IMUNOFLUORESCÊNCIA TRABALHO

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IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Componentes: 
Amauri Lucena; João Luiz Romanholo; João Felix Nicholas Andrade; Tauã Lima; Yasmin Brandão
Profª: Mary Hellen
FLUORESCÊNCIA
DEFINIÇÃO
Definição
Técnica que possibilita a visualização 
Antígenos 
Suspensões celulares 
Antígenos específicos, marcados por fluorocromo; 
Ligação do anticorpo ao fluorocromo; 
Alta sensibilidade e especificidade; 
TÉCNICA DE FLUORESCÊNCIA
Possibilita a visualização
Antígenos
Suspensões celulares
Antígenos específicos, Ligação do anticorpo são marcados por fluorocromo;
Alta sensibilidade e especificidade 
FLUOROCROMOS
DEFINIÇÃO
Tipos de Fluorocromos:
Fluresceína Rodamina
Fluoresceína
Rodamina
Histórico
A descoberta da fluorescência é atribuída a Nicolás Monardes
A descrição da opalescência azul, surgiu a partir de uma infusão de água e de uma madeira de uma pequena árvore mexicana
É uma variação do microscópio de luz ultravioleta
No qual os objetos são iluminados por raios de um determinado comprimento de onda
A imagem observada é o resultado da radiação eletromagnética emitida pelas moléculas que absorvem a excitação primária e reemitem a luz com maior comprimento de onda
Microscópio de Luz Fluorescente
Microscópio de Luz Fluorescente
Conjunto de fibras óticas: 
Filtro de excitação  Seleciona os comprimentos de onda para excitar um corante em particular;
Desviador de feixe dicroico  reflete a luz na banda de excitação e transmite a luz na banda de emissão; iluminação epifluorescência;
 Filtro de emissão  ‘’controle de qualidade’’, deixando apenas passar comprimentos de onda relevantes emitidos pelo fluorocromo 
CONSTITUIÇÃO 
Sistema de suporte
Focagem e amplificação 
Filtro
Condensador 
Diafragma
Usa-se para detectar
Substâncias auto fluorescentes (vitaminas A) e substâncias marcadas com fluorocromos 
Reações de Imunofluorescência
Específica
Reação entre substrato e proteína (Ag – Ac)
Não Específica
Coloração dos tecidos por corante livre ou proteínas fluoresceinadas 
Autofluorescência 
Ocorre fluorescência natural dos tecidos  UV
Tipos de Imunofluorescência
Imunofluorescência direta
Imunofluorescência indireta
Imunofluorescência Direta
Definição: 
 
Técnica de camada simples;
 
Conjugado de AC com fluorocromo;
Procedimento
Fixação do esfregaço da lâmina;
Tratamento com AC marcado;
Incubação; 
Lavagem para remover excesso de ACs marcados não ligados;
Visualização no microscópio fluorescente;
Realização da técnica
Detecção de vírus, parasita, antígeno de tumores;
 Antígenos estarão distribuídos no interior do tecido ou compartimento celular;
Marcadores utilizados: 
 IgG, IgM, IgA, C3 fibrinogênio – conjugados com fluoresceína; 
Vantagens: 
 Alta especificidade e sensibilidade;
 Componentes intracelulares com fluocromos constantes;
Desvantagens:
 Alto custo do microscópio de fluorescência;
 Um conjugado para cada antígeno; 
INDICAÇÕES CLÍNICAS
Aplicação Médica 
 Detecção direta de microrganismos em:
secreções, Urina, Fezes, Cortes de tecidos 
Doenças imunológicas renais e pele
Dermatopatologias
Lesões bolhosas autoimunes;
 Pênfigos Vulgar; 
Dermatoses bolhosas subepidérmicos autoimune; 
 Penfigoide bolhoso, Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES);
 Penfigos Vulgar
Figura 1 
Figura 2
(a) Pênfigo vulgar, com divisão suprabasal, fazendo a camada basal parecer uma “fileira de lápides” (coloração de hematoxilina-eosina; aumento de 200x do original). (b) Pênfigo vulgar, imunofluorescência direta, com fluorescência máxima na camada espinhosa (imunofluorescência direta e aumento de 200x do original).
 Os autoanticorpos IgG são dirigidos contra proteínas desmossômicas; levando à perda da adesão entre as células na parte mais profunda da epiderme, acima da camada de células basais.
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Figura 2 
Figura 3
Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES)
Figura 1
A biópsia de uma lesão bolhosa mostrou clivagem subepidérmica em fase de reepitelização, infiltrado inflamatório neutrofílico agredindo a camada basal (Figura 2). A imunofluorescência direta da pele perilesional revelou depósito linear de IgA, IgM, IgG e C3 na zona da membrana basal (Figura 3).
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Imunofluorescência Indireta
Definição: 
Técnica de dupla camada;
Método:
AG fixados em uma lâmina;
Aplicação de AC primário específico não fluorescente; 
AC conjugado com fluorocromo com especificidade marcada contra determinados AG do AC primário usado para reagir com o antígeno;
Vantagens: 
Sensibilidade e Especificidade
Reprodutibilidade
Simples padronização e reprodução 
Mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
Para determinar as classes e subclasses de AC são utilizados conjugados específicos
Desvantagens: 
Necessidade de microscópio na leitura; 
Não automoção;
Aplicação Médica: 
 Medicina Humana: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como Doença de Chagas, A SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
Medicina Veterinária: Toxoplasmose, Neosporose, Raiva Campilobacteriose Genital Bovina. 
Fontes de pesquisa
Jameson, D. Principles of Fluorescence Techniques. 2009. Recuperado em 2009, Junho 4, de http://www.fluorescence-foundation.org/lectures/chicago2009/lecture1.pdf.
 Newbury, K. Fluorescence Resonance Energy Transfer, 2009. Recuperado em 2009, Junho 30, de http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/fret/index.html
 Rost, F. (1995) Fluorescence microscopy (Volume II). Sidney: Cambridge University Press
Department of Microbiology, JJM Medical College, Davangere. IMMUNOFLUORESCENCE; http://www.microrao.com/micronotes/immunofluorescence.pdf
Dr Gene Mayer; tradução PhD. Hopkins, Myres. Departamento de patologia da UNESP. REAÇÕES ANTIGENO-ANTICORPO E TESTES SELECIONADOS - http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/ed-7-interacoes-antigeno-anticorpo.pdf
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