aula de PCR resumo TAM 7º período

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PCR – Técnicas de análises moleculares
A técnica da PCR permite que um fragmento específico da molécula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. A partir da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequência que é alvo do estudo. 
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas.
Esta reação permite a amplificação de qualquer sequência de DNA coletada de amostras de materiais biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, células vegetais ou animais mesmo que com milhares de anos, também podem ser detectadas pela PCR.
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.
O "primer" é uma pequena sequência de nucleotídeos que hibridiza no início da sequência alvo que se quer amplificar e da qual ele é complementar, geralmente por volta de 20 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares. Ao reconhecer o "primer," a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na sequência de DNA que será replicada (sintetizada).
Etapas do processo:
Extração do DNA da amostra que se pretende estudar 
Purificação do DNA 
Preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias necessárias à sintese de novas cópias de DNA 
Incubação em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos os ciclos da reação aquecendo e resfriando os tubos 
Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR 
Revelação e fixação do gel
Reagentes da PCR:
Solução tampão para se garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação 
Deoxinucleosídeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam na construção das moléculas de DNA 
Os primers 
A Taq-polimerase 
H2O 
Mg+2 para optimizar a reação (nem sempre é usado) 
O DNA extraído da amostra 
Alguns adjuvantes quando necessário
A reação em si – os ciclos:
Existem três fases básicas ou ciclos para cada reação de PCR. Cada ciclo contém um ou mais passos e duas variáveis em cada passo: a temperatura e a duração.
Etapa de desnaturação inicial: Consiste de um único passo de desnaturação a 94ºC por 5 minutos. Dificilmente altera-se esta etapa.
O bojo da PCR toma local neste ciclo, que é subdividido em três:
1)Etapa de anelamento; este é o passo que habilita os primers a anelar a fita simples desnaturada. O tempo necessário para anelamento é de 30-45 segundos.
2) Etapa de extensão. É neste passo que a Taq polimerase age para estender o molde. Regularmente ela é realizada a temperatura de 72º (a atividade enzimática ótima é de 76 - 79ºC), dificilmente altera-se a temperatura de 72º. Uma regra para se estimar a extensão do tempo é a de que para cada 1000 nucleotídeos atribuímos 1 minuto. Outra fórmula popular é calcular 60 bases por segundo.
3) Etapa de desnaturação: A desnaturação da molécula de DNA formado serve como molde para o próximo ciclo. Ela é realizada a temperatura de 93-94ºC. Nesta temperatura a enzima tem uma meia vida de cerca de 1 hora.
Estes três passos são repetidos 30-40 vezes em particular para análises de digestão. Se os ciclos excederem esta quantidade eles poderão introduzir mutações com a Taq polimerase.
Etapa de extensão final. Isto é feito com um único ciclo em dois passos: um passo de anelamento o qual é idêntico ao passo de anelamento na segunda etapa de PCR (mesmo tempo e mesma temperatura). O segundo é a de extensão longa temperatura idêntica ao passo de extensão, porém com duração de 3-5 minutos ( 72ºC) por 5 minutos. Isto habilita toda amplificação semi-iniciada a se completar.
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está entre eles será copiada.
Este ciclo se repete 25 - 35 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 2 - 4 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões.
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.
Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:
Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, 500 pb.
Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.
Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA.