teste da antiglobulina humana

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Ana Lúcia Girello 
bioline@globo.com 
CRÉDITOS 
Karina Cruz 
Especialista de Suporte ao Produto IHD 
Divisão de Imuno-hematologia 
Laboratório de Atendimento ao Cliente Bio-Rad (Lagoa Santa-MG) 
Tópicos 
ü O	
  soro	
  de	
  an*globulina	
  humana	
  (composição,	
  funções	
  e	
  
apliacações	
  na	
  ro*na	
  laboratorial)	
  	
  
ü O	
   teste	
   da	
   an*globulina	
   humana:	
   fundamentos	
   da	
  
técnica	
  em	
  tubo	
  e	
  em	
  gel-­‐teste	
  
ü Teste	
  direto	
  e	
  indireto:	
  	
  
ü Quando	
  fazer?	
  	
  
ü Como	
  fazer?	
  	
  
ü Como	
  interpretar?	
  	
  
ü Algoritmos	
  
ü Os	
  erros	
  mais	
  frequentes.	
  
TESTE	
  DE	
  COOMBS	
  
OU	
  
TESTE	
  DE	
  
ANTIGLOBULINA	
  
HUMANA	
  ?	
  
Usar	
  soro	
  AGH	
  monoespecífico	
  ou	
  
poliespecífico?	
  
TAD	
  +	
  /	
  PAI+	
  
E	
  agora	
  ,	
  o	
  que	
  fazer?	
  
Calma, vamos às respostas! 
•  Indivíduo	
   que	
   produziu	
   um	
   an*corpo	
   irregular,	
  
isto	
   é,	
   an*corpo	
   que	
   não	
   deveria	
   ter	
   sido	
  
formado.	
  
•  Pode	
   estar	
   livre	
   no	
   soro	
   ou	
   adsorvido	
   às	
  
hemácias.	
  
•  Atenção:	
   Devemos	
   sempre	
   avaliar	
   seu	
  
significado	
  clínico!	
  
 
YY 
Y 
YY 
Y 
Y
Y 
Y 
SENSIBILIZAÇÃO 
Hemólise mediada por anticorpos 
Auto- Anticorpo 
Aloanticorpo 
Anticorpo droga-induzido 
Crédito da ilustração: Dr. Claudio Brandão (Hospital Aliança-BA) 
Individuos	
  que	
  recebem	
  transfusão	
  de	
  sangue	
  e	
  componentes	
  
sanguíneos	
  podem	
  desenvolver	
  an*corpos	
  a	
  uma	
  centena	
  de	
  
anMgenos	
  eritrocitários. 
Y 
Y Y
Y 
Y 
Y
Y 
Auto 
anticorpo? 
Y 
Y
Y 
Y 
Y
Y 
TAD POSITIVO 
Y 
YY 
Aloanticorpo? 
YY 
Y 
Y 
YY 
Y 
Y Y 
PAI POSITIVO 
TAD PAI 
Estes acs geralmente são não aglutinantes! 
Crédito da ilustração: Dr. Claudio Brandão (Hospital Aliança-BA) 
Alguns	
  an*corpos	
  não	
  conseguem	
  abaixar	
  o	
  Potencial	
  
Zeta,	
  ao	
  ponto	
  crí*co	
  de	
  promover	
  a	
  aglu*nação	
  dos	
  
eritrócitos	
  em	
  meio	
  salínico:	
  	
  
an*corpos	
  não	
  aglu*nantes	
  ou	
  “incompletos”	
  (IgG).	
  
	
  
•  Precisam	
  de	
  um	
  meio	
  ar*ficial	
  que	
  promova	
  a	
  
visualização	
  desta	
  reação,	
  promovendo	
  a	
  aglu*nação:	
  
	
  	
  	
  
•  1945:	
  Coombs,	
  Mourant	
  e	
  Race	
  	
  
•  Induzindo	
   a	
   produção	
   de	
   an*-­‐an*corpos	
  
humanos	
   em	
   animais	
   (cabras	
   ou	
   coelhos)	
   com	
  
injeções	
   de	
   imunoglobulinas	
   humanas,	
   houve	
  
produção	
   de	
   an*corpos	
   contra	
   as	
   frações	
   Fc	
  
destas	
  imunoglobulinas.	
  	
  
•  Portanto,	
   o	
   soro	
   de	
   Coombs	
   ou	
   Soro	
   de	
  
An*globulina	
   Humana	
   (AGH)	
   contém	
   an*corpos	
  
an*-­‐an*corpos	
  humanos.	
  	
  
 
•  1945:	
  Coombs,	
  Mourant	
  &	
  Race:	
  
•  Soro	
  AGH	
  reage	
  com	
  todas	
  as	
  globulinas	
  
humanas	
  quando	
  adicionado	
  ao	
  teste!	
  
•  Por	
  isso,	
  devemos	
  lavá-­‐lo*	
  antes	
  da	
  adição	
  do	
  
soro!	
  
•  (*testes	
  em	
  tubo)	
  
•  Vamos	
  ver	
  como	
  isto	
  funciona?	
  
ImunoBase- DiaMed AG 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
+
+
+
+ + + +
++ + + +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ + + +
++ + + +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ _
+
+ + _
++ _
+ +
+ + _
+
+
+
_
+
+
_
+
+
+_
+
+
+_
+ +
+ +
++ +
+
+_
_
_
_+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
_
_+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+ +
++
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
+
_
_
_
_
_
_ _ _
_
_
_
_
_
_
_
_
__
_ _
_
_
_
_
_
Sensibilização 
Acs não aglutinantes 
Observe: 
Acs livres 
ImunoBase- DiaMed AG 
+
+
+ +
++
+ +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+_
_
_
_+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
_
_+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+ +
+
+
+
+
+
+ +
++
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
+
_
_
_
_
_
_ _ _
_
_
_
_
_
_
_
_
__
_ _
_
_
_
_
_
+ + +
++
+
+
_
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+ _
+
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
 
Adição de soro AGH 
Após lavagem 
- técnica em tubo! 
 
ImunoBase- DiaMed AG 
+
+ + +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+_
_
_
_+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
_
_+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+ +
+
+
+
+
+
+ +
++
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
+
_
_
_
_
_
_ _ _
_
_
_
_
_
_
_
_
__
_ _
_
_
_
_
_
+ + +
++ +
_
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
_+
+
+
+
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
COOH- 
Adição de soro AGH= 
Neutralização de 
cargas elétricas 
As duas porções Fab dos anticorpos 
contidos no soro AGH formam então 
uma ligação entre os anticorpos 
adjacentes, 
produzindo assim o fenômeno da 
aglutinação. 
Teste de AGH 
http://www.transfusionsmedizin.ukw.de/index.php?id=848&type=98 
Técnica em Tubo 
Após a leitura final, se o resultado 
observado for negativo, é obrigatório 
adicionar 50 ul da hemácia Controle 
de AGH. 
Centrifugar 15” a 3.400 rpm. 
O resultado agora deverá ser positivo! 
I II 
Y
C Y
C Y
C II 
II 
I Y
C 
E porque em gel teste não 
é necessário realizar 
lavagens e nem utilizar 
controle de AGH? 
Usar soro AGH monoespecífico 
ou poliespecífico? 
§  POLIESPECÍFICO	
  
§  An*corpos	
   contra	
   Imunoglobulina	
   humana	
   (an*-­‐IgG	
  
+an*-­‐cadeias	
  pesadas)	
  e	
  contra	
  frações	
  C3(C3b+C3d)	
  do	
  
complemento.	
  
 
 
 
 
 
§  MONOESPECÍFICOS	
  	
  
§  An*corpos	
  contra	
  apenas	
  um	
  *po	
  de	
  imunoglobulina	
  
(IgG,	
  IgM,	
  IgA)	
  	
  ou	
  complemento	
  (C3b,	
  C3d	
  ou	
  C4).	
  
§  Únicos	
  ou	
  perfis.	
  
 
 
 
 
Anti-IgG ! 
Perfil 
ü Direto	
  
ü Indireto	
  
ü Algumas	
  feno*pagens	
  de	
  anMgenos	
  eritrocitários	
  
ü Ex:	
  teste	
  de	
  Dfraco	
  em	
  tubo,	
  algumas	
  feno*pagens	
  em	
  tubo	
  ou	
  gel.	
  
ü Prova	
  cruzada	
  
ü Autocontrole	
  
Maior 
Soro 
Hemácias 
Paciente Doador 
Crédito da ilustração: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
Crédito da ilustração: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
Hemácias do doador 
Soro do paciente 
Ausência de aglutinação = 
COMPATÍVEL 
Presença de aglutinação = 
INCOMPATÍVEL 
TESTE DA ANTIGLOBULINA 
DIRETA 
(T.A.D.) 
 
Como fazer? 
Y 
Y Y
Y 
Y 
Y
Y 
Auto 
anticorpo 
Y 
Y
Y 
Y 
Y
Y 
TAD POSITIVO 
TAD 
Lavagem de hemácias 
e preparo da 
suspensão 3-5% 
Negativa Positiva 
TAD em Tubo 
Adição do soro AGH 
Fotografias: Curso EAD em Imuno-hematologia laboratorial SENAC SP. 
Controle! 
TAD em Gel Teste 
Sem Lavagem! 
Suspensão de 
hemácias a 1% 
Centrifugar 
TAD 
1 2 3 4 5 6 
Crédito: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
TAD em Gel Teste 
TAD 
1 2 3 4 5 6 
Crédito: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
Teste de AGH 
http://www.youtube.com/watch?v=JWXC8yXe9dE 
Como interpretar o resultado do TAD? 
TAD+, TAD-... 
E agora???? 
 Aplicações	
  laboratoriais:	
  pesquisa	
  a	
  presença	
  de	
  hemácias	
  
sensibilizadas	
   in	
   vivo	
   por	
   an*corpos	
   e/ou	
   frações	
   de	
  
complemento.	
  	
  
ü Estudo	
  da	
  Doença	
  Hemolí*ca	
  Peri-­‐Natal	
  
ü Anemia	
  Hemolí*ca	
  Auto-­‐Imune	
  
ü Hemólise	
  induzida	
  por	
  drogas	
  	
  
ü Reações	
  hemolí*cas	
  imunes	
  pós-­‐transfusionais	
  
•  Não	
  é	
  um	
  teste	
  pré-­‐transfusional	
  obrigatório	
  segundo	
  a	
  
legislação	
  nacional	
  e	
  standards	
  internacionais.	
  
	
  
•  Qual	
  a	
  incidência?	
  
•  7-­‐15%	
  pacientes•  1	
  em	
  cada	
  10.000	
  indivíduos	
  saudáveis	
  
•  ????	
  Doadores	
  
•  Garraty	
  G.	
  The	
  Clinical	
  Significance	
  of	
  a	
  Posi*ve	
  Direct	
  An*globulin	
  Test.	
  Bethesda,	
  Maryland,	
  
EUA:	
  AABB;	
  1999.	
  
Outras	
  situações	
  onde	
  o	
  TAD	
  é	
  recomendado:	
  
	
  
ü Controle	
  Rh	
  posi*vo	
  na	
  feno*pagem	
  Rh(D)	
  
ü Incompa*bilidade	
   inexplicada	
   numa	
   prova	
   cruzada	
  
(fazer	
  da	
  bolsa)	
  
ü Feno*pagem	
  com	
  resultados	
  não	
  coerentes	
  (ctl+)	
  
ü Resultados	
  de	
  PAI	
  posi*vos	
  
TAD 
NEGATIVO 
Eluição- Opcional 
Acs baixo título 
Importância Clínica?? 
POSITIVO 
Pesquisa c/ 
soros 
Monoespecíficos 
IgG: 
Eluição 
Subclasses 
Titulação 
Identificação 
do Ac 
Fase AGH 
Tratar células 
para fenotipagem 
TAD perfil monoespecífico 
Crédito foto: Daniella Tenius-RJ 
ü  Avaliação	
  do	
  significado	
  clínico	
  
ü  Diagnós*co	
  
ü  Prognós*co	
  
ü  Traçar	
  algoritmo	
  laboratorial	
  
Eluição 
Identificar os anticorpos 
no painel de Hemácias 
Trauma Térmico ou 
Químico 
Eluato 
PESQUISA DE ANTICORPOS 
IRREGULARES 
(P.A.I.) Y 
YY 
Aloanticorpo? 
YY 
Y 
Y 
YY 
Y 
Y Y 
PAI POSITIVO 
TAI 
Pesquisa de Anticorpos Irregulares 
Y
YY 
Y
YY 
Y
YY 
D 
Jka 
C e
Y
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
e C 
Jka 
Fya 
Fyb 
K 
k 
LeY 
b 
Leb 
D 
Jkb 
c e
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E c 
Jkb 
Fya 
Fya 
k 
k 
Leb 
+ 
Y
YY 
Y 
Crédito da ilustração: Dr. Claudio Brandão (Hospital Aliança-BA) 
PAI em tubo 
1ª leitura/TA 
Incubar 15’ a 37ºC Lavar 3X 
Potencializador 
Fotografias: Curso EAD em Imuno-hematologia laboratorial SENAC SP. 
Controle! 
PAI em Gel Teste 
PAI 
I II I II I II 
PAI PAI 
1 2 3 
PAI 
I II I II I II 
PAI PAI 
1 2 3 
Crédito: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
Incubar 15’ a 37ºC Centrifugar 
PAI em Gel Teste 
Crédito: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
PAI 
I II I II I II 
PAI PAI 
1 2 3 
PAI em Gel Teste 
Crédito: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
P.A.I.:	
  Verificar	
  a	
  presença	
  de	
  an*corpos	
  direcionados	
  a	
  
anMgenos	
  de	
  grupos	
  sanguíneos	
  em:	
  
	
  
ü Pacientes	
  que	
  necessitam	
  de	
  transfusão	
  
ü Mulheres	
  grávidas	
  
ü Pacientes	
  com	
  suspeita	
  de	
  reação	
  transfusional	
  
ü Doadores	
  de	
  sangue	
  
Teste de AGH 
http://www.youtube.com/watch?v=JWXC8yXe9dE 
	
  
Considerando	
  que	
  a	
  pai	
  dê	
  posi*va,	
  
qual	
  seria	
  o	
  seu	
  próximo	
  passo?	
  
 
P.A.I. 
POSITIVO 
▼ 
Painel de hemácias 
 
Resultado Nítido 
Fazer contra-prova 
Fenotipagem 
Ag 
correspondente 
Todas as Reaçães 
 POSITIVAS 
Auto-controle 
NEGATIVO 
Mistura de 
Anticorpos 
Ac contra 
AG público 
Auto-controle 
POSITIVO 
Auto-AC 
??? 
Falha Técnica 
Algoritmo em PAI positivo 
Identificação de Anticorpos Irregulares 
(I.A.I.) 
Painel de Hemácias 
 
Crédito: Karina Cruz, Bio-Rad Laboratórios Brasil. 
Identificação de Anticorpos Irregulares 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
Amostra 
Soro 
- Não se esqueça do Autocontrole! 
Mas este assunto será detalhado em 
outra aula!