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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS 
MICROBIOLOGIA MÉDICA 
 
 
 
 
 
 
Prof. Jorgino Julio 
 
 
 
 
 
 
 
NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
1.É obrigatório o uso de avental 
2. Desinfetar com álcool (70%) ou álcool iodado o local de trabalho, antes do 
início de cada sessão de exercícios práticos, assim como no término das 
manipulações. 
3. Não fumar, nem levar à boca nenhum material, para evitar a 
contaminação do operador. 
4. Manter próximo do local de trabalho um desinfetante ( como exemplo 
fenol 5 - 10%, álcool iodado). 
5. Cuidado ao acender o bico de gás ( bico de Busen), verificar se não existe 
substâncias inflamáveis por perto. 
6. Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 
7. Em caso de acidente, comunicar imediatamente o professor. 
8. Colocar todo o material contaminado em recipiente apropriado, 
autoclavar a 121°C por 15 ou 20 minutos, para posterior lavagem. 
9. Seguir as normas de uso dos equipamentos. 
10. Ao final dos trabalhos práticos, efetuar cuidadosamente a anti-sepsia 
das mãos (álcool 70%) e após lavar as mãos com água e sabão. 
( Obs. trazer para as aulas práticas: fósforos ou isqueiro e pincel p1 
escrever em vidros) 
 
 
 
 
 
 
 
1° AULA PRÁTICA - LAVAGEM E PREPARO DE VIDRARIAS - 
ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO. 
 
INTRODUÇÃO 
A lavagem e esterilização de vidrarias são atividades de fundamental importância na rotina 
microbiológica. Sabe-se que alguns detergentes tem influência no crescimento de 
microrganismos e, no caso de não serem totalmente removidos do material, poderão 
comprometer as análises à serem executadas. Os resíduos dos meios de culturas e 
metabólitos que não forem convenientemente eliminados da vidraria também irão interferir nos 
constituintes das soluções e meios de culturas, e consequentemente, nos resultados. A 
lavagem do material em microbiologia pode ser defmido como a eliminação de resíduos 
orgânicos, proteínas e produtos de metabolização dos componentes do meio de cultura, após o 
seu uso. 
 
LAVAGEM DE LÁMINAS E LAMÍNULAS: 
Ferver as lâminas e lamínulas em uma solução a 5% de dicromato de potássio durante 30 
mm., adicionando a cada 10 mm. um pouco de ácido sulfúrico concentrado. Lavar as em água 
corrente por 12 horas, após em água destilada. Conservar as lâminas e lamínulas em álcool 
95GL. 
DESCONTAMINAÇÃO DE VIDRARIAS 
Antes da lavagem, todo material contaminado é esterilizado em autoclave a 121°C por 
15 mm. 
LAVAGEM MANUAL: 
TUBOS DE ENSAIO - após a descontaminação dos tubos, descartar seus conteúdos. Colocar 
os tubos em recipiente próprio com solução de detergente e escovar os tubos com o auxílio de 
escova própria. Enxaguar os tubos várias vezes com água corrente e após, com água 
destilada. e deixa-los secar. 
PLACAS DE PETRI - após a descontaminação, lavar individualmente cada uma das partes da 
placa, utilizando detergente e uma esponja. Lavar várias vezes com água corrente e após, com 
água destilada, e deixa-las secar. 
PIPETAS - após a descontaminação, tomando o cuidado de não quebrar o bocal, retirar o 
tampão de algodão. Colocar as pipetas em recipiente próprio contendo solução de detergente 
por algumas horas ( autoclavar caso tenha resíduo). Enxaguar em água corrente e água 
destilada, deixar secar. 
SECAGEM - Deixar escorrer toda a água e colocar a vidraria em geral em posição emborcado 
na estufa de secagem a 80°C por um período de 1 hor a. 
ACONDICiONAMENTO - Todo material utilizado no trabalho microbiológico deve ser não só 
perfeitamente limpo, mas também estéril. A vidraria após cuidadosa lavagem e secagem, é 
acondicionada com papel tipo krafi e esterilizada em autoclave por 20 mm. ou no forno de 
Pasteur a 170°C por 2 horas. A boca de toda a vidra ria como tubos. garrafas, e balões é 
fechada com tampões de algodão hidrófobo. As garrafas. 
Erlenmeyers, balões, dentre outros, além da bucha de algodão, levam também um envólucro de 
papel, o qual é amarrado com barbante. O s tubos de ensaio depois de fechados com algodão, 
são em número variáveis, empacotados em papel. As placas de Petri são totalmente envoltas em 
papel em número de 2,3, 5, etc. Para o acondicionamento individual de pipetas, são observadas 
os seguintes critérios: a extremidade destinada a aspiração, é provida de pequena bucha de 
algodão, sendo então totalmente envoltas em papel 
 
ROTEIRO DA PRÁTICA 
Acondicionar as vidrarias abaixo relacionada, para posterior esterelização: 
tubos de ensaio 
pipetas de 1 ml, 2 ml, 5m1 e 10 ml 
placas de petri 
Esterilização em autoclave e forno de Pasteur 
 
 
 
2° PRÁTICA - UBIQUIDADE DOS MICRORGANISMOS 
 
INTRODUÇÃO 
Não há parte da biosfera onde os microrganismos não sejam encontrados. Na grande maioria 
dos casos, fazem parte do ecossitema, onde exercem profunda influência no equilíbrio 
biológico, e, consequentemente, na preservação da natureza — nestes casos são chamados de 
autóctones ou nativos. No solo (em qualquer parte do globo terrestre), nas águas, na superficie 
interna do organismo animal (pele, boca, estômago, intestino), na superficie externa de vegetais, 
e, em certos casos, no interior de seus tecidos, os microrganismos estão presentes permanentes 
ou transitoriamente. 
São encontrados também na atmosfera, embora sem qualquer atividade, pois, para que possam 
se manter em atividade, é necessário que estejam em contato com o substrato de onde retiram os 
nutrientes de que necessitam. No entanto, a demonstração da existência de microrganismos na 
atmosfera é de grande importância e de aplicação em diferentes campos (medicina, indústria, 
agricultura etc). Quanto mais movimentado e populoso é o ambiente, mais rico em 
microrganismos que podem ser disseminados pela movimentação do ar e pelas correntes aéreas. 
 
MATERIAL 
Placas de petri contendo Ágar Simples e Ágar Sabouraud estéreis 
 
EXECUÇÃO 
1- Identificar as placas de Ágar Simples e Ágar Sabouraud em relação ao tempo de exposição ao 
ar 
2- Abrir as placas deixando-as expostas ao ar atmosférico por 5 a 15 minutos. 
3- Fechar as placas incubando as de Agar Sabouraud à temperatura ambiente por 1 semana, e as 
de Agar Simples por 24 - 48 horas à temperatura de 37°C 
 
 
RESULTADOS 
1- Anotar o número de colônias nas diferente placas. 
Placa Número de Colônias Filamentosa Cremosa 
Mucóide Outras 
Agar Simples 
Exposição por 5’ 
Exposição por 10’ 
 
Agar Saboraud 
Exposição por 5’ 
Exposição por 10’ 
 
2- Descrever as colônias diferentes quanto ao tamanho, aspecto, superfície, bordas e pigmento. 
 
COMENTÁRIOS 
 
O ar contém matéria particulada, pó e goticulas que podem estar carregados com 
microrganismos. O número e o tipo de microrganismos contaminados do ar são determinados 
pelas fontes de contaminação existentes no ambiente. 
Os microrganismos veiculados pelo ar constituem, na atualidade, um grande risco em termos de 
contaminação (colonização e infecção) da pele e mucosas do homem. Eles tem papel de 
destaque nas infecções hospitalares endêmicas. 
 
 
3º PRÁTICA -- RESISTÊNCIA AO CALOR: células vegetativas e esporuladas 
 
INTRODUÇÃO 
 
Algumas bactérias tem a capacidade de produzir um corpo oval de parede espessa (um por 
célula), que é uma célula altamente resistente. Estas formas resistentes são chamadas 
endosporos ou, mais comumente, esporos. Todos os microrganismos do dos gêneros Bacilius e 
Clostridium são caracterizados, em parte, pela produção de endosporos. 
As bactérias capazes de esporular podem crescer e multiplicar-se por muitas gerações como 
células vegetativas. Em alguma etapa no desenvolvimento da cultura em ambiente nutritivo 
adequado ocorre, porém, no interior do citoplasma, a síntese de um novo protoplasma destinado 
a se tornar o esporo.MATERIAL 
Frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 1 OOml de água destilada esterilizada. 
Meios de cultura: 10 ml de caldo nutriente em tubos de ensaio e ágar-nutriente 
distribuído em placas de Petri 
Pipetas esterilizadas de 1 ml 
Solo de jardim 
PROCEDIMENTO 
Em 4 (quatro) frascos de 250 ml Erlenmeyer, com 100 ml de água destilada esterilizada, 
acrescentar 5 gramas de solo previamente iimpo, sem detritos. 
Agitar. 
Deixar 1 frasco Erlenmeyer em banho de água fervente por 3 mm. 
Deixar 1 frasco Erlenmeyer em banho de água fervente por 5 mm. 
Deixar 1 frasco Erlemneyer em banho de água fervente por 10 mm 
Deixar 1 frasco Erlenmeyer sem tratamento térmico. 
Inocular 1 ml de cada Erlenmeyer em caldo nutriente e ágar-nutriente. 
Incubar à temperatura ambiente. 
 
RESULTADOS 
 
DISCUSSÃO 
 
CONCLUSÃO 
 
 
4º PRÁTICA - MORFOLOGIA BACTERIANA - Método de coloração de Gram 
INTRODUÇÃO 
 
A morfologia da bactéria é uma característica fundamental e inicial para a sua identificação. 
Além das formas findamentais: esféricas, em bastão e em espiral, são também de particular 
interesse a dimensão e o modo de agrupamento das células. Entre os vários métodos de 
coloração bacteriana, o método de Gram é mais empregado na rotina bacterioscópica, pois 
permite observar a forma, o tipo de agrupamento, além de prestar informações a respeito do 
comportamento do material celular frente aos corantes básicos, com a vantagem de fácil 
execução. 
 
MATERIAL 
1- Bateria de Gram; 
2- Lâminas de microscopia; 
3- Alça de platina; 
4- Tubo com soro fisiológico; 
5- Pote estéril; 
6- Placas da aula anterior (ubiquidade) 
 
EXECUÇÃO 
- Culturas de Escherichia coli, Streptococcus e Staphylococcus crescidas em caldo 
nutriente 
Exame de saliva - Colher saliva em pote estéril; 
11 Preparo do esfregaço 
Marcar a lâmina, delimitando a área do esfregaço; 
 
Fazer o esfregaço com alça de platina flambada e resfriada, retirar pequena porção de cada 
amostra, colocá-la sobre a lâmina, distribuí-la em movimentos circulares afim de se obter uma 
camada delgada bem dispersa na área delimitada; 
Secá-la próximo à chama do bico de Bunsen; 
Fixá-la passando a lâmina na chama (3 vezes); 
 
2- EXAME DAS PLACAS DE UBIQUIDADE — Preparo do esfregaço 
2.1- Observar e anotar os diferentes tipos de colônias desenvolvidas no meio de cultura e suas 
características; 
2.2- Marcar uma lâmina em três setores; 
2.3- Fazer o esfregaço com alça de platina flambada e resfriada, colocar pequena porção (uma 
gota) de soro fisiológico em cada setor. Escolher uma colônia e tocá-la com a alça. O material 
removido será distribuído e misturado ao soro fisiológico em movimentos circulares, afim de se 
obter uma camada bem dispersa na área delimitada; 
2.4- Secá-lo próximo à chama do bico de Bunsen; 
2.5- Fixá-lo passando a lâmina na chama (3 vezes) 
 
3- MÉTODO DE GRAM (modificado por Kopelov e Beerman) 
3.1- Colocar a lâmina com esfregaço seco e fixado, voltado para cima, sobre suporte da cuba de 
coloração; 
3.2- Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta, acrescido de três gotas de solução de 
bicarbonato de sódio e deixar atuar por 1 minuto; 
3.3- Lavar o esfregaço com água corrente, cobri-lo com lugol e deixar atuar por 
1 minuto; 
3.4- Lavar o esfregaço com água, descorá-lo rapidamente com solução de éter- acetona (5 a 10 
segundos); 
3.5- Lavar o esfregaço com água, cobrí-lo com solução de safranina e deixar atuar por 10 
segundos; 
3.6- Lavar o esfregaço com água e secá-lo próximo á chama do bico de Bunsen; 
3.7- Pingar uma gota de óleo de imersão na região do esfregaço e observar ao microscópio 
usando a objetiva de imersão (1 OOx). 
 
LEITURA E INTRPRETAÇÃO 
 
1- Observar cada esfregaço isoladamente 
2- Diferenciar: 
Células Gram positivas — coradas em roxo ou violáceo; 
Células Gram negativas- coradas em róseo ou vermelho; 
3- Caracterizar os tipos e agrupamentos de bactérias Gram-positivas (cocos. diplococos, 
sarcinas, estafilococos, estreptococos e bacilos) e Gram-negativas (cocos, diplococos, bacilos, 
espirilos e vibriões) 
 
RESULTADOS 
Desenhar os tipos de células ( E. coli, Streptococcus, Staphylococcus) e agrupamentos 
presentes na saliva e nas colônias das placas de ubiquidade. Comparar a diferença dos tipos de 
microrganismos presentes no ar e na saliva do homem. 
 
 
COMENTÁRIOS 
 
A primeira caracterização que se deve obter de uma célula bacteriana é a forma que possui e seu 
comprtamento frente ao Oram. Sendo uma informação primordial, é necessário que o método de 
coloração seja bem executado, com agentes testados e de boa qualidade e a metodologia seguida 
à risca, afim de que os resuldados encontrados sejam exclusivos e fidedignos. 
A coloração deve ser feita com células jovens obtidas no “habitat natural” ou cultivadas em 
meios de cultura, observando-se sistematicamente, o tempo de atuação de cada reagente, como 
condição essencial ao mérito e finalidade da técnica. Células Oram- positivas, em cultura velha, 
podem apresentar-se como Gram-negativas, devido à perda de certas particularidades fisico-
químicas, que determinam seu comportamento anormal, sendo, por isso seu uso 
desaconselhado. Uma descoloração muito rápida ou intensa, pode alterar também a informação. 
A adição do bicarbonato de sódio ou oxalato de amônio e descoloração pela mistura éter-
acetona são modificações do método original que visam corrigir o fenômeno da gramiabilidade, 
ou seja, uma célula normalmente Oram-positiva se comportar como Oram-negativa. 
As bactérias Oram-positivas, devido à sua constituição química estrutural, principalmente da 
parede, retêm o complexo iodo-pararosalina, não se descorando pela ação solvente (acetona-
éter), permanecendo roxas. As bactérias Oram-negativas não retêm o complexos quando 
submetidas à ação do solvente orgânico, sendo descoradas e novamente coradas pelo corante de 
fundo (safranina ou fucsina). 
Entre os métodos de coloração, o de Hans Christiam Gram (1884) é o mais usado pelos 
bacteriologistas porque cora a maioria das células bacterianas, dando informações diretas e 
conclusivas. Além disto podemos enumerar, como exemplos, as seguintes aplicações para a 
coloração de Gram: 
- na morfologia bacteriana, estabelecendo os grupos e tipos morfológicos fundamentais; 
2- na taxonomia, dividindo as bactérias em dois grandes grupos: Gram-positivas e Oram-
negativas; 
3- no diagnóstico bacteriológico, qualificando os tipos de microbiota normal ou patogênica de 
diferentes áreas ou espécimes biológicos. Na elucidação de determinados aspectos clínicos, é 
indispensável para esclarecimento inicial de: 
uretrite, vaginite, angina, cancro-mole, meningite, etc. 
 
 
 
6° PRÁTICA- CONTROLE DE POPULAÇÃO MICROBIANA 
 
INTRODUÇÃO 
 
A microbiota das mãos apresenta uma população de microrganismos representada por iiferentes 
gêneros e pos uma diversificação muito grande de indivíduo para indivíduo e, em um mesmo 
indivíuo, de um momento a outro. Os folículos pilosos da pele são clcnizndos por bactérias não 
virulentas que impedem a implantação de microrganismos parogénicos constituindo a 
“microbiota residente”. 
Na superficie da pele depositam-se microrganismos das mais variadas fontes, mas que não 
colonizam a região e são de fáci remoção. E a chamada “microbiota transitória”. 
 
 
 
Segundo a atividade profissional do indivíduo — médico, enfermeiro, dentista, auxiliar de 
enfermagem, manipulador de alimentos — os microrganismos presentes na rnicrobiol.a de suas 
mãos representam elevado risco pra outros indivíduos porque as mãos podem agir como um 
veículo de transmissão de microrganismos patogênicos. 
Muitos surtos de intoxicação alimentar, de infecções intestinais, de infecções hospitalares e a 
elevadaincidência de contaminação de feridas cinrgicas podem ser evitados com o simples ato 
de lavar as mãos antes de preparar os alimentos e antes da mainipulação do paciente. 
No hospital, a lavagem das maõs deve ser um procedimento dos mais importantes entre as 
medidas que se destinam ao controle de infecções hospitalares. Isto deve ser exigido de todos 
aqueles que manipulam doentes, inclusive o médico. A lavagem das mãos com água e sabão ou 
água e detergente remove a “microbióta transitória”, mas a “microbiota residente” persiste, 
havendo necessidade do emprego de antissépticos e o uso de luvas estéreis, quando o paciente 
está exposto a alto risco de infecção (cirurgia, angiografia, biópsia hepática, etc.) 
Para a antissepsia das mãos existe uma série de produtos comerciais cabendo ao usuário uma 
escolha de critérios fundamentados em trabalhos científicos, que apontam as vantagens e 
desvantagens de cada um dos produtos. 
 
MATERIAL 
1- Vidro de álcool iodado 
2- Vidro de antisséptico comercial 
3- Escova para esfregar as mãos 
4- Barra de sabão de coco 
5- Placa de Ágar Simples 
6- Toalhas de papel estéreis 
 
EXECUÇÃO 
 
1- Tomar uma placa de Ágar Simples e, com uma caneta de retro projetor, dividir a parte 
externa no fundo em 3 setores, marcando 1, II, e III. 
2- Sem lavar as mãos, abrir a placa, próximo à chama do bico de Bunsen e tocar diretamente o 
dedo indicador no setor 1. Fechar a placa. 
3- Lavar e escovar as mãos com água e sabão neutro. Enxugar as mãos com toalha estéril. 
Repetir o ítem 2, colocando o dedo indicador no setor II. 
4- Passar nas mãos álcool iodado ou um antisséptico comercial. Enxugar em toalha estéril. 
Repetir o item 2 colocando o dedo indicador no setor III. 
5- Incubar a placa a 370 por 24horas. 
 
LEITURA E iNTERPRETAÇÃO 
 
1- Retirar as placas de Ágar Simples da estufa. 
2- Observar o crescimento bacteriano nas diferentes áreas da placa caracterizando os tipos 
morfológicos das colônias e o seu número em cada um dos setores marcados. 
O crescimento na área 1 qualifica, principalmente, a microbiota transitória ou 
flutuante. O crescimento na área II qualifica a niicrobiota residente ou permanente. 
O crescimento na área III qualifica a microbiota resistente ao antisséptico usado. 
 
 
 
RESULTADO 
 
1- Anotar no quadro abaixo os resultados obtidos 
Procedimento (setor) N° total de colônias 
N° de tipos 
morfológicos diferentes 
de colônias 
Mãos antes da lavagem (I) 
 
Mãos após lavagem (II) 
 
Mãos após antissepsia (III) 
 
2- Verificar a eficiência da ação do álcool iodado e do antisséptico comercial usado 
 N° de colônias 
Aluno 
1. Antisséptico comercial Álcool iodado 
2. 
 
3. 
 
 
COMENTÁRIOS 
O controle artificial da população microbiana por agentes químicos e fisicos propicia a obtenção 
de condições assépticas e de esterilidade em ambientes e materiais de uso hospitalar. O controle 
da população microbiana no nível da pele e mucosas é um problema constante. 
A pesquisa da microbiota das mãos deve ser feita periodicamente em enfermeiras e médicos que 
cuidam de pacientes queimados, com feridas cirúrgicas e de recém- nascidos. Não raro estes 
profissionais têm na microbiota residente de suas mãos bactérias patogênicas como 
Pseudomonas e Staphylococcus aureus, o que apresenta um grande risco de contaminação 
externa para os pacientes. 
Outro cuidado que se deve ter é em relação aos antissépticos pra a assepsia das mãos, 
verificando, antes do seu uso rotineiro, se os componentes de sua fórmula são germicidas nas 
concentrações indicadas e se no preparo das soluções são seguidas as especificações do 
fabricante, não deixando de se observar o tempo de validade das soluções em uso. Muitos 
produtos já lançados no mercado mostraram-se menos eficientes do que o sabão neutro. 
 
 
 
 
 
7° PRÁTICA - TÉCNICAS DE CULTIVO: ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO 
DE COCOS GRAM-POSITIVOS 
 
INTRODUÇÃO 
O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcaceae. São cocos Gram-positivos 
agrupados em cacho, imóveis, aeróbios, não capsulados. 
Os estafilococos são tradicionalmente divididos naqueles que são coagulase-positivos (são 
capazes de coagular o plasma humano ou de coelho) e aqueles que são coagulasenegativos. As 
amostras humanas coagulase-positivas são classificadas e conhecidas como Staphylococcus 
aureus, existindo subgrupos da espécie baseados na susceptibilidade a vários bacteriófagos. 
A fagotipagem não é um procedimento de rotina em diagnóstico de labortório, mas é muito 
importante em investigações epidemiológicas. A identificação dos estafilococos coagulase-
negativos, em latoratório, está limitada, geralmente, a duas espécies: 
Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus. 
A experiência a ser executada tem como objetivos: 
 a) estabelecer portadores nasais destes microrganismos entre estudantes; 
 b) identificar e caracterizar o gênero e espécie; 
 c) qualificar a microbiota nasal. 
 
MATERIAL 
1- “Swabs” estéreis 
2- Placas de Ágar Hipertônico Manita 
3- Tubos contendo plasma dç coelho diluído 1:10 
4- -Placas de Agar Dnase -- - 
5- Tubos contendo Caldo Tioglicolato 
6- Tubo com soro fisiológico - 
7- Frasco com solução de HC1 1N 
8- Lâminas de microscopia 
9- Bateria de Gram 
 
EXECUÇÂO 
ETAPA 1 
1- Coletar secreção da mucosa nasal de ambas as narinas com o “swab” e semeá-la em Caldo 
Tioglicolato, incorporando na área aeróbia do meio de cultura. Identificar o tubo e incubá-lo a 
37° C por 24 horas. 
 
ETAPA 2 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DA ETAPA 1 
1- Retirar o tubo com Caldo Tioglicolato da estufa; 
2- Observar se houve crescimento no Tioglicolato, indicado pela turvação do meio ou presença 
de grumos na camada aeróbia (camada superior do meio de cultura); 
2.1- A partir do Tioglicolato, e com auxílio da alça de platina, semear na superficie da placa de 
Agar Hipertônico Manita. Identificar a placa e incubá-la por 24a48hs; 
2.2- Preparar um esfregaço fmo a partir do Tioglicolato e corar pelo Gram. 
 
RESULTADO 
Descrever o crescimento bacteriano observado no Caldo Tioglicolato: 
 a) terço superior do meio; 
 
 b) terço médio do meio; 
 c) terço inferior do meio. 
Após a obervação microscópica, anotar as várias formas bacterianas, tipos de grupamentos e 
reações tintoriais. 
 
ETAPA 3 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DA ETAPA 2 
1- Retirar a placa de Ágar Hipertônico Manita da estufa; 
2- Observar se houve crescimento, indicado pela presença de colônias na superficie do ágar; 
colônias pequenas ou grandes, brilhantes ou opacas, convexas ou planas, bordas regulares ou 
irregulares; 
3- Diferenciar as colônias quanto a pigmentação: cor branca ou amarela; 
4- Observar se houve modificação da cor do meio de cultura, de rósea para amarela, devido a 
viragem do indicador de pH (Vermelho de Fenol), resultante da fermentação do manitol. 
Quando não há utilização do manitol, o meio permanece inalterado (manitol negativo). 
4. 1 - Caracterização morfológica: o simples crescimento em meio seletivo indicador não permite 
tirar qualquer conclusão quanto à morfologia bacteriana, havendo necessidade imediata de se 
comprovar a forma bacteriana do microrganismo, bem como o tipo de grupamento das células 
(cocos dispostos em cacho de uva). Isto é, feito através da coloração de Gram. 
4.1.1- Dividir a lâmina em 2 áreas. Colocar uma alça de soro fisiológico na 1 ° área, e fazer um 
esfregaço fino a partir da colônia que virou a cor do meio para amarelo. Na 2° área, colocar 
também uma alça de soro e fazer um esfregaço fino a partir da colônia que não virou a cor do 
meio. Corar pelo método de Gram. 
 
RESULTADO 
Após a observação microscópica, anotara forma bacteriana, tipo de agrupamento e reação 
tintorial de uma colônia manitol positiva e de uma colônia manitol negativa. 
 
EXECUÇÃO 
1- Caracterização fisiológica (provas de patogenicidade) 
Comprovada a morfologia característica do gênero Staphylococcus, são determinadas as 
características fisiológicas inerentes ao grupo através das provas de patogenicidade, que 
determinam a participação do microrganismo na etiologia e patologia das doenças humanas. 
1.1 - Prova de coagulase: 
Havendo colônias manitol positvas, ou seja, que alteram a cor do meio para amarelo, transferir 
algumas delas (5) pra um tubo contendo plasma de coelho diluído 1:10, fazendo uma suspensão 
homogênea. Incubar a 37° C por 3 horas. A leitura feita com mais de 3 horas de incubação, pode 
dar resultado falso- negativo. Para evitar tal causa de erro, os tubos, após este período, serão 
mantidos a 4° C. 
1.2- Prova de Dnase: 
Sernear, com alça de platina, em movimentos circulares, três colônias manitol positivas na 
superficie de uma placa de Agar Dnase. Identificá-la e incubá-la a 37° C por 24 horas. 
2- Fazer um repique de uma colônia manitol positiva pra Caldo Simples para procedermos ao 
antibiograma (prática 7) 
 
 
 
 
 
 
 
ETAPA 4 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DA ETAPA 3 
1- Retirar o tubo de plasma de coelho da geladeira e a placa de Ágar DNase da estufa; 
2- Prova d Coagulase; a prova se caracteriza pela formação de um coágulo firme. Em 
caso negativo, o plasma continua líquido. 
3- Prova de DNase: cobrir a superficie do meio com uma solução de HC1 1N. A prova 
positiva se caracteriza pela formação de um halo claro transparente em tomo do 
crescimento bacteriano, e turvação do restante do meio pela degradação do DNA pelo 
HC1 (hidrólise ácida). Na prova negativa, a turvação será observada também em redor 
do crescimento bacteriano, devido à presença de DNA íntegro, uma vez que não houve 
produção de DNase pelos microrganismos. 
 
RESULTADOS 
Comparar e diferenciar as espécies de estafilococos isolados de acordo com o quadro 
que se segue 
Staphylococcus Manitol Coagulase DNase 
S. aureus positivo positivo positivo 
S. epidermidis positivo negativo negativo 
S. saprophyticus variável negativo negativo 
COMENTÁRIOS 
 
Os estafilococos são membors da microbiota normal da pele e mucosa humana, 
podendo ser encontrados nas narinas anteriores de praticamente todas as crianças e, 
aproximadamente, em 50% dos adultos. O Staphylococcus aureus está frequentemente 
envolvido em infecções supurativas da pele e mucosa e feridas pós-operatórias. E 
também responsável por um tipo de intoxicação alimentar, e está ocasionalmente 
envolvido em septicemia, meningite, endocardite, osteomielite e outras infecções. O 
Staphylococcus epidermidis é um importante agente da endocardite, e está envolvido em 
infecções genito-urinárias e em infecções como agente secundário. O Staphylococcus 
saprophyticus está relacionado com infecções do trato urinário. E importante salientar 
que, além da capacidade de fermentar o manitol, produzir enzimas como a coagulase e 
DNase, as espécies de Staphylococcus podem ser diferenciadas pela sua sensibilidade 
ou resistência à novobiocina (5ug). 
 
8º PRÁTICA -- CONTROLE DE POPULAÇÃO MICROBIANA 
INTRODUÇÃO 
A necessidade de se controlar a população microbiana levou à crjação da antibiose. 
através de agentes fisicos, químicos e biológicos, visando à diminuição ou eliminação 
das possilidades de sobrevivência dos microrganismos, em consequência do tratamento 
de ambientes inanimados (desinfecção e esterilização) e seres vivos (antibióticos 
comercializados). 
A antibiose biológica, através do antibiograma, estabelece “in vitro” o perfil de 
susceptibilidade dos microrganismos frente aos diferentes antibióticos de uso comercial. 
O resultado expressa uma indicação para se conseguir a terapêutica tracional em 
diferentes processos patológicos causados por microrganismos, bem como o controle ou 
eliminação da microbiota presente não só na pele, como nas cavidades naturais (estado de 
portador são), fontes bastante comuns de contaminação externa. 
A experiência tem como objetivos; 
 a) determinar o perfil de susceptibilidade de cocos Oram-positivos (S(aphylococcus) a 
diferentes antibióticos em meio sólido. 
 b) Detectar a presença de mutantes naturalmente resistentes à ação dos antibióticos. 
 
MATERIAL 
1- Cultura de Staphylococcus em Caldo Simples, previamente incubadas a 37°C por 2 horas; 
2- Placas de Mueiler-Hinton estéreis; 
3- “Swabs” estéreis: 
4- Discos de antibióticos; 
5- Pinças 
 
EXECUÇÃO 
1- Marcar, no fundo da placa de Muelier-Hinton, o local onde serão colocados os discos de 
antibióticos de forma a ficarem 1cm da borda e equidistantes 2 cm aproximadamente; 
2- Com os devidos cuidados técnicos, embeber o swab nas culturas de Staphylococcus, 
eliminando o excesso de líquido por compressão nas paredes do tubo; 
3- Espalhar o inóculo uniformemente na superficie de ágar de maneira a cobrir toda superficie 
do meio; 
4- Com a pinça flambada e resfriada, retirar um disco de antibiótico do frasco e, com a placa 
próxima à chama, colocar o disco no local priviamente marcado comprimindo-o ligeiramente 
para que fique aderido à superficie do meio; 
Obs: Entre cada operação de colocar os dicos, ter sempre o cuidado de fechar a placa. 
5- Identificar a placa e incubá-la a 37°C por 18-24 horas. 
 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO 
O antibiótico presente nos discos se difunde no meio de cultura sólido, atingindo concentrações 
decrescentes em tomo do disco. A presença ou ausência de crescimento em trono dos discos é 
interpretada como resistência ou susceptibilidade do microrganismo ao antibiótico. 
A presença de colônias no halo de inibição de crescimento indica presença de mutantes 
resistentes à ação do antibiótico. Esses mutantes existem normalmente na população bacteriana 
e o seu aparecimento não é induzido, mas ocorre devido ao fenômeno de mutação espontânea. 
Ao proceder à leitura dos halos de inibição, estes são medidos por auxílio de uma régua e 
comparados com uma tabela-padrão. Usam-se a letra “S” para organismos suscepríveis, “1” 
para organismos de sensibilidade intermediária e “R” para os orianismos resistentes. A tabela-
padrão expressa a zona de inibição em mm, levando em consideração a carga antibiótica dos 
discos, sua difusibilidade e peso molecular. 
 
 
 
 
 
 
 
RES ULTADOS 
1-- Observar o crescimento bacteriano nas placas de Mueiler-Hinton, principalmente nas áreas ao 
redor dos discos. Fazer a leitura de acordo com a tabela (Anexo 1). 
2- Observar se há crescimento de colônias resistentes aos antibióticos usados. 
 
COMENTÁRIOS 
Entre os métodos usados para a antibiose experimental temos a diluição, a incorporação e a 
difusão, cada um deles com indicações e limitações próprias. A antibiose por discos, através do 
método da difusão em meio sólido, é atualmente a prova mais difundida (método de Kirby-
Bawer), devido à facilidade de execução no que diz respeito ao sistema, material e tempo, 
correspondendo bem às exigências da rotina bacteriológica. 
Na aplicação do método de Kirby-Bawer, feita pela técnica do antibiograma, usam-se critérios 
bacteriológicos precisos para o isolamento, obtenção do inóculo e semeadura dos 
microrganismos, bem como um número variável de discos estabelecidos em função da espécie 
microbiana e da infecção ou doença que provoca. Entre os fatores que podem influenciar os 
resultados de um antibiograma, podemos citar: tipo de meio de cultura, inóculo, conservação 
dos discos de antibiótico, condições de incubação (atmosfera de 02, temperatura e tempo) e a 
presença de mutantes naturalmente resistentes aos antibióticos. 
O antibiograma é indicado, por exemplo, toda vez que se trata deinfecção por Staphylococcus 
e Enterobacteriaceae, uma vez que nestes é comum o aparecimento de resistência múltipla aos 
antibióticos. E também indicação para antibiograma quando a resposta clínica não corresponde 
ao tratamento inicial, baseado na “experiência acumulada”. Nesses casos, o(s) antibiótico(s) 
é(são) suspenso(s) pelo menos por uma semana para então se proceder ao antibiograma. 
 
10º PRÁTICA: TÉCNICAS DE CULTIVO : ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE 
ENTEROBACTÉRIAS 
 
ASSUNTO 1: COPROCULTURA 
 
INTRODUÇÃO 
 
Entre os bastonetes Gram-negativos, as enterobactérias têm sido exaustivamente estudadas, não 
só por serem agentes etiológicos de várias infecções humanas e dc animais, como também pela 
sua importância na saúde pública. 
 
O habitat natural da maioria das enterobactérias é o trato gastro-intestinal de mamíferos, embora 
existam gêneros encontrados mais comumente na natureza, em vida livre (água, solo, plantas), 
do que no sistema digestivo, como por exempolo, Serratia, Enterobacter, e Pseudomonas. O 
gênero Pseudomonas não pertence à família Enterobacteriaceae, pois não fermenta a glicose, 
mas pode ser considerada bactéria intestinal, por ser eventualmente isolada de fezes de 
indivíduos sadios e, muitas vezes, em pessoas com desequilíbrio de rnicrobiota. 
As enterobactérias podem causar diferentes processos infecciosos de menor ou maior ra\idade 
quando localizados em outros sítios do hospedeiro, sendo comuns como agentes de infecções do 
trato urinário e outros sistemas, como respiratório e sistema nervoso central. 
A identificação das enterobactérias está baseada nos caracteres morfológicos, hioquímicos. 
antigênicos, de patogenicidade e também em considerações ecológicas. 
Dos exames bacteriológicos, a coprocultura é um dos mais complexos, pois, embora não 
apresente dificuldades técnicas, é elaborado em várias etapas. Assim, desde a coleta do material 
até o manuseio do espécime, deve-se observar cuidados como o uso de líquido conservador 
(salina tamponada glicerinada) e escolha da amostra adequada: parte mais pastosa, membranosa 
ou sanguínea do material fecal. 
 
ETAPA 1 
 
MATERIAL 
 
Placas de Teague e SS semeadas com enterobactérias 
 
EXECUÇÃO 
 
1- Identificar as colônias lactose positivas e lactose negativas, de acordo com o aspecto que 
apresentam nos meios seletivos indicadores. 
Meio de cultura Colônias Lac+ Colônias Lac- 
Teague pretas incolores 
SS róseas incolores 
2- Escolher uma colônia da placa de Teague ou de SS e semear no meio de triagem (TSI), 
usando alça em agulha para semeadura em profundidade, e alça em anel para inoculação na 
superficie do meio; 
3- Identificar os tubos e incubar a 37°C por 24 horas. 
 
ETAPA 2 
 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO 
- Retirar os tubos de TSI da estufa e interpretar o crescimento bacteriano de acordo com o quadro 
do anexo 1. Anotar, o diagnóstico presuntivo; 
 
2- Fazer repiques do crscimento em TSI para uma série de provas bioquímicas. 
Idenficar e incubar a série bioquímica a 37°C por 24horas. 
 
ETAPA 3 
 
LEITURA E INTERPRETAÇÃO 
 
 1- Retirar a série bioquímica da estufa; 
 2- Interpretar a série bioquímica conforme o quadro do anexo 2; 
 3- Identificar a bactéria segundo quadro do anexo 3. 
RESULTADOS 
Anotar no quadro abaixo a Enterobactéria isolada e idenficada a partir dos meios seletivo- 
indicadores. 
Meio seletivo indicador usado Lactose 
 
 
 
Provas 
 
Gêneros 
TSI Diagnóstico presuntivo: 
 
Série bioquímica Diagnóstico final: 
 
 
COMENTÁRIOS 
Para o diagnóstico de uma infecção bacteriana do trato gastrointestinal temos, a princípio, que 
considerar se houve penetração e colonização de uma bactéria que não pertence à microbiota 
anfibionte ou se, ao contrário, ocorreu desequilíbrio de microbiota por uso prolongado ou 
indevido de quimioterápicos. No primeiro caso, a infecção pode ser sintomática ou 
assintomática, dependendo da resitência do hospedeiro; no segundo, a infecção é caracterizada 
pela predominância anormal de um microrganismo (bactéria ou fungo), resistente ao 
quimioterápico empregado. 
 
O diagnóstico bacteriológico feito através da coprocultura deve ser elaborado visando, 
em nosso meio, o isolamento dos seguintes agentes: Escherichia coli enteropatogênica 
clássica, E. coli invasora, E. coli enterotoxigênica, Salmoneila, Shigella, Yersinia 
enterocolítica e Campylobacterjejuni. A coprocultura pode revelar, às vezes, a presença 
de mais de um dos agentes citados acima, pela possibilidade de ocorrência de infecções 
mistas. Por outro lado, deve-se lembrar que nem sempre as bactérias são agentes de 
infecções intestinais. Muitas destas infecções podem ser causadas por vírus, fungos, 
protozoários ou helmintos. 
 
As seguintes informações em relação ao paciente devem acompanhar o espécime clínico 
enviado ao laboratório: idade (algumas das entero-infecções bacterianas incidem mais 
em crianças), uso prévio ou presente de quimioterápicos, ocorrência de doenças 
concomitantes (esquistosomose, anemia falciforme), alimentos ingeridos nas últimas 72 
horas. O antibiograma deve ser solicitado como complemento à coprocultura. 
 
 
 
 
ANEXO 1. Aspectos do crescimento bacteriano no meio TSI (Triple-Sugar Iron). 
 
Leitura Interpretação Diagnóstico Presuntivo 
Reação ácida (amarela) e 
gás na profundidade. 
Reação ácida na superficie 
(amarela) 
Fermentação de glicose. 
Fermentação de lactose 
e/ou sacarose, com 
produção de gás 
Escherichia, Klebsiella, 
Enterobacter, Providencia 
 
Reação ácida (amarela) e gás na 
profundidade. Superficie 
alcalina (vermelha). Presença 
de H2S (negro) 
Fermentação de glicose com 
produção de gás. Nenhuma 
ação sobre a lactose ou 
sacarose. 
Salmonelia, Arizona, 
Citrobacter, 
Edwardsiella, Proteus 
Reação ácida (amarela) sem 
gás na profundidade. 
Superficie alcalina (vermelha). 
Ausência de H2S. 
Fermentação de glicose 
sem produção de gás. 
Nenhuma ação sobre a 
lactose ou sacarose. 
Shigella, Providencia, 
Escherichia, Salmonelia 
typhi, Proteus, Serratia 
Meio inteiramente ácido 
(amarelo) com gás na 
profundidade. Presença de 
H2S (negro). 
Fermentação de glicose 
com produção de gás. 
Fermentação da lactose 
e/ou sacarose com 
produção de gás. 
Arizona 
 Citrobacter 
Proteus vulgaris 
Meio inteiramente ácido 
(amarelo), sem gás. Ausência 
de H2S. 
Fermentação de glicose 
sem produção de gás. 
Fermentação de lactose 
e/ou sacarose 
Serratia 
Meio sem alteração ou alcalino 
(vermelho). Ausência de H2S Açucares inalterados 
Pseudomonas*, , Herella, 
 Mina, Alcaligenes, 
* Não pertencem à família Enterobacteriacea 
 
 
ANEXO 2. LEITURA DAS PROVAS BIOQUÍMICAS 
Substrato Produto Final 
Reagentes 
Reveladores 
Resultados 
Positivos Resultados 
Nitrato 
 
Nitrito(enzima 
redutase 
Sol.a naflulamina (A) 
Sol. ac. Sulfanílico (B) 
Coloração 
Vermelha 
Coloração 
Amarela 
 
 (Vermelho de fenol) 
Carboidratos Ácido 
(Fermentação) 
Indicador de pH 
ácido 
(fucsina) 
Vermelho Incolor 
Lisina Cadaverina 
(Descarboxilação) 
Vermelho de 
Bromocresol Roxa 
Amarela 
 
Citrato de Sódio Bicarbonatos e 
Carboidratos 
Indicador de pH 
alcal. (Azul de 
Bromotimol) 
Azul Verde sem Crescimento 
Malonato Hidróxido de 
Sódio 
Indicador de pH 
alcal. 
(Azul de 
Bromotimol) 
Azul 
Verde sem 
Crescimento 
SIM Triptofanase Indol 
Triptofanase 
Sol. de Pardimetil 
AminoBenzaldeido 
Anel 
Vermelho Incolor 
 
A leitura da usina é feita com tubo controle que não leva lisina. 
Tubo de lisina roxo e tubo controle amarelo: Resultado Positivo 
Tubo de lisina amarelo e tubocontrole amarelo: Resultado Negativo 
Fenilalanina Ácido Fenilpirúvico 
Sol. Coloração 
férrico 
Coloração 
Verde 
 
Amarela 
Uréia 
Amônia Indicador pH alcal. Vermelho Amarela