imunofluorescencia e quimioluminescencia

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Componente Curricular: Imunologia Clínica
Professor: Ilo Odilon Villa Dias
Acadêmicas: Dandara Backes e 
Taís Cristina Vivian
Técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em
suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados
com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta (UV) e a emitem após os
fluorocromos serem excitados por um determinado comprimento de onda, de modo
que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência.
Os fluorocromos são moléculas capazes de absorver a energia UV e emitir
parte desta num comprimento de onda visível aos olhos. Os fluorocromos mais
utilizados são:
Fluresceína (FITC);
Rodamina (TRICT).
ANTÍGENO: é qualquer molécula que induza uma resposta
imunológica;
ANTICORPO: é a resposta gerada pelo sistema imunológico
para combater ou neutralizar os antígenos.
o Pode ser imunofluorescência direta
(pesquisa de antígenos); ou
o Imunofluorescência indireta (pesquisa
de antígenos e/ou anticorpos).
Conhecida como técnica de camada simples, utilizada para detecção de
antígenos em amostras clínicas utilizando-se anticorpos marcados com
fluorocromos.
As etapas compreendem:
Fixação do esfregaço da lâmina;
Tratamento com anticorpo marcado;
Incubação;
Lavagem para remover excesso de
anticorpos marcados não ligados;
Visualização no microscópio fluorescente.
 Detecção direta de
microrganismos (secreções, urina,
cortes de tecidos);
 Identificação de subpopulações
de linfócitos;
 Fenotipagem de células tumorais.
 Detecção de Chlamydia
trachomatis em secreção
uretral.
• VANTAGENS
♦Alta especificidade e sensibilidade;
♦Avaliação da qualidade e adequação da amostra;
♦Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização;
• DESVANTAGENS
♦Necessidade de um conjugado para cada antígeno a ser identificado;
♦ Inadequado para processar grande número de amostras;
♦Alto custo do microscópio de fluorescência;
♦Subjetividade da leitura;
Conhecida como técnica de dupla camada;
Utilizada na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos
fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não
fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada
contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.
Pesquisa de Antígenos:
 Incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo
específico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a formação de um
imunocomplexo;
 Realização de lavagem, para retirada do excesso de
anticorpos monoclonais;
 Após a lavagem, a preparação é incubada com
anticorpos marcados com fluorocromos, especifico
para o anticorpo monoclonal;
 É realizada uma nova lavagem para retirada de
excessos;
 Visualização no microscópio fluorescente.
Pesquisa de Anticorpos:
 Antígenos, para a patologia a ser analisada, são fixados a lâminas de vidro;
 O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação
do complexo antígeno-anticorpo (caso exista anticorpos para a patologia no soro do
paciente);
 Realiza-se uma lavagem para a retirada de excessos;
 Após lavagens, a preparação é incubada com o
conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro,
o conjugado reage com o anticorpo específico para o
antígeno;
 Realiza-se mais uma lavagem;
 Visualização no microscópio fluorescente.
⃰ AIDS, Hepatites, e doenças 
autoimunes;
⃰ Toxoplasmose
⃰ Raiva
⃰ Leishmaniose 
⃰ Criptosporidíase
⃰ Estrongiloidíase
⃰ Giardíase 
Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) 
positiva mostrando formas 
promastigotas de Leishmania marcadas pela 
fluorescência. 
Anticorpos anti músculo liso 
observados por imunofluorescência
indireta, envolvendo fibras de músculo 
liso de vasos sanguíneos.
Reação de Imunofluorescência Indireta 
(RIFI - IgM) positiva, com corte parafinado 
de Schistosoma mansoni.
As células endoteliais sob o microscópio. Os núcleos são 
marcados de azul com DAPI, os microtúbulos são marcados 
de verde por um anticorpo ligado ao FITC e os filamentos de 
actina são rotulados em vermelho com a faloidina ligada ao 
TRITC. Células endoteliais da artéria pulmonar bovina (BPAE)
• VANTAGENS
♦ De simples padronização e execução;
♦ Sensibilidade, Especificidade, Reprodutibilidade;
♦ O mesmo conjugado pode ser utilizado em sistemas diferentes;
♦ Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados
conjugados específicos.
• DESVANTAGENS
♦ Necessidade de microscópio de fluorescência;
♦ Subjetividade da leitura;
♦ Não-automação;
É um tipo de reação química que gera energia luminosa. Durante a reação,
os reagentes se transformam em estados excitados, e ao passarem para um
estado de menor excitação, liberam a energia absorvida na forma de luz.
Quando em contato com o sangue, por exemplo, utiliza o ferro da
hemoglobina como catalisador para a reação de liberação de luz. Esse composto
é muito usado em perícia criminal, quando se quer investigar a presença de
vestígios de sangue em uma cena de crime. Mesmo que o local tenha sido limpo,
o luminol evidencia a presença do sangue.
 É uma técnica que quantifica antígeno ou anticorpo em fluidos corporais.
 Muito usado para dosagens de hormônios, marcadores tumorais e outras
proteínas séricas.
 Um dos métodos de escolha para substituir o radioimunoensaio.
COMPOSTOS UTILIZADOS:
Luminol: *Necessita de uma catalisador
*Apresenta uma serie de interferências de fundo ao emitir sua luz;
*Reação lenta e gradual;
*Dependente de pH.
Ésteres de Acridina: *Não requer um catalisador;
*Baixa interferências de fundo;
*Muito estável, grande vida media;
*Alto rendimento;
*Tempo de reação rápido – medição mais fácil;
*A conjugação não limita o rendimento;
*Alta sensibilidade.
APLICAÇÕES:
 métodos para a reação em cadeia da polimerase
 óxidos de nitrogênio, compostos de enxofre
 determinação de espécies inorgânicas
 ondas para a dosagem de DNA
 técnicas de imunoensaio
 Laboratorialmente, hormônios, drogas e microorganismos podem ser
identificados por testes colorimétricos. Tais métodos utilizam-se de
anticorpos ligados a um marcador luminescente (cromógeno) que
pode ser o próprio luminol ou mais modernamente derivados de
acridina.
Quando em contato com o sangue, por exemplo, utiliza o ferro da
hemoglobina como catalisador para a reação de liberação de luz.
Esse composto é muito usado 
em perícia criminal, quando se 
quer investigar a presença de 
vestígios de sangue em uma 
cena de crime. 
Mesmo que o local tenha sido limpo, o luminol evidencia a 
presença do sangue.
• VANTAGENS:
 Ensaio com elevada sensibilidade e especificidade adequada;
 Exame basicamente automatizado e rápido;
 Várias amostras podem ser analisados e distintas moléculas podem
ser quantificadas de uma só vez.
A técnica se baseia na ligação de antígeno-anticorpos. Um dos dois
reagentes é conjugado e uma substancia que, quando ativada, emite luz
visível. Então, a emissão de luz é proporcional ao reagente pesquisado.