5. PCR

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PCR 
a reação em cadeia da polimerase
Prof. Emanuella Fajardo
Reação em cadeia
Amplificação do DNA
Síntese de DNA in vitro
• Polimerase Chain Reaction
• Reação em cadeia da Polimerase
• Amplificação in vitro de
moléculas de DNA
• In vivo X In vitro X In silico
• Procedimento análogo à replicação do DNA
• Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP
Etapas da PCR
• Ciclos da PCR
• Separação das fitas → 96°C
• Anelamento dos primers → 60°C
• Síntese do DNA → 37°C
• Problema inicial da técnica
• Durante a etapa de quebra das 
pontes de H e separação das fitas 
(DNA melting) a 96°C, a enzima 
polimerase era desnaturada e 
precisava ser acrescentada ciclo a 
ciclo... 
• Não permitia automação
História da PCR
• Químico, 1966
• Doutor em bioquímica, 1972
• 2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica
• Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de 
padaria por dois anos; voltou à indústria
• 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto 
voltava para a casa à noite ao lado da namorada
• Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano 
para padronizar a técnica
• Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993)
• 1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus
• Permitiu finalmente a automação da técnica
• Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos que
acredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD 
na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica!
Kary Mullis, 1944
Taq polimerase
PCR
Sistema de reação:
DNA molde (100 ng)
Iniciadores (5 mM)
dNTPs
Tampão com MgCL2
Taq polimerase
Protocolo de amplificação:
Desnaturação: 95º C
Anelamento: 45-60º C
Extensão: 72º C
Eletroforese
• Movimento de partículas dispersas 
num fluído sob influência de um 
campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa
• Tem tendência a se dirigir ao polo 
positivo quando sujeito a um campo 
elétrico
• Serve para separar moléculas por 
tamanho/carga elétrica 
• Proteína deve ser desnaturada com 
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em 
trabalhos de biologia molecular
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras
Definição do mapa das 
amostras por canaleta
Corrida do gel
• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de 
íons através da solução 
tampão
• Terminais positivo e negativo
• Tempo adequado, senão o 
DNA sai do gel
Coloração das moléculas
• Brometo de etídio
• Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
• Composto fluorescente à luz UV
• Gel de agarose
• Prata
• Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
• Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
Eletroforese em campo pulsado
Grandes 
fragmentos 
de DNA