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1 IMUNOLOGIA 2009-2010 Introdução (Cap. I) O Sistema Imunitário (SI) foi desenvolvido pelo organismo para proteger o organismo da invasão de microrganismos patogénicos ou cancro. Tem a capacidade de gerar uma variedade enorme de células e moléculas capazes de reconhecimento específico e eliminação de uma variedade de invasores estranhos. Funcionalmente, a resposta imunitária pode ser dividida em: 1. Reconhecimento: consegue reconhecer pequenas diferenças químicas que distinguem um agente patogénico de outro; faz a discriminação entre moléculas estranhas e do próprio organismo. 2. Resposta: uma vez reconhecido o agente estranho, variadas células e moléculas participam na resposta efectora, que elimina ou neutraliza o organismo estranho; quando novamente exposto ao mesmo agente estranho, o SI induz uma resposta memória, que é mais rápida, forte e eficaz que a primeira. Imunidade Específica / Adaptada / Adquirida Não especifica / inata Imunidade Inata Barreiras anatómicas: são a 1ª linha de defesa durante o período crítico, prevenindo a entrada de invasores no organismo. Pele o Epiderme: várias camadas de células epiteliais, sendo a mais externa constituída por células mortas e por uma cama impermeabilizante, a queratina. o Derme: com vasos sanguíneos, glândulas sudoríparas e folículos pilosos. Estes contêm glândulas sebáceas, que produzem sebum. O sebum tem ácidos lácticos e ácidos gordos que mantêm o pH da pele ácido (3-5), inibindo o crescimento de microrganismos. Membranas mucosas: organismos de defesa aguda inata que tentam impedir a entrada de microrganismos nas mucosas: saliva, lágrimas e secreções mucosas. Possuem substâncias anti-bacterianas e anti-virais. No tracto respiratório há cílios. Em células epiteliais superficiais existe a flora comensal, constituída por organismos não patogénicos que competem com os patogénicos por superfícies de aderência e alimento. Barreiras fisiológicas: temperatura + pH + Substâncias solúveis. Lisozimas: enzimas hidrolíticas presentes nas secreções mucosas e nas lágrimas, capazes de clivar o peptidoglicano. Inteferon: grupo proteico produzido por células infectadas por vírus. Liga-se a células vizinhas e despoleta um estado geral anti-vírico. 2 Sistema complemento: grupo de proteínas serosas que circulam em estado inactivo. Quando activas, destroem as membranas dos organismos patogénicos. Barreiras fagocíticas: fagocitose induzida por células especializadas. Monócitos – sangue Neutrófilos – sangue Macrófagos – tecidos As outras células conseguem, na sua maioria, realizar outras formas de endocitose, como a endocitose mediada por receptores ou a pinocitose. Barreiras inflamatórias: 5 sinais cardiais de inflamação – Rubor + Calor + Tumor + Dor + Impotência funcional. Aumento do diâmetro dos vasos sanguíneos (vasodilatação) devido à vasoconstrição na área inflamada – provoca rubor (aumento do fluxo sanguíneo) e calor (proveniente do sangue). Aumento da permeabilidade capilar facilita o influxo de fluido e celulas dos capilares para o tecido lesionado, acumulando-se – Tumor (edema). Movimento dos fagócitos: o Marginação – aderência das células à parede endotelial dos vasos sanguíneos. o Diapedese – emigração das células do endotélio para os tecidos. o Quimiotaxia – migração pelo tecido até ao local lesionado. Células fagocitárias acumulam-se na zona da lesão e iniciam a fagocitose das bactérias. Libertam aí enzimas que danificam também as células vizinhas saudáveis. A acumulação de células mortas, material digerido e fluidos forma o pus. A vasodilatação e o aumento de permeabilidade permite a entrada no tecido de enzimas do sistema de coagulação, que activam uma cascata enzimática, resultando na deposição de filamentos insolúveis de fibrina. Esta parede de fibrina sobre a área infectada previne o alastramento da infecção. A resposta inflamatória é iniciada por uma série de eventos que envolvem mediadores químicos que podem ser derivados de microrganismos invasores, libertados por células danificadas, gerados por sistemas enzimáticos plasmáticos ou ainda produzidos por leucócitos. São exemplos: Proteínas da fase aguda: proteína C reactiva, produzida pelo fígado após danos no tecido hepático. Liga-se ao polissacarídeo C de bactérias e fungos, activando o complemento. Histamina: liga-se a receptores de capilares e vénulas, causando vasodilatação e aumento de permeabilidade. Quininas: presentes no plasma na forma inactiva. Causam também vasodilatação e aumento de permeabilidade. 3 Imunidade adaptada Capaz de reconhecer e eliminar selectivamente moléculas e microrganismos estranhos. São reacções a antigénios (Ag) específicos, que activam 4 atributos característicos: Especificidade antigénica: os anticorpos conseguem distinguir duas moléculas proteicas que diferem em apenas um aminoácido (AAs). Diversidade: reconhece biliões de Ags diferentes. Memória imunológica: um segundo encontro com um mesmo Ag induz um tipo de imunidade reactiva acentuado. Confere uma imunidade duradoura contra inúmeros agentes infecciosos após o encontro inicial. Reconhecimento Self / Nonself: capacidade de distinção entre o que é estranho e o que é próprio do organismo. Células do sistema imune: APCs e Linfócitos. Linfócitos: um dos tipos de leucócitos produzidos na medula óssea por hematopoiese. Saem da medula óssea, circulam pelo sangue e pelo sistema linfático e são armazenados em órgãos linfáticos secundários. São mediadores da definição imunológica, pois produzem e exibem receptores de Ags à superfície. Linfócitos-B: produzidos e amadurecidos na medula óssea. Quando a deixam, cada um expressa um único receptor de Ag na sua membrana – BCR. Quando um linfócito-B, que ainda não reconheceu nenhum Ag, encontra pela primeira vez o Ag, este encaixa no seu anticorpo membranar (BCR) e ocorre uma divisão rápida: o Linfócitos-B Memória: têm maior tempo de vida e continuam a expressar BCR. o Linfócitos-B Efectores: duram apenas alguns dias, não continuam a expressar BCR e produzem Ac a ser secretados. Linfócitos-T: produzidos na medula óssea, sofrem maturação no Timo. Expressam TCR na sua membrana. Este TCR só reconhece Ag se estes estiverem ligados a proteínas membranares – MHC (major histocompatibility complex). Estas actuam no processo. Estas actuam no processo de reconhecimento face à apresentação antigénica. São proteínas polimórficas. o MHC classe I (CD8+): expressas por todas as células nucleadas. Constituídas por uma cadeia pesada ligada a microglobulina. o MHC classe II (CD4+): expressas apenas por células apresentadoras de APC, como macrófagos, linfócitos-B, células dendríticas, etc. Constituída por uma cadeia glicoproteica α e β. Tal como o linfócito-B, quando o linfócito-T encontra o Ag (ligado então a uma molécula MHC), prolifera e diferencia-se: Linfócitos-T Memória Linfócitos-T Efectores: o Linfócitos-T helper (Th) (com CD4 na membrana). o Linfócitos-T citotóxicos (Tc) (com CD8 na membrana). 4 1. Th + MHC II → Th activo – segrega citocinas 2. Citocinas + Tc + MHC I → Tc activo! – Eliminação de células tumorais e de células infectadas por vírus. A activação quer da resposta humoral, quer da resposta mediada por células requer citocinas produzidas pelo Th. Indivíduos não-imunes ou imunodeficientes podem obter imunidade humoral por administração de Acs de um indivíduos saudáveis. O Ac ligar-se-á ao Ag, neutralizando-o e marcando-ocomo alvo. Quando vários Ac se ligam a vários Ags, forma-se um complexo mais facilmente fagocitado (imunocomplexos). Epitopos: pequenas porções activas do Ag reconhecidas e integradas pelos linfócitos (não é o Ag integral). Os linfócitos-B reconhecem epitopos livres, os linfócitos-T reconhecem-nos ligados aos MHC. Moléculas responsáveis pelo reconhecimento: Especificidade: dos linfócitos B e T é gerada aquando da sua maturação na medula óssea e no timo por rearranjos aleatórios no gene que codifica a molécula de Ac. Como já foi explicado, para um Ag ser reconhecido por um linfócito-T, tem de ser processado e combinado com MHC I ou II, dependendo de como entrou na célula: Antigénios exógenos: entram por fagocitose ou endocitose; são degradados; peptídeos Ag ligam-se a MHC II; reconhecidos por Th. Antigénios endógenos: produzidos por células infectadas; expressos com MHC I; reconhecidos por Tc. Selecção clonal dos linfócitos: o Ag interage com o linfócito, o qual se divide repetidamente em clones de células com a mesma especificidade antigénio da célula-mãe. Somente os linfócitos cujos receptores são específicos para o dado Ag são clonados. Antigénio Linfócito-B Complexo Ag-LB (Ag internalizado e expresso na membrana com MHC II, CD4) MHC II + Th Th Th + Citocinas Imunidade humoral Imunidade Celular (por citocinas) Imunidade Inata Activa m Activa m Linfócitos-T: TCR CD4, MHC II CD8, MHC I Linfócitos-B: BCR Esta interacção gera um sinal que, juntamente com sinal co-estimulatório de APCs, leva à activação e proliferação de linfócitos Th 5 Imunidade humoral Os linfócitos-B maduros circulam no sangue e na linfa e estão nos órgãos linfáticos. A interacção com o Ag conduz à activação, diferenciação e proliferação. Parte do Ag é internalizado (epitopo) e depois expresso com MHC II, ao qual se liga Th e produz citocinas. Estas activam células Tc e estimulam diferenciação dos linfócitos-B em memória e efectores. Imunidade celular Desencadeados pelas citocinas, que aqui activam também Tc e regulam a proliferação e a diferenciação de inúmeros componentes de Imunidade Inata (macrófagos, NK, etc). Por vezes, o SI falha, não protegendo o indivíduo, mas atacando-o, podendo surgir problemas como asma, alergias, doenaças auto-imunes, imunodeficiências, rejeição de implantes, etc. Num SI funcional, quando é feito um transplante, o órgão é reconhecido como estranho e é atacado: Th libertam citocinas que activam Tc, e estes atacam e eliminam Altered Self-cells (apresentam MHC I e Ag estranhos). Daí a ideia de que este problema se deve aos linfócitos-T. Para o resolver, deve-se proceder à Imunossupressão pela administração de fármacos. 6 Células e órgãos do Sistema Imunitário (Cap. II) Noções de hematopoeise Todas as células provêm de uma célula-mãe – hematopoietic stem cell (HSC). Esta é indiferenciada, tem a capacidade diferenciação e de auto-renovação, sendo, portanto, pluripotente. A célula-mãe dá origem a 2 linhagens celulares: Linha linfóide: o Linfócitos-T e Linfócitos-B o Células NK Linhagem mielóide: o Eritrócitos o Neutrófilos o Basófilos o Eosinófilos o Monócitos o Mastócitos o Plaquetas o Células dendríticas São as citocinas que vão iniciar o processo de diferenciação. Para isso é necessário que as células progenitoras tenham os receptores de membrana específicos para essas citocinas. É essa especificidade da interacção citocinas-stem-cells que determina a linhagem e as células a originar. A regulação da hematopoiese é feita de modo a manter constante o número dos diferentes tipos de células. Por exemplo, em casos de hemorragia ou infecção, o processo hematopoiético aumenta o número de células. A regulação da hematopoiese é feita através de: Citocinas produzidas pelas stem-cells na medula óssea. Linfócitos-T activados e macrófagos. Regulação genética da expressão de determinados receptores de membrana. Remoção de células por indução de apoptose. As células que sofreram apoptose tornam-se corpos apoptóticos com organelos intactos no interior. São fagocitados por macrófagos, impedindo assim a libertação de enzimas no espaço extra-celular. Deste modo, a apoptose não provoca inflamação em tão grande escala, como a desencadeada pela necrose. Genes indutores da apoptose: FAS (codifica caspases) Genes inibidores da apoptose: Bcl-2 e Bcl-X. Estes 2 são importantes no desencadear de uma infecção, pois o organismo pode não conseguir produzir células suficientes. Inibindo-se a apoptose, o número de células aumenta. No timo, glucocorticóides também induzem a fase efectora da apoptose. Apoptose Necrose ↓ Volume celular Condensação da cromatina e do citoplasma Deformação Desfragmentação do núcleo e do DNA ↑ Volume celular Lise celular com libertação de enzimas líticas para o espaço extracelular Conduz à inflamação 7 Células do Sistema Imunitário Linfócitos Linfócitos-B – são células não fagocíticas. Antes de interagiram com um Ag são denominados Linfócitos Naive e permanecem em G0. Ao interagirem com o Ag, o ciclo celular progride e as células aumentam consideravelmente de tamanho → Linfoblastos. Estes podem dar origem a: o Células Memória o Células Efectoras: produzem 5 tipos de Ac. Todos os Ac produzidos pela mesma célula são específicos para o mesmo Ag. A produção de Ac é o que distingue os linfócitos-B dos restantes. Apresentam MHC II na sua membrana, funcionando então como células apresentadoras de Ac (APC). Possuem como receptores de membrana, além do BCR, o CD21, CD32, CD35 e CD40 (responsável pela interacção com Th). Linfócitos-T – apenas reconhecem os Ags se estes estiverem ligados a um MHC. Ocorrem em células apresentadoras de Ag, em células infectadas por vírus, em células tumorais e em transplantes. O IL-2 dá origem a linfócitos-T efectores e a linfócitos-T memória. Regra geral, linfócitos que expressam CD4 só reconhecem Ag ligados a MHC II, enquanto que linfócitos que expressam CD8 só reconhecem Ag ligado a MHC I. o Linfócitos-T Helper – Activados pelo reconhecimento através de CD4 membranares de Ag a MHC II. Após a produção de citocinas há 3 tipos de respostas: Resposta Th1 → FNT-β e FNT-γ → Activação de macrófagos → Inflamação! Resposta Th2 → Activação de Linfócitos-B através de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Resposta Th3 → Supressores: param a resposta imunológica. o Linfócitos-T Citotóxicos – Activados quando interagem através de CD8 membranares com Ag ligados a MHC I. A sua diferenciação resulta em células de memória e em mais linfócitos-T. Natural Killers (células NK) – Pequeno número de células linfocitárias que não apresentam receptores ou moléculas de membrana características dos linfócitos-B ou T. Não produzem Acs, não têm memória e não são específicos. Distinguem-se bioquimicamente de ambos os linfócitos pela ausência de CDs iguais aos dos linfócitos. São importantes na defesa contra células infectadas e tumorais. Não tendo receptores de membrana CD4, CD8 ou CD3 (possuem CD16 e CD56) e não sendo específicos, reconhecem o alvo por 2 processos: Pela baixa concentração de MHC I nas células e pelos padrões anormais de Ags. Pela ligação de Ags ligados à células-alvo, possível graças ao CD16. Monócitos– No sangue, são activados pela fagocitose de Ag e por citocinas. 8 Macrófagos – Existem nos tecidos. Provêm dos monócitos, aumentando de tamanho e produzindo mais enzimas e factores que eles (factores inflamatórios, proteínas citotóxicas, citocinas, IL-6, IL-1, TNF-α, factores de complemento). Assumem funções específicas consoante o tecido em que se encontram. A sua actividade é aumentada pelo INT-γ secretado por Th1 activados. Funcionam como APCs, no estado activo têm grande quantidade de MHC II. Quanto maiores são, maior capacidade fagocitária exibem. O processo de fagocitose é composto pelas seguintes etapas: 1) Atracção do macrófago para determinada zona por quimiotaxia. 2) Ag adere à membrana do macrófago. 3) Macrófago emite pseudópodes que envolvem Ag → Fagossoma 4) Fagossoma + Lisossoma → Fagolisossoma Os macrófagos têm receptores de Ac e de factores de crescimento. Ac ligados a Ag também podem ligar-se aos macrófagos por Opsonização – são necessários 2 Acs para cada receptor. Após serem fagocitados, os microrganismos são geralmente destruídos, a não ser que sejam resistentes e fiquem como parasitas por fuga dos fagossomas. Passam a ser Patogéneos Intracelulares. Contra estes microrganismos há defesas mediadas por células, DTH (Delayed-type hipersensitivity). Além disso, alguns peptídeos são combinados com MHC II que, com o factor co-estimulatório B7, resultam na activação dos linfócitos Th. Neutrófilos – São os leucócitos mais abundantes (60%) e os primeiros a chegar ao local de inflamação por quimiotaxia. Contêm grânulos primários (peroxidase, lisozima, enzimas hidrolíticas) e secundários (colagenase, lisozima e lactoferrina). Eosinófilos – Contêm substâncias danificadoras da membrana dos parasitas. Basófilos – Contêm e libertam substâncias que têm muita importância nas reacções alérgicas, como a histamina. Fagocitose Citoplasma Núcleo Tipo de corante Neutrófilos Granulado Multilobolado Ácido e básico Eosinófilos Granulado Bilobolado Eosina (ácido) Basófilos Muito granulado Lobolado Azul de metileno (básico) Mastócitos – Diferenciação após abandono do sangue e penetração nos tecidos. Contêm grânulos com histamina e outras substâncias activas importantes nas reacções alérgicas. Células dendríticas – classificados de acordo com a sua localização. Como APCs, têm altos níveis de MHC II e do factor co-estimulatório. Funcionam mais eficazmente como APC do que os macrófagos e que os linfócitos-B, pois não precisam de ser activados: após capturarem os Ag, migram para órgãos linfáticos secundários, onde interagem com os Th. Ac c Ac c Macrófago Ac c Ac c 9 Órgãos do Sistema Imunitário Órgãos linfáticos primários (Timo + Medula Óssea) – ocorre maturação em células imunoindependentes, que depois migram para: o Órgãos linfáticos secundários (Gânglios linfáticos, Baço, MALT) – capturam Ags e permitem interacção com linfócitos (apresentação antigénica). Timo Constituído por cápsula, córtex e medula. No córtex estão localizados os timócitos, linfócitos imaturos, que são seleccionados: Positivamente – eliminados os que não reconhecem MHC self. Negativamente – eliminados os que têm demasiada afinidade para com peptídeos desprovidos de MHC self. Só os timócitos que reconhecem MHC self com Ag estranho é que sofrem maturação → Linfócitos-T. O timo atrofia com a idade, tendo o seu tamanho e actividade máximos durante a adolescência. Medula Óssea Células do estroma – microambiente ideal para diferenciação e maturação dos linfócitos-B. Estes são escolhidos pela sua capacidade de reconhecerem o que é próprio e de não o atacarem. Os linfócitos-B com Acs auto-reactivos são eliminados, evitando reacções de auto-imunidade (ex: lúpus). É, portanto, uma selecção negativa. Gânglios linfáticos Grande quantidade de células fagocitárias e de células dendríticas. Córtex – Linfócitos-B, macrófagos e células dendríticas. Paracórtex – Linfócitos-B, células dendríticas, ↑[MHC II]. Medula – plasmócitos. Ao entrar, Ag atravessa o córtex e paracórtex, activando o linfócito-B e Th → Plasmócitos segregam IgM e IgG. Assim, o vaso linfático eferente é muito mais rico em células que o vaso aferente. Os gânglios incham em consequência do aumento do número de linfócitos. Baço Especializado em filtração sanguínea, aprisionamento de Ags circulantes no sangue e retenção e eliminação de eritrócitos defeituosos/velhos (hemocaterese). Polpa vermelha – rede de sinusóides, macrófagos e eritrócitos. Polpa branca – em torno da artéria esplénica, povoada por linfócitos-T. Zona marginal (em torno da polpa branca) – linfócitos-B. 1) Ag na artéria esplénica. 2) Ag capturados por células dendríticas são transportados até às PALS, na polpa branca. 3) Ocorre activação inicial de linfócitos-B e T. 4) Ocorre activação de Th → activação de linfócitos-B 5) Linfócitos-T e linfócitos-B migram para folículos primários, na zona marginal 6) Folículos primários alteram-se → Folículos secundários, com centros germinativos de linfócitos-B e plasmócitos. 10 Mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) Presente no tracto respiratório (BALT) e no tracto digestive (GALT). Contêm linfócitos-B, linfócitos Th activados, macrófagos e plasmócitos. 1) Células epiteliais da membrana mucosa transportam pequenos peptídeos de Ag através de MCells para o MALT. 2) No MALT, Ags activam linfócitos-B, nos folículos linfáticos → Plasmócitos, que abandonam folículos → IgA (Ac), interagem com Ag. Pele É uma barreira anatómica que contêm queratinócitos – segregam citocinas e contêm MHC II. Existem também as células de Langerhans que, assim como os queratinócitos, activam Th. A pele contém também linfócitos-B e macrófagos. 11 Antigénios (Cap. III) Imunogenicidade: capacidade de induzir uma resposta imunitária humoral ou mediada por células. Imunogénios e antigénios são as substâncias que induzem essa resposta. Todos os imunogénios são antigénios, mas o inverso não se aplica (Haptenos!) Antigenicidade: capacida de de ligação aos produtos finais da resposta imunitária (Acs e TCRs) O SI reconhece os microrganismos por proteínas ou polissacarídeos ligados aos Ags. Na imunidade celular, por exemplo, os imunogénios são as proteínas e alguns lípidos e glicolípidos após processamento e apresentação a MHC. Factores que influenciam a imunogenicidade: Por parte do Ag: o Tamanho (ideal é 100000 Del). o Composição química (heteropolímeros são mais imunogénicos que homopolímeros). o Complexidade (quanto maior for, maior a imunogenicidade). o Capacidade do imunogénio ser processado e apresentado a MHC (moléculas grandes e solúveis são mais facilmente fagocitadas). Do sistema biológico que o Ag encontra: o Genótipo do organismo hospedeiro (resposta imunitária depende de genes TCR e MHC). o Dose e sítio de administração do Ag (dose muito baixa ou muito alta não desencadeia resposta). o Presença de adjuvantes (prolongam a vida do Ag e amplificam sinais co- estimulatórios Epitopos As células do SI não reconhecem a totalidade do Ag, mas apenas algumas regiões activas imunologicamente – epitopos. Existem vários epitopos no mesmo Ag e são reconhecidos consoante a célula do SI com que contactam. Um epitopo pode não ser sequencial e pertencer a vários locus da molécula, mas, pelaconformaçao desta, aproximam-se. A confirmaçao do epitopo é condicionada pela enovelado da molécula e podem perder-se se ocorrer desnaturação dessa por quebra de pontes S-S. Os Linfócitos-B só reconhecem epitopos bastante acessíveis, flexíveis e móveis e não reconhecem epitopos de proteínas desnaturadas. São geralmente compostos por AAs hidrofílicos na superfície. As ligações são mais fortes quando o sítio de ligação do Ac (BCR) e o epitopo têm formas complementares que os aproximam. Em proteínas globulares, o sítio de ligação do Ac liga-se ao epitopo na superfície, enquanto que pequenos peptídeos se dobram em estruturas compactas que cabem na reentrância do BCR. Os Linfócitos-T reconhecem epitopos no interior da molécula, pois esta é processada e o epitopo ligado ao MHC. Além disso, como reconhecem peptídeos antigénicos processados, são a única resposta activada em proteínas desnaturadas. Há a formação de complexos trimoleculares: Epitopo – Antigénio – Agretopo TCR (no paratopo) MHC MHC I – 8 a 10 AAs MHC II – 12 a 25 AAs 12 Haptenos São moléculas antigénicas não imunogénicas. Para desencadearem imunização, têm de se ligar a transportadores, onde são produzidos Ac contra os transportadores, os haptenos e o epitopo! Daqui o interesse de substâncias que funcionem como haptenos – podem obter-se Ac contra elas próprias. É útil para pesquisar substâncias específicas, como hormonas em kits de gravidez. Se em diferentes haptenos a configuração total for mantida e só variar o derivado não-iónico, um mesmo Ac liga-se a todos eles. Imunodominantes: epitopos mais imunogénicos de uma proteína num organismo. Choques anafiláticos Reacções alérgicas muito fortes causadas pela formação de complexos entre medicamentos e proteínas → colapso dos sistemas respiratório, circulatório e gastrointestinal. O tratamento passa pela injecção de adrenalina, que aumenta a pressão arterial e impede a libertação de substâncias causadoras do choque como a histamina por parte dos mastócitos e dos basófilos. 13 Anticorpos (Cap. IV) Imunoglobulinas (Ig): proteínas globulares com função imunitária 4 cadeias polipeptídicas – 2 cadeias leves + 2 cadeias pesadas o Gama = IgG o Alfa = IgA o Mim = IgM o Epsilon = IgE o Delta = IgD Região de charneira Ligações: ligam as duas combinações idênticas de cadeias H-L, formando estruturas de 4 cadeias das Ig – dímero (H-L)2. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ponte dissulfito S-S (ligação covalente forte) e por uma combinação de interacções não covalentes: pontes de hidrogénio, pontes hidrofóbicas, etc. O número e a posição das S-S difere entre as as classes e subclasses de Ig. Regiões V: primeiros 100-110 AAs da região amino-terminal de uma cadeia H em L constituem uma região de sequência altamente variável e são outro factor de distinção de classes de Ig. Deve ser capaz de identificar e interagir especificamente com um epitopo. CDRs (complementarity determining regions) – sítio de ligação Ac-Ag, no Fab. FRs – domínio de regiões V que sofre menos variações quando comparados com CDR ou com HV (hipervariable regions). Regiões C: restante sequência de AAs onde são encontradas poucas diferenças entre as classes de Ig. São regiões constantes – CL e CH. São o sítio de ligação de HC, que são variantes alélicas entre indivíduos de uma espécie que determinam diferenças nas sequências de AAs localizadas nas regiões C. Glicosilação de Ig afecta a taxa à qual são eliminadas pelo fígado e aumenta a solubilidade das mesmas. Região de charneira: Fab (cadeia H + cadeia L) + Fc (cadeia H) É rica em resíduos de Pro e flexível (em IgD, IgG e IgA). Os dois braços Fab podem apresentar diversos ângulos relativamente um ao outro quando há ligação do Ag. Podem mover-se, alinhando as CDRs com os epitopos à superfície celular. Fc movem-se para maximizar funções efectoras. Ligam-se a receptores da superfície celular por uma região Fc específica. Devido à riqueza de Pro e Cys, é uma zona mais susceptível à acção da papaína e pepsina. Idiotopo: região da Ig que determina ligação ao Ag. Idiotopo ↔ Epitopo Ac ↔ Ag 14 Classes de Imunoglobulinas IgG Constitui 80% do total, é a mais abundante. Possui 2 cadeias H + 2 cadeias L 4 subclasses, devido a: o Diferenças na sequência de AAs da cadeia pesada, mas são 90-95% homólogos o Diferenças nas características estruturais Tamanho Número e posição de pontes SS entre cadeias H Estas diferenças têm repercussões na actividade biológica da molécula: IgG1, IgG2, IgG3 rapidamente atravessam a placenta → imunidade do feto. IgG3, IgG1, IgG3 activam complemento (por ordem de eficácia). IgG1, IgG3 ligam-se com alta afinidade a receptores Fc nas células fagocíticas, mediando a opsonização. Produção de IgG necessita de linfócitos-T. Vida mais prolongada, 23 dias. Monómeros Digestão de IgG: o Papaína → 2 fragmentos de Fab + 1 fragmento de Fc. Cada um tem um sítio de ligação ao Ag. Fc não se liga ao Ag, mas é responsável pela activação do complemento e pela ligação de uma molécula ao FcR nos macrófagos, NK e linfócitos-T. Cliva acma das pontes SS que se ligam cadeias H. o Pepsina – 2 F(ab)2, com 2 sítios de ligação ao Ag. Fc degrada-se pois é clivado em múltiplos fragmentos. Cliva abaixo das pontes SS que se ligam cadeias H. IgM 5-10% do total. Monomérica, expressa como Ac ligado à membrana dos linfócitos-B. Pentomérica, secretada pelas células do plasma. 5 unidades monoméricas unidas por pontes S-S. Cada pentâmero contém uma cadeia adicional ligada a Fc → Cadeia J (joining). É a 1ª a ser produzida na resposta imunitária a um Ag. É a 1ª a ser produzida pelo recém-nascido. É a mais eficiente na ligação de Ags multidimensionais, como partículas virais ou glóbulos vermelhos – não é necessária tanta IgG como IgM para neutralizar uma infecção viral. Baixas concentrações nos fluidos tecidulares intercelulares, pois, graças ao seu tamanho, não difunde bem. Tem um papel acessório no processo de secreção. 15 IgA 10-15% do total. Monómero, mas também existem dímeros, trímeros e tetrâmeros, todos estes com cadeia J. Classe predominante nas secreções externas, como o leite materno, saliva, lágrimas, secreções intestinais, respiratórias e do tracto genito-urinário. IgA secretora: dímero/tetrâmero com cadeia J + componente secretora. Componente secretora produzida por células epiteliais das membranas mucosas. o O dímero/tetrâmero IgA liga-se a um receptor poli-Ig na membrana basolateral de uma célula epitelial por uma ponte S-S. o O complexo é transportado pela membrana até ao lúmen. o Poli-Ig é clivada enzimaticamente, mas deixa a sua componente secretora ligada à IgA → IgA secretora. O leite materno contém IgA secretora, benefício imunitário, que ajuda a proteger o recém-nascido contra infecções no 1º mês de vida. IgE Baixa concentração sérica, mas com actividade biológica potente. Medeia reacções de hipersensibilidade tipo I – hipersensibilidade imediata: o IgE ligada aos mastócitos e basófilos nos FcR, servindo como um receptor de alergénios e de Ags. o Quando uma quantidade suficiente de Ag se liga à IgE sobre o mastócito, ocorre desgranulação → Libertaçao de histamina e prostaglandinas – factor de activação de plaquetase citocinas. o Manifestações alérgicas. o Defesa antiparasítica. Vida média: 2,5 dias. IgD 0,2% do total. Actua em receptores de Ag nas membranas dos linfócitos-B em fase inicial de desenvolvimento → activando crescimento de linfócitos-B, ajuda a iniciar respostas do Ac. IgD e IgM são os únicos receptores expressos pelos plasmócitos. 16 Funções dos Anticorpos Receptores membranares de linfócitos-B (IgD e IgM). BCR: uma Ig + heterodímero (Igα e IgB) – associação necessária pois a cauda de Ig é muito pequena para transmitir sinais por si só. Neutralização de Ags. Regulação da resposta imunitária. Iniciação da resposta a um Ag: Formação de imunocomplexos. Activação do complemento (IgG1, IgG2, IgG3, IgM). Opsonização (IgG1, IgG3, IgG4) Citoxicidade mediada por Ac: o IgG – macrófagos, monócitos, neutrófilos, NK, linfócitos-T. o IgE – eosinófilos. Imunidade das mucosas (IgA) Imunidade neonatal (IgG) Hipersensibilidade imediata (IgE) Anticorpos Monoclonais A maioria dos Ag tem vários epitopos e por isso causa a activação de vários linfócitos-B, sendo o soro constituído por uma mistura de Ac para os vários epitopos – resposta Policlonal. Querem-se Ac monoclonais que sejam específicos para um determinado Ag. Produção de Ac monoclonais: 1) Fusão de linfócito-B com célula de mieloma → hibridoma. Mas as fusões nem sempre têm êxito ou podem ser indesejadas. 2) Selecçao por meios de cultura com HAT Células de mieloma não sobrevivem Linfócitos-B não sobrevivem por muito tempo Hibridomas sobrevivem. 3) Após obtenção de hibridomas, ocorre a selecção do Ac pretendido por técnicas de ELISA ou RIA (rádio-imuno-análise). 4) Após isolamento, há obtenção de clones → Ac monoclonais. Dificuldades técnicas na obtenção de Ac monoclonais humanos: As poucas técnicas de mieloma humano que demonstram crescimento imortal são susceptíveis à selecção por HAT, não contribuindo com a secreção de Ac nos hibridomas. Alternativa: confere-se imortalidade às outras células (linfócitos-B) acrescentado á cultura o Ag EBV (vírus), mantendo activa a secreção de Ac. Os hibridomas humanos são preparados a partir do sangue periférico humano, que tem poucas células B activas devido aos Ags presentes nas vacinas. Mas os voluntários humanos não podem ser imunizados com o espectro do Ag administrados em animais. Alternativa: células humanas in vitro. O microambiente normal não pode ser recriado completamente in vitro, e os linfócitos-B só produzem aí IgM de baixa afinidade. Alternativa: transplantar as células necessárias à 17 resposta imunitária para ratinhos. Após imunização de ratinhos, os quais contêm linfócitos- B e T humanos, há isolamento de linfócitos-B → produção de Acs monoclonais. Imunoporinas: futuro dos medicamentos contra tumores. Compostas por: Acs monoclonais específicos para tumores + toxinas letais. Ac monoclonal distribuiria a toxina letal especificamente pelas células tumorais, causando a sua morte por inibição da síntese proteica. Abzimas: Acs monoclonais catalíticos + enzimas. A ligação de Ac-Ag = enzima-substrato, com a excepção de que o Ac não altera o Ag, enquanto que a enzima catalisa reacções químicas do substrato. As abzimas deram esse poder aos Acs, estabilizando o estado de transição das substâncias ligadas → ↓ Energia de activação necessária. 18 Interacção Antigénio-Anticorpo (Cap. VI) A ligação Ag-Ac é reversível e é feita por ligações não-covalentes (Epitopo-CDR) Pontes de hidrogénio. Ligações iónicas. Ligações hidrofóbicas. Forças de Van der Waals. As ligações não covalentes são fracas e por isso são necessárias em grandes quantidades, dependendo, da complementaridade entre o epitopo e os sítios da ligação no Fab dos Acs (onde estão CDRs). Afinidade – traduz a força de ligação entre o epitopo e o CDR, ou seja, a força da ligação não covalente. Os complexos com baixa afinidade são facilmente dissociáveis. Avidez – traduz a força total de ligação entre Ac multivalente (1 valência = 1 sítio de ligação) e um Ag (com vários epitopos). Em sistemas biológicos, a avidez traduz melhor a realidade que a afinidade, pois, por vezes, a alta avidez compensa a baixa afinidade (Ex: IgM). Tal como numa reacção química, há um equilíbrio entre Ag e Acs livres ↔ complexo Ag-Ac, e por isso, uma constante de equilíbrio. ↑ Constante de associação → + forte a ligação. Reactividade cruzada Embora a reacção Ag-Ac seja muito especifica, o Ac pode reagir com outros Ags quando: 2 Ags partilham um epitopo. 1 Ac se liga a um epitopo semelhante ao qual com que é específico. Exemplos: o Polissacarídeos antigénicos com grupos oligossacáridos semelhantes → sistema sanguíneo AB0 baseado nas glicoproteínas expressas nos glóbulos vermelhos: Grupo B – tem anticorpos anti-A. Grupo A – tem anticorpos anti-B. Grupo AB – não tem anticorpos. Grupo 0 – tem anticorpos anti-A e anti-B Por reactividade cruzada, Ag microbianos induzem a formação de Ac em indivíduos que não os têm – nunca estiveram em contacto com esse Ag. → Reacções auto-imunes: Acs dirigidos a um microrganismo atacam epitopos do organismo portador semelhantes aos epitopos daquele microrganismo. → Vacinas, como a da varíola. Reacções de Precipitação Reacções de Aglutinação Imunodifusão o Radial o Dupla Hematoaglutinação Aglutinação bacteriana Inibição da aglutinação Imunoelectroforese Técnicas com Ags marcados o RIA o ELISA o IF o Citometria de fluxo 19 Reacções de Precipitação Ac que precipitam Ag solúvel são Precipitinas. Formaçao do precipitado depende da valência do Ac e do Ag → têm de ser pelo menos bivalentes. Reacções de precipitação podem ocorrer: Em líquidos (fluidos): o Pequena quantidade fixa de Acs numa série de tubos. o Adicionam-se quantidades crescentes de Ag em cada tubo. 1) Pró-zona – excesso de Ac. 2) Zona de equivalência – Ac=Ag, com precipitado. 3) Pós-zona – excesso de Ag. Em gel (matriz do agar) – à medida que Ag e/ou Ac se difundem, forma-se uma linha visível de precipitação → zona de equivalência. Imunodifusão Radial 1) Ag num poço em agar que contém Ac já difundidos. 2) Ao difundir, Ag cria um gradiente ao longo do agar. 3) Na zona de equivalência, há precipitação visível, formando um anel. [Ag] é determinada por curvas-padrão, consoante o diâmetro do anel. Dupla 1) Ag num poço de agar, Ac noutro poço de agar. 2) Difusão de Ag e do Ac um em direcção ao outro, estabelecendo um gradiente de concentração. 3) Na zona de equivalência há precipitação visível, formando uma linha. Se se colocarem 2 poços com Ag e 1 poço com Ac, é possível pesquisar se os epitopos são semelhantes consoante as reacções que ocorram: Identidade – o epitopo é partilhado pelos Ags, formando- se uma só linha de precipitação curvada Não identidade – epitopos são diferentes, formando-se 2 linhas de precipitação que se intersectam Identidade parcial – alguns dos epitopos são partilhados, formando-se uma linha de precipitação fundida. Ac anti-A e anti-B Ag c/ epitopo B Ag c/ epitopo A e B Ac anti-A e anti-B Ag c/ epitopo B Ag c/ epitopo A Ac anti-A Ag c/ epitopo A Ag c/ epitopo A 20 ImunoelectroforeseCombina electroforese com imunodifusão dupla. 1) Ag submetido a electroforese. 2) Em direcção paralela ao sentido de migração é adicionado antisoro. 3) As substâncias difundem uma em direcção à outra, deixando linhas de precipitação nos pontos onde se encontram. Técnica qualitativa. Faz-se com uma mistura de 1 Ag ou do soro humano (muitos Ags). Utilidade: detectar a ausência/presença de uma dada substância (Ex: doentes com mieloma múltiplo, que têm um padrão anormal de Ig (↑). Electrophoresis: o Ag sofre electroforese num meio com Ac, formando uma linha de precipitação com a forma de foguete → altura proporcional à [ ]. Reacções de Aglutinação Ac que causam aglutinação são Aglutininas. Acs e Ags têm de ser, pelo menos, bivalentes. Pró- zona: excesso de Ac e Ac policlonais ocupam sítios activos impedindo aglutinação. Hematoaglutinação A aglutinação dos GV presentes no sangue é feita por tipagem sanguínea: adiciona-se anti-soro A (Acs A) e anti-soro B a duas gotas de sangue. Se aglutinar anti-soro B → é tipo B (pois tem Ac A) Se aglutinar anti-soro A → é tipo A Se aglutinar os 2 → é tipo AB Se não aglutinar nenhum → é tipo 0 Aglutinação bacteriana Determina o nível de Acs que o indivíduo tem contra essa bactéria, adicionando-se bactéria (Ag) aos tubos que têm cada vez menor [soro]. No tubo em que ocorrer aglutinação (zona de equivalência, [Ac] = [Ag adicionado]. Inibição da aglutinação Técnicas muito sensíveis, só para pequenas quantidades. Este método serve para testes de gravidez, detecção da presença de drogas e para saber se o individuo já esteve em contacto com o Ag. Ex: teste da gravidez por pesquisa de HCG (hormona só presente na urina de uma mulher grávida). Kit gravidez contém: anticorpos anti-HCG e partículas de látex carregadas com HCG. HCG presente na urina compete com partículas de látex pela ligação ao Ac, impedindo que aglutinem. Inibição da aglutinação → Reacção positiva → Gravidez Se ocorrer aglutinação → Reacção negativa → Não há gravidez HCG na urina Ac anti-HCG Látex com HCG Não há aglutinação! Ac anti-HCG Látex com HCG Há aglutinação! 21 Técnicas com Ags marcados Baseiam-se na ligação entre 2 moleculas com afinidade estrutural, Binder + ligante, que podem ser: Ag + Ac Hormona + proteína transportadora/receptora Fármaco + receptor 1) Junção das duas moléculas com grande afinidade. 2) Visualização da reacção RIA – radioactividade. ELISA – enzima que torna substrato corado. IF – flurocromo que é a activado por RUV ↓ Gasto de energia, pois são reacções amplificadas. 3) Comparação com reacção padrão (calibração) → reacção quantitativa. Utilidade: doseamento de Ag, Ac, hormonas marcadoras tumorais, alergénios, IgE, vitaminas, etc. RIA (rádio-imuno-análise) – doseamento por contagemde radioactividade. Ag marcado ligado ao Ac numa mistura que provoque saturação dos sítios da ligação do Ac. É adicionada à mistura amostra com Ag não marcado em quantidades crescentes, este competindo pela ligação ao Ac. A diminuição da quantidade de Ag marcado radioactivamente ligado ao Ac é proporcional à quantidade de Ag não marcado na amostra. Antes da medição, é necessário eliminar Ags livres (por precipitação). RIA de fase sólida – Ag ou Ac ligados ao meio, facilitando a lavagem. ELISA (enzime-linked immunosorbet assay) Doseamento de Ac por coloraçao da reacção. Semelhante ao método anterior, mas usa enzimas em vez de marcação radioactiva: uma enzima ligada a um Ac reage com um substrato, formando produto colorido. + seguro, + barato que RIA. Concentrações determinadas por comparação com curva-padrão. o ELISA indirecta, doseamento quantitativo de Acs. 1) Mistura de Acs + Ags ligados a gel. 2) Lava-se e adiciona-se um segundo Ac – específico para domínio Fc do primeiro – ligado a uma enzima. 3) Lava-se e adiciona-se substrato da enzima. A quantidade de cor é proporcional à quantidade de Ac específico para um determinado Ag (o presente no gel). Usado para determinar se indivíduo é soro + ou soro – para HIV (HIV + / HIV –). o ELISA de Sandwich, doseamento quantitativo de Ags: Ag que se quer dosear está no meio de 2 Acs específicos – 1 fixo numa placa e 1 livre que é marcado. A coloração da reacção é proporcional à quantidade de Ag. Placa sólida que fixa Ac específico. Adiciona-se o soro (com Ag). Retira-se excesso de Ag que não é fixado na placa com Ac. 22 Junta-se o segundo Ac marcado com a enzima, adicionado sempre em excesso para certificar saturação de Ags. o ELISA competitiva, doseamento quantitativo de Ags: numa solução padrão com complexos de Ag*-Ac (*=marcado), pode desfazer-se parte desses complexos pela adição de Ag não marcado e livre. Pelo princípio da reversibilidade, este último Ag consegue competir com Ag* pelos sítios de ligação ao Ac, deslocando-o → ↓ Nº de complexos Ag*-Ac. [Ag*-Ac] + Ag = [Ag*-Ac] + [Ag-Ac] + Ag* + Ac. Eliminando Ags livres, a redução de [Ag*-Ac] é proporcional à quantidade de Ag adicionado. Adiciona-se o composto enzima-anticorpo anti-Fc e o substrato. Quanto ↑ a quantidade de Ag, ↓ a cor emitida. o Técnica de ELISA modificada: útil para determinar o Nº de células que produzem Acs para um Ag ou que produzem um dado Ag. Poço forrado com Acs para um dado Ag. Adicionadas células e aguarda-se (enquanto produzem o Ag). Removem-se as células e junta-se um Ac específico + enzima. Lava-se e junta-se substrato da enzima → Anel em torno de cada célula secretora. IF (Imunofluorescência) Se as moléculas de Ac são marcadas com um corante fluorescente ou com um fluorocromo, podem ser detectados pela emissão de luz colorida quando excitadas por uma luz de comprimento de onda apropriado. Os fluorocromos são conjugados à região Fc de uma molécula de Ac, não afectando a especificidade desta. Os mais utilizados são a rodomina, a fluoresceína e a ficoeritrina. A coloração do Ac pode ser directa ou indirecta. Na coloração directa, o Ac é conjugado com o fluorocromo. Na coloração indirecta, o Ac não é marcado, mas é detectado por um reagente marcado por um fluorocromo. Um possível reagente é a proteína A do Staphylococcus Aureus. A coloração de imunofluorescência indirecta tem duas vantagens sobre a directa: A falta de Ac é muitas vezes um factor limitante, e a coloração indirecta evita a sua perda de Ac que pode ocorrer na conjugação. A coloração indirecta aumenta a sensibilidade da coloração, pois as múltiplas moléculas do reagente ligam-se a cada molécula de Ac, aumentando a quantidade de luz emitida no local. Esta técnica tem sido aplicada para estudar subpopulações de linfócitos-T CD4 + e CD8 + , populações bacterianas, complexos Ac-Ag em doenças auto-imunes, localização de produtos celulares marcados in situ, etc. Fornece dados qualitativos. Citometria de fluxo FACS (fluorescence-activated cell sorted) – aparelho que automatiza a análise e a separação das células coradas com o anticorpo fluorescente. Utiliza um feixe de laser e um detector de luz para contar as células únicas em suspensão. Quando uma célula passa pelo feixe de laser do FACS, a luz do laser é deflectida a partir do detector, sendo esta interrupção registada. Além disso, as células marcadas são excitadas pelo laser e também é registado o nível de fluorescência que a célula emite. Depois disso, o aparelho coloca as células possuindo padrões de reactividade diferentes em diferentes recipientes. Um uso clínico comum é 23 determinar o número de células sanguíneas brancas emcada população de amostras sanguíneas de pacientes. Dados quantitativos. 24 Major Histocompatibility Complex (MHC) (Cap. VII) São um conjunto de genes estritamente ligados cujos produtos desempenham papéis de reconhecimento celular e de discriminação entre o próprio e o não próprio: Determina se o tecido transplantado é histocompatível/histoincompatível. Desenvovimento de resposta imunitária humoral e mediada por células. Agem como estruturas apresentadoras de Ag, influenciando o espectro de Ags aos quais os linfócitos Tc e Th podem responder. Por isso, estão profundamente relacionados com a susceptibilidade individual à doença. Localização e funções de MHC Nos humanos, localizam-se no cromossoma 6. Estão organizados em regiões que codificam 3 classes de moléculas: MHC Classe I: codificam proteínas expressas na superfície de quase todas as células nucleadas. Apresentação de Ag a células Tc. MHC Classe II: codificam proteínas expressas maioritariamente em células APCs. Apresentação de Ag a células Th. MHC Classe III: codificam proteínas em funções imunitárias, como componentes do complemento e moléculas envolvidas na inflamação. Halótipos: a maior parte dos indivíduos herda os alelos codificados por loci na forma de dois blocos – halótipos – um de cada progenitor. A descendência é geralmente heterozigótica no que diz respeito a estes loci, e expressa-os em co-dominância (ambos). Foram modificados geneticamente linhagens de ratos, de modo a serem idênticos excepto nos locus de MHC. Assim, qualquer diferença fenotípica entre os indivíduos dever-se-ia a esta região genética. A experiência permitiu a comparação das diferenças funcionais entre os animais e esclareceu quais os meios pelos quais os MHC mantêm sua heterogeneidade. Estrutura de MHC MHC Classe I: Cadeia α – grande cadeia ancorada à membrana plasmática. Possui 3 domínios externos α1, α2 e α3, cada um com: domínio transmembranar (no qual diferem), sequência de AAs hidrofílicos e âncora citoplasmática. Microglobulina β2 – 3 domínios externos semelhantes aos da cadeia α, mas sem domínio transmembranar. Domínios α1 e α2 interagem, formando um sulco de ligação de peptídeos situado no topo da membrana: domínio α3 é altamente conservado, contendo uma sequência que interage com a molécula membranar CD3 + do Tc. A microglobulina interage com α1, α2 e α3 intensivamente. MHC Classe II: Contêm 2 cadeias polipeptídicas diferentes, α e β. Tal como MHC I, contêm segmentos transmembranares, segmentos de ancoragem plasmática e domínios externos: α1 e α2 – homologia com Ig, local de ligação com Ag. β1 e β2. 25 A estrutura tridimensional de MHC I é semelhante à de classe II. A diferença é que na II classe, o dímero está orientado de forma a posicionar os peptídeos em direcções opostas. Tal como MHC I, α2 e β2 de MHC II apresentam homologia com a Ig. Interacção peptídica MHC Classe I Peptídeos transportados do citosol para RE, onde interagem com MHC I (via endógena). Degradados em via citoplasmática. Cada tipo de MHC I exprime apenas um conjunto de peptídeos que pode incluir mais de 2000 peptídeos diferentes. No entanto, cada célula exprime mais do que um tipo de MHC I na superfície membranar. MHC de células normais exprimem peptídeos derivados de citocromo c, histonas, etc. MHC de células infectados exprimem proteínas virusais. Uma vez ligados aos peptídeos, MHC I apresenta-os a linfócitos CD8 + . Cerca de 100 complexos MHC-peptídeo são suficientes para marcar a célula como alvo para linfócito-T CD8. CD8 tem entre 8-10 AAs, sendo a ligação mais forte quando tem 9 AAs. A ligação é forte e estável devido à localização dos resíduos de ancoragem nas duas pontas do peptídeo, uma na região amino-terminal e outra na carboxilo-terminal. Entre essas regiões, o peptídeo faz um arco, permitindo a adaptação ao seu tamanho. Pensa-se que é nesta sequência em arco que se dá a interacção com o TCR dos linfócitos-T. MHC Classe II Degradam peptídeos por via endocítica, via exógena. A maioria deriva das proteínas da membrana e tem entre 13-18 AAs. Este peptídeos não têm resíduo de ancoragem, a ligação vai sendo feita ao longo de vários sítios e não só nas extremidades. Polimorfismo de MHC Dentro de uma espécie, as moléculas são muito diferentes pela presença de múltiplos alelos poligénicos. Linkage desiquilibrium: diferença entre a frequência esperada e a frequência observada. A diversidade prevista é superior à verificada pois nem todas as combinações alélicas ocorrem com a mesma frequência – não há distribuição aleatória: Não houve ainda um número de geração suficiente. Selecção natural. Alguns genes são mais propensos a sofrer crossing-over. Mas apesar deste LD, o MHC humano é dotado de um polimorfismo considerável, o que dificulta a compatibilidade em transplantes. A maioria das variações ocorre em pequenas porções, especialmente na zona distal das moléculas. Quanto ao MHC III, várias proteínas diferentes em termos estruturais e funcionais são aí codificadas. Esta classe difere das outras pois as proteínas expressas não são de membrana e não têm estruturas semelhantes. Regulação da expressão A expressão de MHC II é diferencial, ocorre apenas em alguns tipos celulares, diferindo entre os mesmos o grau de expressão. Ocorre regulação por: Citocinas, Interferões γ, β e α e INF → induzem formação de MHC II. Vírus provocadores de infecção (adenovírus, HBV, etc) → reduzem expressão de MHC II. Não por diminuição da transcrição, mas por diminuição de proteínas transportadoras. A diminuição da expressão de MHC II ajuda o vírus a fugir do SI pois diminui a capacidade das células activarem Th. 26 Capacidade da resposta imunitária Determinada pela expressão da MHC II. Dois modelos para a variabilidade da resposta imunitária: Determinant select model (A): diferentes moléculas de MHC implicam diferentes modos de ligar o Ag processado. Holes In The Repertorie Model (B): linfócitos-T que reconhecem Ag estranhos semelhantes aos Ags próprios podem ser eliminados durante o processamento no timo. Na ausência de uma molécula MHC II que consiga ligar o peptídeo apresentado (A) ou na ausência de um linfócito-T capaz de reconhecer complexco MHC-peptídeo → Ausência de resposta imunitária! O modelo A afirma que a força de ligação da molécula de MHC a um dado Ag é determinada pela estrutura do MHC. Devido ao polimorfismo destas moléculas, os indivíduos podem reagir mais ou menos intensamente a um determinado Ag. Há doenças directamente relacionadas com o MHC: Auto-imunes. Alterações do factor complemento. Alterações neurológicas. Alergias. A variabilidade alélica em MHCs humanos de pessoas doentes costuma ser inferior à da população em geral. A redução do polimorfismo do MHC entre espécies pode predispô-las a doenças infecciosas também. 27 Processamento e apresentação dos Antigénios (Cap. VIII) Para ser reconhecido por um linfócito-T, o Ag tem de ser processado e então formado um complexo peptídeo-MHC para apresentação antigénica. As células intervenientes na apresentação antigénica são: Células-alvo: apresentam Ags estranhos ligados a MHC I. APCs: apresentam Ags estranhos ligados a MHC II. Têmcapacidade de produzir o sinal co- estimulatório B7. Exemplos de APCs: macrófagos, células dendríticas, macrófagos, linfócitos-B (quase todas as células nucleadas podem ter função de APC, mas para os linfócitos-T, durante a resposta inflamatória). Ag pode ser processado por via citosólica (Ag endógeno) ou endocítica (Ag exógeno). Este modo de entrada na célula determina então se Ag vai ser associado a MHC I ou II, determinando por isso a resposta imunitária, se são reconhecidos por Tc ou Th. Via citosólica Para Ag endógenos, como os produzidos por um vírus dentro da célula. É a via usada para o turnover normal das proteínas intracelulares. 1) Ag endógenos degradados (processados) no citoplasma pelo complexo proteossoma associada a ubiquitina. Para degradar Ag e AAs, são adicionados duas subunidades ao proteossoma: LMP2 e LMP7, codificados pelo gene MHC. O aumento dos níveis de IFN-γ induz produção de LMP2 e LMP7. 2) Peptídeos resultantes são transportados para RER através da TAP – dímero de 2 proteínas, TAP1 e TAP2, com um domínio hidrofóbico (atravessa a membrana) e um sítio de ligação para ATP (fica no citosol). As TAP têm maior afinidade para peptídeos com 8-13 AAs e só transportam peptídeos que vão ligar a MHC I. A montagem dos peptídeos na molécula MHC I exige: Um peptídeo no sítio de ligação. Participação de proteínas chaperons – caluexina, calreticulina e tapasina. 3) Complexo caluexina-cadeia-α (chaperon de membrana do RER) liga-se a β2- microglobulina. 4) Dissociação da caluexina, ligação de calreticulina e tapasina (esta aproxima TAP da MHC). 5) Tapasina em associação com TAP fornece o peptídeo que estabiliza a estrutura. 6) Libertação das proteínas chaperons – MHC muito estável. 7) MHC I é levado pelo complexo de Golgi até à membrana. Aqui, ocorre a apresentação antigénica aos Tc. Existe uma linha de células mutantes, RMA-S, que só expressa 5% de MHC I na sua membrana. Estas células sintetizam níveis normais de cadeias α e de β2-microglobulina, mas estas estruturas permanecem no interior da célula. Quando são fornecidas as moléculas necessárias à expressão dos restantes 95% dos genes de MHC, inclusive um gene funcional para o transportador, as células tornam-se normais, deixando de ter defeito no transporte de peptídeos processados no citoplasma para o RER, onde MHC são sintetizados. 28 Via endocítica Para Ags exógenos internalizados por APC por fagocitose, pinocitose ou endocitose. 1) Endocitose/Fagocitose do Ag, sendo conduzido até ao RER. 2) No RER, cadeias α e β ligam-se a cadeia invariável → liga-se ao peptídeo no sítio de ligação impedindo a ligação de peptídeos endógenos no interior do RER. A cadeia invariável é necessária para células APC que têm dois tipos de MHC (I e II), e é preciso que peptídeos derivados de Ags endógenos se liguem a MHC II produzida no RER. 3) Complexo sai para o complexo de Golgi. 4) Transporte por compartimentos de acidez crescente: Endossomas recentes → endossomas tardios → lisossomas (↑ pH), ao longo dos quais vai sendo degradado até só restar apenas o AA do sítio de ligação – CLIP. 5) HLA-DM catalisa a troca do CLIP por peptídeo do Ag exógeno. HLA-DO bloqueia HLA- DM. 6) MHC II transportada até à membrana. 29 T-Cell Receptor (Cap. IX) TCR ≠ BCR Liga a forma ligada a receptores de membrana, MHC. Associado na membrana a CD3. Liga forma solúvel de Ag. Associado a Igα e Igβ. Só Ag apresentados por MHC são reconhecidos – AutoMHC restrição, com 2 modelos explicativos: Modelo do Duplo Receptor – TCR teria um receptor para o Ag + um receptor para o MHC. Modelo de Altered-Self – TCR teria um só receptor capaz de reconhecer um Ag estranho ligado a um MHC. Estrutura do TCR Heterodímero α β com regiões constantes e regiões variáveis. Cada cadeia contém dois domínios, contendo uma ligação dissulfeto dentro de cada domínio dentro de cada cadeia. Variabilidade das cadeias presente no domínio amino-terminal, o resto é conservado. 3 regiões hipervariáveis equivalentes ao CDR das Igs, mas não se consideram iguais pois há uma 4ª região hipervariável. o CDR 1 – da cadeia β liga-se à região carboxilo-terminal e da cadeia α liga-se à região amino-terminal. o CDR 2 liga-se a MHC. o CDR 3 das cadeias α e β ligam-se ao centro do peptídeo. o CDR 4 não contacta com complexo MHC-peptídeo. Cauda extracelular + domínio transmembranar (com AAs carregados positivamente permitindo interacção com CD3) + cauda citoplasmática. CDR 1, CDR 2, CDR 3 orientados no domínio variável de modo a formar sítio da ligação do Ag, sendo CDR 3 o centro desse sítio de ligação. NH2 NH2 Cα Vα Cβ Vβ COOH COOH + + – S-S – Sequência conectora Região transmembranar Cauda citoplasmática 30 Diversidade dos TCR Rearranjos por combinações dos genes com regiões variáveis: Flexibilidade funcional. Paragem da produção de codões STOP (quando não acontece temos TCR defeituosos). Esta variabilidade não pode afectar o reconhecimento de MHC, por isso: CDR1 e CDR2 → variabilidade limitada. CDR3 → grande variabilidade. O CDR3 participa na transdução do sinal, mas não interfere na interacção com o Ag. É necessário para a expressão membranar de dímeros αβ (TCR). CD3 → 2 heterodímeros + 1 homodímero em 90% dos casos (10% → 3 heterodímeros) Complexo CD3-TCR → 3 heterodímeros + 1 homodímero. Dímeros de TCR → especificidade da natureza de ligação. Dímeros de CD3 → transdução do sinal. CD4 Monomérica, glicoproteína membranar. 4 domínios extracelulares (β2 de MHC II) + porção transmembranar + cauda citoplasmática. Só reconhece peptídeos ligados a MHC II. CD8 Heterodímero α,β e δ. 1 domínio extracelular (α1, α2, α3 de MHC I) + porção transmembranar + porção citoplasmática. A afinidade dos TCR pelos MHC é fraca/moderada, depende da adesão entre a célula linfocitária e a outra. Esta adesão é feita por moléculas membranares que interagem com complexo peptídeo- MHC. Ligação de moléculas membranares dos LT às de outras células. ↑ Distância intercelular. Activação. ↑ Distância intercelular. Separação celular. ITAM (transdução do sinal) Resíduos de Ácido Aspártico que interage com TCR COOH NH2 NH2 COOH – S-S – 31 Complexo Ternário TCR + MHC + Peptídeo antigénico Epitopo2 + Agretopo3 → Paratopo1 (na região variável do Ac) MHC próprio – Alogénico. MHC estranho – Aloantigénico. Aloreactividade dos LT: explicada pela reactividade cruzada dos TCRs com MHC estranho, apesar de serem específicos para um determinado MHC próprio. 1 3 2 TCR MHC 32 Maturação, activação e diferenciação dos Linfócitos (Cap. X) 1. Maturação No timo. Envolve rearranjos dos genes TCR e expressão de vários marcadores de membrana. Selecção + : preservação apenas dos linfócitos que reconhecem MHC próprio. Selecção - : eliminação dos linfócitos que têm demasiada afinidade para com MHC próprio, que reagem contra ele. Fase 1 – células duplamente negativas (DN): o LT ainda não tem TCR nem outras moléculas de membrana, como CD4 ou CD8, pois ainda não sofreram rearranjos nos genes TCR (ainda não houve a expressão das proteínas necessárias ao rearranjo – RAG1, RAG2). o LT vão alterando o seu fenótipo devido às mudanças ao nível da membrana. o C-Kit: receptor para o factor de crescimento. o DN: cadeia β + cadeia pré-α + CD3. DN transmite um sinal através do CD3 que activa C-Kit que pára os rearranjos na cadeia β e amplifica os na cadeia α. Fase 2 – células duplamente positivas (DP). o DP: cadeia β + cadeia α + CD3 o Células também já expressam CD4/CD8 por proliferação dos DP. No timo, a selecção positiva e a negativa fazem-se por interacção com as células APC e com as do estroma que têm MHC I e II. Selecção positiva (protecção) No córtex. Interacção dos timócitos com as células epiteliais do córtex. LT recebem sinal protector que impede a apoptose. Rearranjos na cadeia α do TCR. Sobrevivem só as células que se ligam às moléculas de MHC próprio. Selecção negativa (eliminação) Na medula do timo. Interacção dos timócitos com APC. Eliminação de células com elevada afinidade para com MHC próprio ou MHC próprio + Ag. Hipóteses explicativas para as selecções: Hipótese da avidez: apenas os TCR que se ligam às moléculas MHC com ligações fracas sobrevivem. Os factores de escolha são se se ligam ou não e a avidez dessa ligação. Hipótese da sinalização diferenciada: o TCR emite um sinal quando se liga ao complexo MHC-peptídeo. Só os timócitos que enviam um sinal sobrevivem na selecção positiva; só os timócitos que enviam um sinal parcial (a revelar numa ligação fraca) sobrevivem na selecção negativa; os que enviam um sinal completo (ligação forte) são eliminados. TCR 33 Como se originam linfócitos Tc e Th a partir de células DP? Modelo instrucional: o sinal produzido por (TCR+MHC II+CD4) ≠ (TCR+MHC I+ CD8). Ligações diferentes → sinais diferentes. Modelo Stochestic: a expressão de um dos COs é desligada aleatoriamente, sobrevivendo apenas os timócitos cujo TCR e cujo co-receptor continuem a reconhecer a mesma classe de MHC. 2. Activação Exemplo: activação de Th. 1) Interacçao do TCR com MHC II ligada a peptídeos antigénicos (ligação estabilizada por moléculas membranares que aproximam as duas células). 2) Como se inicia o processo de sinalização? Fyn (cauda citoplasmática do TCR) e Lick (domínio intracelular do co-receptor), tirosinas cinases, associam-se ao complexo TCR-CD3. Fyn e Lick fosforilam ITAM, presente na cauda citoplasmática de CD3. São reguladas por fosforilaçao em 2 sítios, um de activação com outro de inactivação. 3) Transdução do sinal efectuado por CD3 acoplado ao TCR. Receptores. Segundos mensageiros. Proteínas ligases e fosfatases. Componentes essenciais. Cascatas Proteína G Imunossupressores: inibem a activação do linfócito, levando a uma diminuição da resposta imunitária. Contêm cicloesporina A e FK506. A activação de linfócitos-T requer 2 sinais: Sinal 1 (TCR+CD3+Ag+MHC) – já descrito: interacção do peptídeo antigénico com o complexo TCR-CD3. Sinal 2 (CD28+B7) – não é específico para o Ag. Gerado pela alteração de CD28 no LT e membros da família B7 em APC. B7: o 1 domínio variável + 1 domínio constante. o Existem dois tipos que variam essencialmente nos domínios citosólicos. o Nos macrófagos, linfócitos-B, células dendríticas. o CD28 – activador → sinal có-estimulatório (+). o CTLA4 – inibidor → sinal có-estimulatório (–). o Induz produção de IL-2 e a proliferação linfocitária. O reconhecimento efectuado pelos linfócitos-T resulta em (dependendo da presença/ausência do sinal có-estimulatório de B7): Activação e expansão clonal. Anergia clonal: estado de não resposta, incapacidade de as células proliferarem em resposta ao complexo peptídeo-TCR. Progressão do ciclo celular + Activação de 3 categorias de genes: Genes imediatos (codificam factores de transcrição). Genes rápidos (codificam receptores celulares). Genes tardios (codificam proteínas de adesão). 34 2.1. Activação Policlonal por Superantigénios São proteínas virais ou bacterianas que se ligam ao domínio Vβ de TCR e à cadeia α de MHC. Ligam-se noutro sitio que não o de ligação, por isso qualquer linfócito-T que expresse uma cadeia Vβ com uma sequência específica vai ser activado pelo determinado Ag → Activaçao policlonal. Pode conduzir a uma reacção massiva contra os Ags → sobre produção de citocinas → toxicidade sistémica (ex: intoxicação alimentar) Induzem selecção negativa (–) de todos os LT que se liguem a ele, influenciando a maturação. Superantigénios endógenos: proteínas codificadas por vírus que infectam as células. Superantigénios exógenos: proteínas secretadas por bactérias. 2.2. Recirculação LT naive circulam entre o sangue e a linfa. Timo → linfa → gânglios linfáticos → sangue → linfa → Timo (quando não há activação). A recirculação constante aumenta a probabilidade dos LT encontrarem os Ag para os quais são específicos e serem então activados. Existem duas vezes mais CD4 + (Lth) que CD8 + (Ltc) em casos normais. Num sistema imunodeprimido, CD8 > CD4. Linfócitos-T γS: Ligam epitopos de modo semelhante aos Ac. Têm função na mediação da lise celular tumoral de modo não restritivo a MHC e respondem a um Ag microbacteriano chamado PPD → grupo de proteínas heat-shock que aumentam quando aumenta a temperatura ou há resposta inflamatória a infecções virais. Presente dos epitélios, são a 1ª Linha de Defesa contra a propagação do cancro ou infecção viral. 35 Factores de transcrição: E2A, EBP, BSAP Selecção negativa (90% dos linfócitos eliminados) Geração, activação e diferenciação dos Linfócitos-B (Cap. XI) Maturação Estado embrionário: na medula óssea, no saco vitelino, no fígado. Resto da vida: na medula óssea. Células estaminais (stem cells) Células B progenitoras (pro-B cells): marcadoras na superfície celular – CD45R (tirosina fosfatase), Ig-α, Ig-β, CD19, CD43, CD24, C-Kit. Proliferam na medula óssea, onde existe um microambiente criado pelas células do estroma. A interacção destas células com os linfócitos-B faz- se por moléculas de adesão celular. VLA-4 em pro-B cells e VCAM-1 em células do estroma. Após interacção inicial, receptor de células progenitoras – C-Kit – liga-se a SCF (stem cells factor). C-Kit – SCF → Activaçao de C-Kit → células B expressam receptor para IL7. Células B precursoras (pré-B cells): IL-7 (citocina secretada pelas células do estroma) induz a regulação (↓) das moléculas de adesão → libertação das pré-B cells das células do estroma. Tem marcadores da superfície celular: Ig-α, Ig-β, CD19, CD24, CD25, pré-BCR. Pré-BCR A pré-cadeia α de um receptor de linfócitos-B é associado a uma Surrogate Light Chain. Este complexo, quando associado a Ig-α ou Ig-β constitui pré-BCR. Pré-cadeia α + Surrogate Light Chain + Ig-α/Ig-β → pré-BCR. Só as células que apresentam pré-BCR podem prosseguir maturação. Cada pré-B cell com pré-BCR multiplica-se em 32/64 células-filha. Cada uma tem arranjos nas cadeias leves, o que aumenta a diversidade. Linfócitos-B imaturos: surge Ig de superfície. Não há expressão de CD25 nem de pré-BCR. Linfócitos-B naive: exportados para a periferia. IgD associa-se à IgM da superfície membranar. SubpopulaçõesB1 e B2 B1 com o marcador CD45; em pequenas quantidades nos órgãos linfóides secundários mas muito presente no peritoneu; pouca variedade → baixa afinidade; liga-se pouco a Ag peptídeos, mas liga-se a Ag com hidratos de carbono. B2 a mais comum. 36 Activação Após exportação de linfócitos-B para a periferia ocorre activação, proliferação e diferenciação. Todas estas fases de desenvolvimento requerem Ags, caso contrário, as células morrem em poucas semanas por apoptose. Dependendo da natureza do Ag, a activação dos linfócitos-B processa-se dependente/independentemente de linfócitos Th. A resposta de linfócitos-B a Ag TD (timo-dependentes) requer contacto directo com linfócitos-T. Ag que dispensam este contacto são TI (timo-independentes). TI 1: funcionam com alguns componentes da parede bacteriana (LPS). Activa LB independentemente da sua especificidade. TI 2: moléculas altamente repetitivas, com proteínas poliméricas. Necessitam de citocinas para activação de LB. A resposta desencadeada por AgTI ≠ da de AgTD. A primeira é mais fraca, não se formam células memória e IgM é o tipo de Ac mais predominante. Origem dos sinais de activação/transdução: 1) Ligação Ag-Linfócito-B naive inicia transdução do sinal. 2) Igs de membrana têm cauda citoplasmática curta, a transdução tem de ser feita pela associação a um complexo Igα/Igβ, formando-se BCR. 3) Fosforilação do ITAM, presente na cauda citoplasmática da nIg. 4) Activação de proteína cinase SRC. 5) Desfosforilação de SCR por CD45. 6) Alteração da expressão génica. No linfócito-T, B7 estava no comando dos sinais estimulatórios, sendo activada por CD28 e inibida por CTLA-4. No linfócito-B são B-cell correceptors que têm essa função. As B-cell correceptors são um complexo de 3 proteínas – CD19, CD21 (receptor C3d, do factor complemento) e CD81 – que serve para amplificar o sinal transmitido através do BCR. Juntamente com o B-cell correceptor, existe CD22, que produz um sinal inibitório em células B em repouso, tornando a activação mais difícil. Ainda assim, linfócitos-B naive expressam nIg com baixa afinidade para as Ag, mas que são capazes de reagir com baixas concentrações de Ag. Os linfócitos-B naive estão em fase G0. A activação desencadeia o ciclo celular que, na passagem até à fase S, origina dois sinais: Sinal 1 – ligação dos mIg ao Ag, processado por via endocítica e ligação do produto a BCR. Sinal 2 – CD40L-CD40 Quando Th reconhece um Ag associado a MHC II num linfócito-B, forma-se um T-B conjugate. Os linfócitos Th têm o aparelho de Golgi virado na direcção dos linfócitos-B, o que facilita a libertação de citocinas na sua direcção. A interacção induz a expressão de CD40L nos Th, que interage com CD40 nos B. Sinal 1 + Sinal 2 → avanço do ciclo celular até G1. Uma vez activado, o linfócito-B expressa receptores para várias citocinas – IL2, IL4, IL5 – que sustentam o processo de proliferação, de diferenciação: Formação de plasmócitos. Formação de células memória. Mudança de classe (mudança de isótopo no Ac produzido). Maturação por afinidade (avanço progressivo de afinidade pelo Ac ao longo da activação). 37 Diferenciação (resposta humoral) O 1º contacto de um Ag exógeno com um indivíduo dá origem a uma resposta humoral primária → plasmócitos + células memória. Resposta primária (IgM) Lag phase – células B naive sujeitas a selecção clonal, expansão clonal e diferenciação em plasmócitos e células memória. Aumento logarítmico do nível sérico de Ac, atingindo valor máximo, estabilizando e voltando a descer. As células memória param a divisão em G0 e têm tempo de vida variável. A capacidade de desenvolver uma resposta humoral secundária depende da existência de células memória B e T. Resposta secundária (IgD) Lag phase – mais curto, resposta mais rápida. Maior intensidade. Maior duração. Secreção de Ac com maior afinidade para Ag. Predominância de outros isotipos que não IgM. A resposta é mais rápida e de maior amplitude, pois a população de células memória para um dado Ag é muito maior que a de linfócitos-B naive. Resposta humoral a Hapten-Carrier Conjugates Quando um animal é imunizado com um hapteno e um transportador (é necessária esta associação), são produzidos Ac contra o hapteno e contra o transportador. A resposta humoral requer que sejam reconhecidos diferentes epitopos no mesmo Ag pelos linfócitos Th e B. Se é usado um transportador que não seja específico para o hapteno em causa, não ocorre resposta secundária → Efeito do Transportador. Assim sendo, conclui-se que tanto os linfócitos Th como os B têm de reconhecer epitopos de uma mesma molécula para que surta a activação dos linfócitos-B → Reconhecimento Associativo. Após a activação, alguns linfócitos-B e T migram para folículos primários, que então se desenvolvem em folículos secundários. Aí, há um microambiente favorável à interacção entre os linfócitos e as células dendríticas: Têm grandes extensões com receptores para a porção Fc dos Ac → complexos Ag-Ac importantes na resposta secundária. Libertam pequenas partículas revestidas com células imunes – Iccossomas. Durante a resposta secundária, estes iccossomas são libertados e ligados à nIg nos linfócitos-B, que tenham especificidade para esses complexos imunes, sendo depois fagocitados. 38 Diferenciação nos centros germinativos Linfócitos B activados em proliferação Centroblastos: grande tamanho, citoplasma expandido, cromatina difusa, falta de nIg Centrócitos: com mIg; movem-se da zona escura para a zona clara, onde contactam com Ag apresentados pelas células dendríticas e com linfócitos-T Células B memória Plasmoblastos: migram para medula do gânglio linfático → Plasmócitos A maioria dos centrócitos não se consegue ligar aos Ags apresentados pelas células foliculares dendríticas, morrendo por apoptose e sendo fagocitado por macrófagos. Ao longo do processo de diferenciação nos centros germinativos ocorre: A – Mudança de classe. B – Maturação por afinidade. Tendo como resultado final a formação de células memória e plasmócitos. As células memória, a não ser pelas mIg, não se distinguem de linfócitos-B naive pelas moléculas de membrana. Como sofreram mudança de classe, apresentam todos os isotipos de mIg. Os plasmócitos não têm mIg e secretam Ac. A – Mudança de classe: este processo permite que a especificidade do Ac se mantenha constante (preservação do domínio V), podendo o isotipo adaptar-se às suas funções. Na resposta humoral a Ag TD, há extensas mudanças de classe. Na resposta humoral a Ag TI, predomina IgM. Para que ocorra este processo é preciso a interacção entre CD40L-CD40. B – Maturação por afinidade: fenómeno originado essencialmente por hipermaturação somática, que gera alterações nas regiões variáveis das mIg. A selecção das Ig é feita por Ag. É escolhido o Ac que tiver mais afinidade para com o Ag em questão. As mutações geram BCR de baixa afinidade e de alta afinidade e as primeiras são eliminadas por selecção negativa, isto na zona clara. Factores que determinam o tipo de selecção: Só o sinal gerado pela interacção dos linfócitos-B com os Th (CD40L-CD40) permite que os linfócitos-B sobrevivam e prossigam o ciclo celular, diferenciação. Só os linfócitos-B cuja B7 e Ag apresentado às MHC II interajam com o CD28 e TCR dos linfócitos Th sobrevivem. Só os centrócitos que se ligam bem aos Ags apresentados pelas FDC transmitem outro sinal que lhes permite sobreviver.
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