fermentação 
A fermentação libera energia de açúcares ou outras moléculas orgânicas através da 
oxidação parcial, produzindo menos energia que a respiração. O O2 não é necessário, mas 
pode ocorrer na presença deste. Na fermentação, duas moléculas de ATP são produzidas 
pela fosforilação em nível de substrato. Não existe cadeia de transporte de elétrons. Os 
elétrons removidos do substrato reduzem NAD+ e o aceptor final de elétrons é uma 
molécula orgânica. Na fermentação do ácido lático, ácido pirúvico é reduzido pelo NADH 
a ácido lático. Na fermentação alcoólica, acetaldeído é reduzido pelo NADH para produzir 
etanol. Fermentadores heteroláticos podem utilizar a via pentose fosfato para produzir ácido 
lático e etanol. 
Para ser “fermentável”, um composto precisa ser capaz de produzir intermediários 
tanto oxidáveis quanto redutíveis, por isso, não pode ser nem muito oxidado e nem muito 
reduzido. Os açúcares preenchem estas exigências admiravelmente e estão entre os 
compostos mais fácil e amplamente utilizados pelos microrganismos fermentadores. Outras 
substâncias, incluindo vários ácidos orgânicos, aminoácidos, purinas e pirimidinas podem 
ser fermentadas por algumas bactérias. Os produtos finais de uma dada fermentação variam 
com o tipo de organismo, natureza do substrato fermentável e, em alguns casos, com os 
fatores ambientais temperatura e acidez do meio. 
Contudo, a utilização de microrganismos fermentadores se presta devido principalmente à 
transformação de um alimento para outro com características mais peculiares no sabor, 
textura, aparência e digestibilidade, agregando-se assim valor a um produto primário, ou até 
 
 
45
produzindo um novo alimento sem perda ou utilização de grandes quantidades de energia, 
visto que se trata de um dos mecanismos de biossíntese de menor gasto energético. As 
fermentações são controladas pelo homem através da escolha dos microrganismos, dos 
substratos, da temperatura e pH adequados. 
 
Objetivo 
Observar a atividade metabólica microbiana (respiração e fermentação) nos diferentes 
substratos/meios utilizados. 
 
Respiração celular 
Materiais 
Tubos com culturas bacterianas E. coli e Staphylococcus 
Solução de azul de metileno 1:10.000 
Pipetas de 1 mL 
 
Procedimento: 
1. Adicionar 0,5 mL da solução de azul de metileno no tubo com a cultura bacteriana; 
2. Incubar em estufa a 37°C por 15 a 30 minutos; 
3. Anotar o resultado antes e após incubação. 
 
Resultados: 
Coloração antes incubação: 
Coloração após incubação: 
 
Exercício 
1. Explique o que aconteceu com o azul de metileno após a incubação do tubo. Por que 
isso ocorreu? 
 
 
 
 
 
 
46
Fermentação 
Material 
Água destilada morna 
Farinha de trigo 
Açúcar 
Fermento biológico 
Erlenmeyer 
balões 
 
Procedimento: 
1. Adicionar aproximadamente 150 mL de água morna nos 3 Erlenmeyer 
2. No primeiro adicionar 2 colheres de fermento biológico 
3. No segundo adicionar 2 colheres de fermento biológico e 2 colheres de farinha de 
trigo 
4. No terceiro acionar 2 colheres de fermento biológico e 2 colheres de açúcar 
5. Homogeneizar os 3 Erlenmeyer e colocar o balão na boca 
6. Observar formação de gás 
 
Resultados 
Anotar os resultados obtidos na tabela abaixo: 
Amostra (Erlenmeyer) Produção de gás 
Positivo Negativo 
1. Água morna + fermento 
2. Agua morna + fermento + farinha 
3. Água morna + fermento + açúcar 
 
Exercício 
1. Explique o que aconteceu no Erlenmeyer 3. Por que o mesmo não ocorreu nos 
outros Erlenmeyer? 
 
 
 
 
47
 
 
 
Introdução 
Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das 
características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime 
(ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes 
fundamental para identificação. A execução inadequada de um teste preliminar pode 
confundir e prejudicar todo processo de identificação. Na rotina laboratorial são utilizados 
certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para 
diagnóstico. 
O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação 
de um número mínimo de propriedades (PROVAS BIOQUÍMICAS). Portanto, quanto 
menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação. 
Usualmente é necessário utilizar organismos como controles positivos e negativos para a 
execução de cada teste. 
 
Provas bioquímicas 
A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de 
Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou 
espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que 
ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo. 
Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimático 
específico, promovendo transformação bioquímica específica, as provas bioquímicas 
podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização. 
Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo 
especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições 
nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento. Na prática de hoje, serão 
realizados uma série de provas bioquímicas para identificação de bactérias da família 
Enterobacteriaceae. 
Práticas 8 e 9 
Identificação bacteriana: enterobactérias 
 
 
48
 
Objetivo 
1. Inocular bactérias em diferentes meios-teste; 
2. Observar modificações nos meios-teste após cultivo microbiano e/ou adição de 
reagentes; 
3. Comparar resultados obtidos com chaves de identificação descrita na literatura. 
 
Material 
Placas com culturas de bactérias E. coli, Proteus sp., Serratia sp. 
Meios de cultivo para testes de identificação bacteriana: Nitrito, Fenilalanina, Uréia, 
Fermentação (lactose, glicose e manitol), Lisina Descarboxilase, Malonato, Indol, H2S e 
Citrato. 
 
Procedimento: 
1. Inocular cada cultura bacteriana em todos os meio-testes. 
2. Incubar à 37 °C por 24-48h. 
3. Observar resultado e buscar espécie na chave de Identificação Bioquímica. 
 
Meios-teste: 
NITRITO 
100 mL Caldo Simples; 0,1 g Nitrato de Potássio: 0,1 g; pH 7,6 
Reativo de Griess-Ilosvay: 
1- 5 g Ácido Sulfanílico; 1000 mL Ácido Acético 5N 
2- 5 g Naftilamina; 1000 mL Ácido Acético 5N 
Colocar algumas gotas de cada solução de Griess-Ilosvay no tubo de ensaio com bactéria 
crescida. O aparecimento da coloração róseo-avermelhada indica reação positiva. 
FENILALANINA 
3 g Extrato de levedura; 2 g DL- fenilalanina; 1 g Na2HPO4; 5 g NaCl; 12 g Ágar; 1000 mL 
Água Destilada; pH 6,9 
Após incubação, gotejar 4 a 6 gotas de uma solução de cloreto férrico 10 % sobre o 
crescimento. O aparecimento de cor verde indica reação positiva. 
 
 
49
URÉIA 
1 g Peptona; 5 g NaCl; 2 g KH2PO4; 1 g Glicose; 6 mL solução vermelho de fenol 0,2%; 10 
g Uréia; 1000 mL água destilada; pH 6,9 
Após incubação e crescimento, o aparecimento de coloração róseo-avermelhada indica 
reação positiva. 
FERMENTAÇÃO LACTOSE, GLICOSE E MANITOL 
100 mL água peptonada; 0,0025 g vermelho de fenol; 1 g carboidrato (lactose ou glicose ou 
manitol) 
Após incubação, o aparecimento de coloração amarelada indica reação positiva. No tubo 
teste para glicose, observar formação de bolhas de gás no tubo de Durhan. 
LISINA DESCARBOXILASE 
Meio básico: 5 g Peptona; 3 g Extrato de levedura; 1 g Glicose; 1 mL vermelho de 
bromocresol (1,6 % em água); 1000 mL água destilada; pH 6,8 
Lisina controle: meio básico sem aminoácidoLisina teste: meio básico acrescido de 0,5 % de Lisina 
Leitura: tubo controle: amarelo; tubo teste: vermelho-púrpura indica reação positiva. 
MALONATO 
1 g Extrato de levedura; 2 g (NH4)2SO4; 0,6 g K2HPO4; 0,4 g KH2PO4; 2 g NaCl; 3 g 
Malonato de Sódio; 0,25 g glicose; 0,025 g azul de bromotimol; 1000 mL água destilada 
Alteração da coloração do indicador de verde para azul (pH 7,6) indica reação positiva; 
MEIO SIM (para testes H2S, INDOL e MOTILIDADE) 
20 g Peptona de caseína; 6,1 g Peptona de carne; 0,2 g Tiossulfato de Sódio; 3,5 g ágar; 100 
mL água destilada; pH 7,3 
H2S 
Escurecimento do meio indica reação positiva 
INDOL 
Pesquisa de indol utilizando reativo de Ehrlich-Bohme: 
Solução 1: 1 g p-dimetilaminobenzaldeído; 95 mL álcool etílico (95%); 20 mL HCl 
concentrado 
Solução 2: Solução aquosa de Persulfato de Potássio 
 
 
50
Após crescimento, adicionar partes iguais das soluções 1 e 2. O aparecimento de um anel 
róseo na superfície indica reação positiva. 
MOTILIDADE 
Inocular bactérias utilizando agulha, fazendo uma picada central até ¾ da profundidade 
do tubo. Crescimento difuso indica motilidade positiva, as imóveis ficam confinadas à linha 
da picada. 
CITRATO 
5 g NaCl; 0,2 g Sulfato de Magnésio; 1 g Fosfato de amônio; 1 g Fosfato de Sódio; 5 g 
Citrato de Sódio; 0,08 g Azul de bromotimol; 20 g ágar; 1000 mL água destilada; pH 7,0 
Alteração da cor verde do indicador azul de bromotimol para azul indica reação positiva. 
 
Resultado 
 Completar tabela na próxima página. 
 
Exercícios 
1. De um modo geral, como são identificadas bactérias causadoras de doenças em 
amostras clínicas? 
 
 
 
2. Pesquise e descreva as reações metabólicas ocorridas em cada teste realizado na 
aula prática para identificação da bactéria. 
 
 
51 
 
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTERIACEAE (MANUAL BERGEY, 1984) 
 
 Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiela Proteus Salmonella Serratia Shigella Yersinia Resultado 
da amostra 
Nitrito + + + + + + + + + 
Fenilalanina - - - - + - - - - 
Uréia +/- +/- - +/- + - +/- - + 
Lactose +/- - +/- + - - - - +/- 
Glicose + + + + + +/+ +/+ + +/+ 
Manitol + + +/- + - + + +/- + 
Lisina - +/- +/- +/- - + +/- - - 
Malonato +/- +/- +/- + - - - - - 
Indol +/- - +/- +/- +/- - - +/- +/- 
H2S - - - - +/- + - - - 
Motilidade + + +/- - + +/- + - - 
Citrato + + - + +/- +/- + - - 
- = 0 a 10 % das amostras são positivas; +/- = 26 a 75 % das amostras são positivas; + = 90 a 100 % das amostras são positivas. 
 
 
52 
 
 
 
 
Introdução 
Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes químicos e físicos, os 
quais podem atuar eliminando ou impedindo o seu crescimento, criando condições nas quais eles 
não podem se reproduzir. Uma grande variedade de métodos pode ser utilizada, como, por 
exemplo, calor, radiações ionizantes, etc. A esterilização e desinfecção ou desinfestação de 
materiais são etapas básicas quando se trabalha num Laboratório de Microbiologia. 
Conceitos importantes referentes aos diferentes métodos de inibição do crescimento 
microbiano: 
⇒ Esterilização- é o processo pelo qual eliminam-se todas as formas vivas presentes em um 
material ou ambiente. A esterilização pode ser realizada pelo calor, pela radiação pela filtração e 
por agentes químicos. Esses processos destroem células microbianas numa progressão 
geométrica; portanto, quanto menor à população inicial, mais rápida é a esterilização. É 
fundamental em todos os procedimentos microbiológicos. Os materiais, a água, os vasilhames 
utilizados na preparação de meios de cultura e soluções nutritivas para o crescimento de 
microrganismos devem ser isentos de qualquer forma de vida. As relações tempo/temperatura e 
volume/área do material ou meio a ser esterilizado, bem como a eficiência de penetração ou 
difusão do agente letal, devem ser considerados na definição do processo de esterilização. 
⇒ Desinfecção- é a eliminação parcial (ou redução) do número de microrganismos 
(principalmente patogênicos) presentes em um material inanimado (utensílios, equipamentos, 
paredes, chão, mesas, etc). A desinfecção é feita por agentes químicos-que são os desinfetantes. 
⇒ Assepsia- conjunto de processos (técnicas) utilizados para impedir a entrada de 
microrganismos em local que não os contenha 
⇒ Sanitização- é o tratamento que leva a diminuição da vida microbiana nos utensílios 
alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde publica. 
Processo realizado com agentes químicos que podem ser sabão ou detergente e desinfetantes do 
tipo sanitizantes. 
Prática 10 e 11 
Controle do crescimento microbiano: Métodos físicos e químicos 
 
 
53
⇒ Antissepsia- Semelhante a desinfecção, porém relacionada a tecidos vivos. É feita, também, 
por meio de agentes químicos, denominados antissépticos, em concentrações adequadas para 
estes tecidos. 
 
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO/DESINFECÇÃO/ASSEPSIA 
Agentes Físicos: Calor, radiações, filtração. 
Calor: é um dos mais importantes métodos usados para o controle do crescimento de 
microrganismos. Acima da temperatura ideal de crescimento o calor vai promover a desnaturação 
de proteínas estruturais e enzimas, levando a perda da integridade celular e morte. 
Calor úmido na forma de vapor tem maior poder de penetração e elimina formas vegetativas dos 
microrganismos. A morte pelo calor é uma função exponencial que ocorre à medida que a 
temperatura se eleva. O tempo de redução decimal (valor D) é o tempo de exposição necessário a 
uma determinada temperatura para reduzir a um décimo o numero original de microrganismos 
viáveis (matar 90%). Quanto maior a temperatura menor será o valor D. É utilizado 
principalmente para esterilização de meios de cultura onde os microrganismos são eliminados 
pela combinação de temperatura, umidade e pressão em autoclave. A autoclave pode ser 
cilíndrica ou cúbica, horizontal ou vertical, dotada com um dispositivo elétrico ou a gás, que 
permite o aumento simultâneo da temperatura e pressão. O calor úmido, inativa os 
microrganismos pela coagulação das proteínas e é um processo muito mais eficiente que o calor 
seco, porque a água tem maior condutibilidade térmica que o ar. 
 
Tipos de tratamento por calor úmido 
Autoclave - 121oC/15 min 
Fervura - 100oC 
Vapor Fluente - 100oC - Contínuo 
 - Fracionado (Tindalização): 30 min/ 3 dias 
Pausterização –Método muito usado na indústria de alimentos. Ocorre uma redução no numero 
dos microrganismos pela exposição breve a uma temperatura relativamente alta. Não esteriliza. 
Existem basicamente três tipos: 
Ultra-alta temperatura (ultra-high temperature, UHT) (141oC/2 s) 
Alta temperatura (higt temperature, short time, HTST (72oC/15 s) 
 
 
54
Baixa temperatura (low temperature, LTH) (63oC/30 min) 
 
 
Esquema de funcionamento de uma autoclave, utilizada para esterilização de materiais por calor 
úmido. 
 
Calor seco: é o processo de esterilização por elevação da temperatura em ambiente com umidade 
extremamente baixa. É utilizada para vidraria e utensílios resistentes a altas temperaturas 1700C 
(Tabela). O equipamento utilizado é a estufa esterilizadora. Neste processo, os microrganismos 
são inativados pela oxidação dos componentes celulares, sendo as células vegetativas mais 
sensíveis ao calor do que as formas esporuladas. Para evitar contaminação das placas e pipetas 
após a esterilização, estas são previamente embaladas em papel jornal. As pipetas podem, ainda, 
ser esterilizadas dentro de suportes metálicos próprios para esta finalidade e podem ser 
armazenadas por vários meses em ambiente seco. 
 
Tempo e temperatura para esterilização de artigos e substancias segundo recomendações do 
Ministério da Saúde. 
 
ManômetroVálvula de 
exaustão de 
vapor 
Porta 
Saída de vapor 
sob pressão 
Jaqueta 
 
Câmara 
Saída de ar 
Entrada de vapor 
Válvula de 
saída de ar 
 
 
 
 
 
55
Materiais Temperatura (oC) Tempo (minutos) 
Vidrarias 170 120 
Aço inoxidável e outros 
metais 
160 
170 
120 
60 
Vaselina líquida e outros óleos 160 120 
Pós (100 gramas) 160 120 
 
Baixas temperaturas: Métodos de controle dos microrganismos porque causa diminuição na 
taxa de crescimento e na atividade enzimática. Métodos que empregam baixa temperatura pode 
ser: refrigeração, congelamento. 
 
Radiações: constituem num método eficaz para reduzir ou eliminar os microrganismos. O 
material a ser esterilizado é submetido à ação de radiação ionizante (Raios X, γ) e ultravioleta 
(UV). Possuem energia para retirada dos elétrons das moléculas, ionizando-as (formando íons). A 
principal molécula ionizada é a água, com a formação de radicais tóxicos que levam a perda de 
elétrons por varias moléculas e formação de radicais livres. A ação mais prejudicial é no DNA, 
mas atinge outras moléculas como proteínas. Leva a morte celular. As principais fontes de 
radiação, γ-ionizante comercial são o cobalto 60 e o césio 137. A radiação gama é mais usada 
para esterilização de materiais plásticos, suprimentos médicos, materiais descartáveis e alimentos 
termolábeis (não permanecem resíduos de radiação) como hambúrguer e frangos. A radiação 
ionizante é extremamente perigosa, com alto poder de penetração, exigindo normas técnicas que 
regulamentam seu uso, o qual requer supervisão da Comissão Nacional de Energia Nuclear 
(CNEM). Por ser um método de alto custo, no Brasil prevalece nos hospitais a esterilização por 
óxido de etileno. 
A radiação UV não é ionizante compreende comprimentos de onda entre 240-280nm 
sendo utilizada para desinfetar ambientes e superfícies, por causa do seu baixo poder de 
penetração. A radiação UV é absorvida por muitas substâncias celulares, mas de modo mais 
significativo pelos ácidos nucléicos. Tem ação mutagênica levando a formação de dímeros de 
timina, que impedem a ação da DNA polimerase. Muito usada em laboratórios nos fluxos 
laminares ou superfícies em geral, laboratórios clínicos e salas de cirurgia. 
 
 
 
56
Filtração: normalmente utilizada para esterilização de meios líquidos e gases que são sensíveis 
ao calor (proteínas, aminoácidos, antibióticos, vitaminas). Os filtros mais usados são: acetato, 
policarbonato, porcelana, cerâmica, papel-celulose e filtros de membrana (éster de celulose) com 
poros de diâmetro conhecidos. 
Outros métodos físicos de controle do crescimento microbiano: Dessecação, Liofilização, 
Defumação, Remoção de Oxigênio, Vibração Ultra-Sônica. 
 
 
 
Agentes Químicos: são substâncias químicas de origem natural ou sintética usadas para eliminar 
ou inibir o crescimento dos microrganismos. Visam esterilização, descontaminação, desinfecção, 
anti-sepsia de materiais ou ambientes (salas cirúrgicas, câmaras assépticas, bancadas de 
laboratório). Sua ação depende de vários fatores como concentração, tempo de contato, pH, 
temperatura, tipo de microrganismos, etc. Apresentam efeitos: 
Efeito estático - inibição do crescimento. Em condições normais os microrganismos voltam a 
crescer. 
Efeito microbicida - morte dos microrganismos. 
Exemplos de agente químicos: Desinfetantes, agentes alquilantes, oxido de etileno, fenol, 
clorofórmio, álcool, metais pesados, compostos halogenados, etc. 
 
Objetivo: 
Verificar a eficácia de métodos físico-químicos no controle do crescimento microbiano. 
 
 
57
Aula 10: Métodos Físicos: radiação UV 
Material 
tubos de ensaio com suspensão bacteriana 
placas de Petri estéreis (sem meio) 
Swabs 
Placas de Petri com NA 
 
Procedimento 
Você terá disponível 5 tubos de ensaio com suspensão bacteriana a ser testada. 
1. Colocar 10 ml da suspensão bacteriana (Tubo 1) em uma placa de Petri (sem meio de cultura 
e previamente esterilizada) em capela de fluxo laminar. 
2. Expor a placa com a suspensão bacteriana a luz UV por 5 minutos (usar a luz UV da capela). 
Desligar a UV. 
3. Retirar uma amostra (swab) e plaquear por superfície em AN. 
4. Proceder o mesmo que os itens 1 e 2 porém o tempo de exposição será de 10 minutos (Tubo 
2). Repetir o procedimento 3. 
5. Suceder de igual forma até o tempo de exposição de 20 minutos (Tubo 3 – 15 min; Tubo 4 – 
20 min). 
6. Plaquear um tubo (Tubo 5) diretamente em placa AN, sem exposição à luz UV (controle). 
 
Resultados 
 
Ensaios Tempo de exposição 
(minutos) 
Número de colônias formadas 
1 5 
2 10 
3 15 
4 20 
Controle 0 
 
 
 
 
58
Aula 11: Métodos químicos: detergente e iodo 
Material 
Placas de Agar Nutriente 
Swab 
Detergente 
Álcool iodado a 2% 
 
Procedimento: 
1. Dividir a placa com AN em três partes (controle, detergente e iodo); 
2. Carimbar o dedo sem lavar (controle), lavado com detergente e tratado com solução de 
álcool iodado a 2 % nos locais apropriados da placa; 
3. Incubar em estufa a 37°C por 24-48 h. 
4. Anotar resultados de crescimento/ausência de crescimento dos diferentes tratamentos. 
 
Resultados 
Anotar os resultados na tabela abaixo. 
Tratamento Crescimento Ausência de crescimento 
Controle 
Iodo 
Detergente 
 
Aula 11: Métodos químicos: antibiograma 
Material 
Tubos de ensaio com culturas bacterianas Staphylococcus sp. e Proteus sp. 
Placas de Petri com Ágar Muller-Hinton 
Swabs estéril 
Pinça 
Discos com antibióticos: cefoxitina, clindamicina e ciprofloxacina 
 
 
 
 
 
59
Procedimento 
1) Inocular assepticamente as suspensões bacterianas nas placas com Ágar Muller-Hinton 
com auxílio do swab, tomando cuidado para que toda placa fique coberta; 
2) Com auxílio de uma pinça previamente flambada, transfira assepticamente os discos de 
papel contendo os antibióticos para a superfície do meio de cultura inoculado. (OBS: cada 
placa deve conter um disco de cada antibiótico); 
3) Incubar as placas em estufa à 37oC, por 24 horas. 
4) Observar o crescimento bacteriano e as zonas de inibição em torno dos discos de papel. 
Medir o diâmetro (mm) da zona de inibição com régua e anotar os resultados na tabela 
abaixo. 
 
Resultado 
Anote o tamanho (mm) dos halos de inibição obtidos para cada bactéria nos diferentes 
antibióticos. 
 Halo de inibição (mm) 
Bactéria Cefoxitina Clindamicina Ciprofloxacina 
Staphylococcus sp. 
Proteus sp. 
Cefoxitina: inibe síntese da parede celular 
Clindamicina: inibe síntese de proteínas 
Ciprofloxacina: inibe síntese de DNA 
 
Resultados de Referência - sensível 
Bactéria Cefoxitina Clindamicina Ciprofloxacina 
Staphylococcus sp. ≥ 22 mm ≥ 17 mm ≥ 17 mm 
Proteus sp. ≥ 22 mm ≥ 17 mm ≥ 17 mm 
 
 
 
 
 
 
 
60
QUESTÕES 
 
1). Existem diferenças do modo de ação dos antibióticos contra bactérias Gram positivas e Gram 
negativas? 
 
 
 
 
2). Quais os principais mecanismos de ação dos antibióticos sobre as células microbianas? 
 
 
 
 
3) Antibióticos que agem sobre o peptideoglicano são ativos contra fungos e vírus? Explique. 
 
 
 
4)- Explique como agem o iodo, calor e a radiação UV para ser efetivos no controle do 
crescimento microbiano. 
 
 
 
5). Conceitue assepsia, desinfecção e esterilização. 
 
 
 
 
6). Construa um gráfico de concentração de células x tempo de exposição sob luz UV. 
 
 
 
 
 
61
Referências 
 
ALEXOPOULOS, C.J. & MIMS, C.W. Introductory Mycology. Singapore: John Wiley & 
Sons, 1979. 632 p. 
BERGEY, D. H., BUCHANAN, R. E., & GIBBONS, N. E. (1974). Bergey's manual of 
determinative bacteriology. Baltimore, Williams &Wilkins. 
BROCK, T.D. & MADIGAN, M.T. Biology of microorganisms. New Jersey: Prentice Hall 
International, 2012. 835 p. 
BUCHANAN, R.F.; GIBBONS, N.E. Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology. 8 th. 
Ed. Baltimore, Wllians & Wilkins Co. 1974. 
CAPPUCINO, J.G., SHERMAN, N. Microbiology: a laboratory manual. 6th Edição.491 p. 2001. 
LARPENT, J. P. & LARPENT-GOURGAUD, M. Microbiologia Prática. São Paulo: Edgard 
Blucher Ltda-USP, 1975. 162p. 
LOURES, E. G. & GUIMARÃES, W. V. Microbiologia. Técnicas de laboratório. Principais 
provas Empregadas para Identificação de Bactérias. Viçosa, Imprensa Universitária, U. F. V. 
1981. 
NEDER, R.N. Microbiologia: Manual de Laboratório. São Paulo: Nobel, 1992. 138p. 
PRESCOTT, L.M.; HARLEY, J.P. & KLEIN, D.A. Microbiology. Dubuque: Wm. C. Brown, 
1990. 868 p. 
RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbiologia Prática: roteiro e manual: bactérias e 
fungos. São Paulo: Editora Atheneu, 2000. 112p. 
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R. & CASE, C.L. Microbiologia. Artes Médicas Sul, Porto 
Alegre, 2005