Aula prática PCR

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FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA – AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR PCR
OBJETIVO
Amplificar DNA genômico a partir da amostra de DNA de Candida albicans, extraída em aula, utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction).
MATERIAL
( DNA
( tampão
( Mg+2
( dNTPs
( um par de primers 
( enzima Taq DNA polimerase
( água ultra pura
( termociclador
( microtubos, ponteiras e micropipetadores.
 
PROTOCOLO 
Para a PCR com volume final de 25(L em um tubo de 0,2 ou 0,5 ml, adicionar:
	DNA
100 ng
	buffer
10X 
	dNTP
10 mM 
	MgCl2
15 mM 
	Primer 1
10 µM
	Primer 2
10 µM
	Taq pol
5U/(L
	H20
(L
	
	
	
	
	
	
	
	
Tampão: 
C1: tampão 10X: (100mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 MgCl2)
C2: tampão 1X: (10mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 MgCl2)
Tris-HCl KCl 
C1v1 = C2V2 C1v1 = C2V2 
100mM. V1 = 10mM. 25 (l 500mM. V1 = 50mM. 25 (l 
V1 = 2,5 (l V1 = 2,5 (l 
 
MgCl2: dNTP: 
C1: 15mM C1: 10mM
C1v1 = C2V2 10.000(M. V1 = 200(M. 25 (l
15mM. V1 = 1,5mM. 25 (l V1 = 0,5 (l 
V1 = 2,5 (l
 
Primers:
C1: 10 µM
10(M. V1 = 1(M. 25(l
V1 = 2,5 (l
Taq pol:
C1: 1U/0,2(l ou 5U/(l 
2U: 0,4 (l
Homogeneizar o mix por pipetagem ou vórtex
Colocar os tubos no termociclador e selecionar o programa desejado
Para estes primers as condições de ciclagem são:
95oC, 5´; (95oC, 1´; 48oC,1´; 72oC, 2´) x 30; 72oC,10 ´
Após o tempo de reação, aplicar 2(L de cada amostra em um gel de agarose 1,0% impregnado com brometo de etídeo.
Fotografar
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA – AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR PCR
Nome: ________________________________________________________________
Responda:
Nomeie e explique passo a passo as etapas do ciclo de uma reação de PCR.
Qual o objetivo desta técnica e em que mecanismo fisiológico molecular ela é baseada?
Como se define a temperatura de anelamento de uma PCR? Justifique exemplificando. 
Faça o desenho esquemático da corrida eletroforética de sua(s) amostra(s) e do padrão de peso molecular.
O ciclo térmico básico da PCR inicia-se a uma certa temperatura, prossegue para outra e finalmente vai para uma terceira, quando então recomeça, por pelo menos 25 vezes. Quais são estas temperaturas (na ordem descrita acima) e o que ocorre nelas?
Se a menor temperatura de um ciclo de PCR for reduzida de 56oC para 45oC, o que provavelmente ocorrerá? Por quê?
Sobre a Taq polimerase, responda: 
Por que esta enzima é utilizada na PCR, em lugar da DNApolimerase de E.coli ?
Qual a taxa de incorporações de nucleotídeos errados por esta enzima? Qual o motivo desta taxa?