Aglutinação: Princípio e Metodologias

Prévia do material em texto

1º Bimestre, Aula 4 (11.03)
EAD 1, Aula 5 (29.04)
Imunodiagnostico
Aglutinacao
Princípio: A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos 
específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície (epítopos).
▪
Podem ser usados de maneira quantitativa para investigar a presença de um antígeno ou um anticorpo.▪
1º estágio: Começa após a mistura das partículas recobertas pelo Ag com os Ac, ocorrendo ligação não-covalente.▫
2º estágio: Ocorre simultaneamente ao primeiro e resulta na colisão que ocorre entre outras partículas, de modo que os Ac 
ligados a uma partícula se ligam ao determinante antigênico de outra, estabelecendo pontes entre partículas e formando 
agregados maiores e visíveis a olho nu (imunocomplexos). Quanto maior o agregado, mais visível o resultado do teste vai ser.
▫
Ocorrem em dois estágios simultaneamente: ▪
Com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, vírus).▫
Com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita e etc, sensibilizadas com Ag ou Ac).▫
Com células antigênicamente não relacionadas às quais se adsorvem ou se fixam a antígenos solúveis (hemácias, bactérias).▫
A aglutinação pode ocorrer de três formas:▪
Título: Maior diluição que ainda causa aglutinação (semiquantitativo).▫
Efeito pró-zona: Excesso de anticorpos em relação ao antígeno, formando pequenos imunocomplexos que não são visíveis nos 
testes de aglutinação, podendo resultar em falso-negativo. Para evitar que isso aconteça, se faz uma diluição da amostra.
▫
Potencial zeta: Algumas partículas podem apresentar cargas elétricas iguais, causando repulsão, podendo comprometer a 
formação de imunocomplexos, podendo causar falso negativo. Coloca solução fisiológica e neutraliza, favorecendo a agregação.
▫
Ac-Ag multivalente: Anticorpo precisa ser multivalente e o antígeno precisa ter muitos epítopos. ▪
Classe do anticorpo envolvido. IgM é um pentâmero, formando reação mais forte e agregados maiores, mais visíveis a olho nu.▫
Concentração iônica e pH do meio (que pode desestabilizar o anticorpo ou antígeno);▫
Presença de macromoléculas, íons, enzimas e conservantes;▫
Tempo e temperatura. IgG reage melhor em temperatura de 37°, enquanto IgM reagem melhor no frio;▫
Concentração ótima de antígeno ou Ac a ser fixado nas micropartículas ou células;▫
Estabilidade da ligação do Ag/Ac e acessibilidade dessa molécula nas micropartículas ou células (existem antígenos inacessíveis ao 
anticorpo, podendo ocorrer falso-negativo).
▫
Fatores que influenciam a formação dos agregados:▪
Vantagens: Baixo custo; boa sensibilidade; leitura visual; facilidade de execução.▪
Desvantagens: Reprodutibilidade dos lotes de reagentes (o transporte pode causar degradação das hemácias); acessibilidade 
molecular para interação Ag-Ac; estabilidade da ligação do Ag/Ac no suporte.
▪
Aglutinacao direta
Utiliza-se partículas antigênicas insolúveis na forma íntegra ou fragmentada, como hemácias, fungos, bactérias, protozoários. Podem ser 
aglutinados diretamente por anticorpo, formando imunocomplexos.
▪
Aglutinação direta com hemácias como antígeno: Tipagem do sistema ABO e Rh; reação de Paul-Bunnel-Davidson (usado para 
diagnosticar mononucleose infecciosa, onde se produz IgM inespecíficos ao vírus em elevadas concentrações, que reagem contra 
antígenos eritrocitários de boi, cavalo e carneiro); pesquisa de anemias autoimunes (produz anticorpos contra as próprias hemácias).
▪
Widal (salmoneloses); Wright (bruceloses); Weil Felix (rickettsioses).▫
Aglutinação direta com antígenos íntegros ou fragmentados de bactérias, espiroquetas e protozoários para pesquisa de 
anticorpos. Se usa o microrganismo para saber se tem anticorpos na amostra do paciente.
▪
Metodologias: Tubos, podendo utilizar diluição seriada; placas; lâminas.▪
Aglutinacao indireta
Emprega a adsorção de anticorpos ou antígenos proteicos solúveis na superfície de micropartículas inertes de suporte que não 
interferem na interação Ag Ac.
▪
(4) Imunodiagnóstico [1º BIM]
 Página 1 de Imunologia Clínica 
interferem na interação Ag Ac.
Exemplos de micropartículas de suporte incluem plástico, gelatina, carvão, hemácias formolizadas e titanizadas de aves e carneiro e 
micropartículas de poliestireno/látex.
▪
Suporte com o antígeno adsorvido são utilizados na pesquisa de anticorpos específicos. Já o suporte com o anticorpo adsorvido também 
é chamado de aglutinação reversa.
▪
Semi quantitativo como proteína C reativa (anticorpo adsorvido no látex para pesquisa do antígeno PCR); pesquisa de antígenos 
bacterianos em LCR (a concentração de bactérias pode ser muito pequena, de forma que o látex ajuda a visualização e aumenta a
sensibilidade, permitindo a visualização de partículas solúveis como hormônios); pesquisa de antígenos virais em fezes; pesquisa de 
gonadotrofina coriônica.
▪
Hemaglutinacao indireta
Hemácias são usadas como suporte para o antígeno. É utilizado na detecção de anticorpos contra Treponema pallidum, Trypanossoma 
cruzi, Toxoplasma gondii, etc. O teste detecta anticorpos da classe IgM e IgG, mas não consegue diferenciá-los.
▪
No kit, se vem o antígeno desses microrganismos adsorvidos na hemácia. No teste positivo, observa-se a formação de um manto 
formado pelo complexo Ag-Ac. No teste negativo, observa-se o deposito de hemácias ao fundo do poço.
▪
As hemácias de ave são utilizados no teste de hemoaglutinação indireta porque possuem núcleos, diferente dos mamíferos, de forma 
que são mais pesadas, fazendo com que o processo de sedimentação seja rápida e eficaz. Quando não ocorre reação, fica parecendo 
um borrão e se depositaram no fundo do poço (ponto pequeno), demorando em torno de 1 ou 2h.
▪
Inibicao da aglutinacao direta ou hemaglutinacao indireta
Teste positivo: Inibição da aglutinação. Os anticorpos, se presentes na amostra, se ligam às partículas virais, resultando na 
inibição da hemaglutinação, porque os antígenos virais estão indisponíveis. 
▫
Teste negativo: Se não tiver anticorpo, ocorre hemaglutinação.▫
Baseado na capacidade de alguns antígenos virais de aglutinarem espontaneamente determinados tipos de hemácias. O princípio do 
teste é colocar antígenos virais em contato com o soro humano.
▪
(1) Incubação do soro em diluições seriadas com a solução antigênica em [ ] padronizadas. ▫
(2) Adição da suspenção de hemácias adequadas para a hemaglutinina viral, seguida de incubação. A presença de Ac específicos 
no soro do paciente para o Ag do teste forma imunocomplexos e impede que o antígeno desempenhe a característica de aglutinar 
as hemácias.
▫
O teste ocorre em duas etapas:▪
Utilizado na detecção de anticorpo contra os vírus do enterovírus, influenza, rubéola e sarampo.▪
Uma das limitações é que não permite a distinção entre IgM e IgG.▪
Inibicao da aglutinacao indireta
O teste consiste na adição de anticorpos à amostra contendo antígenos solúveis visando o bloqueio dos respectivos sítios de l igação. 
Quando a amostra é colocada em contato com partículas sensibilizadas com o mesmo antígeno, a aglutinação não é observada.
▪
Resultado positivo (presença de hCG na urina): Não ocorre aglutinação. Anticorpo se ligaram no hCG da urina (ficando 
bloqueados), na incubação inicial.
▫
Resultado negativo (ausência de hCG na urina): Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti β-hCG não são bloqueados na 
incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de β-hCG.
▫
Hormônio β-hCG é um marcador que na mulher indica gestação e no homem indica tumor.▫
Urina + soro anti β-hCG são incubados e colocados numa placa. Adicionam-se partículas de látex revestidas com β-hCG.▪
Floculacao
Variante da aglutinação indireta.▪
Ocorre quando a interação indireta de anticorpos específicos leva à formação de imunocomplexos em meio líquido. É detectável com o 
auxílio de lupa ou microscópio.▪
VDRL para sífilis: Utiliza uma suspensão alcoólica de cardiolipina (fosfolipídeo de membrana liberado na inflamação), cristais de 
 Página 2 de Imunologia Clínica 
Teste de triagem, não treponêmico, com ↑ sensibilidade e ↓ especificidade, podendo dar falso positivo em doenças autoimunes. ▫
O teste não treponêmico (ELISA, hemaglutinação, imunofluorescência indireta) é específico na pesquisa de anticorpos para sífilis.▫
VDRL para sífilis: Utiliza uma suspensão alcoólica de cardiolipina (fosfolipídeo de membrana liberado na inflamação), cristais de 
colesterol e lecitina, que reagem com anticorpo anticardiolipina presentes na amostra de soro. Os imunocomplexos formados ficam 
depositados sobre os cristais de colesterol que é refringente, formando grumos visíveis no microscópio. Se usa a placa de Kline.
▪
Imunoensaios utilizando conjugados
Método altamente sensível, empregando conjugados (moléculas marcadas com compostos químicos ligantes ou marcadores), 
favorecendo a sensibilidade dos testes.
▪
Conjugados: Substâncias químicas ligadas covalentemente a uma molécula, preservando as funções das duas partes. A molécula 
conjugada pode ser proteínas, antígenos derivados de patógenos, hormônios, marcadores tumorais, marcadores celulares ou 
imunoglobulinas.
▪
Substâncias químicas e sistema de revelação: Substâncias químicas que podem marcar as moléculas conjugadas. Incluem 
radioisótopos (radiação); fluorocromos (fluorescência); substâncias luminescentes biológicas ou químicas (luminescência); enz imas com 
substratos cromogênicos (imunoenzimáticos como ELISA); enzimas com substratos fluorogênicos (fluorimetria); enzimas com substratos 
luminescentes (quimioluminescência; sensibilidade analítica um pouco maior que dos outros). 
▪
(1) Imunofluorescencia
Técnica trabalhosa e cara.▪
Ag ou Ac + fluorocromos = conjugado + luz UV = conjugado fluoresce
Princípio: Utiliza como molécula reveladora um fluorocromo, que vai ser ligado ao antígeno ou anticorpo, dependendo do objetivo do 
teste. O conjugado fluoresce ao ser empregado a luz UV. Se utiliza o microscópio de fluorescência.
▪
Os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos incluem: Isotiocianato de fluoresceína (FITC), o mais usado em laboratório 
clínico, emitindo fluorescência verde; compostos da rodamina; vermelho Texas; Ficoeritrina. 
▫
Fluorocromos: Substâncias que absorvem a luz UV empregada pelo microscópio, com comprimento de onda baixo e elevada energia. 
O fluorocromo emite a fluorescência em comprimento de onda maior com baixa energia. 
▪
Microscópio de fluorescência com epiluminação: Tem acessório responsável por emitir a fluorescência, tendo refletor de luz UV. A 
luz UV chega à lâmina, excitando o fluorocromo, que vai emitir a fluorescência que chega ao observador e permite a visualização. Tem 
um filtro de absorção de calor.
▪
Vantagens: Sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade.▪
Desvantagens: Necessidade de microscópio de fluorescência, subjetividade na leitura e não-automação.▪
Ex: IMUNOCRUZI® → Ag de Trypanosoma cruzi liofilizado obtivo por cultivo em meio de LIT vem fixado na lâmina. Se coloca a amostra do 
paciente nos poços, com finalidade de pesquisar o anticorpo.
▫
Lâminas para imunofluorescência: Na lâmina, terá fixado um antígeno comercial ou será pesquisado o antígeno em um material 
coletado do paciente.
▪
Anticorpos marcados, obtidos de preparações purificadas com elevada especificidade. Anti-soro (anti IgG ou anti IgM) pode ser 
obtido em espécie heteróloga (carneiro, cobra), purificado e conjugado/marcado com a substância fluorescente (fluorocromo).
▫
Antígenos comerciais ou amostras fixados à lâmina de microscopia, que deve ser de sílica.▫
Glicerina alcalina com pH 8,5 para determinar a máxima intensidade de emissão de fluorescência. A intensidade da luz emitida 
depende do pH final que o teste estará e por isso a lâmina é coberta com glicerina alcalina e a lamínula. 
▫
Azul de Evans ou vermelho Congo, corantes que facilitam a visualização da fluorescência.▫
Reagentes utilizados em imunofluorescência: ▪
Ex: Conjugado em que a globulina de carneiro anti IgG humana é marcada com Ficoeritrina. ▫
Determinação da classe do anticorpo: Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar, sendo importante para 
saber qual é o estágio da doença. Se quero pesquisar IgM na amostra do paciente, uso um anti IgM marcado com o fluorocromo.
▪
Imunofluorescencia direta
Objetivo: Detecção de antígeno diretamente em células de tecidos ou no soro.▪
Utiliza anticorpos específicos para o determinado antígeno, marcados com fluorocromos (conjugado). Geralmente se usa o IgG, mas 
 Página 3 de Imunologia Clínica 
Utiliza anticorpos específicos para o determinado antígeno, marcados com fluorocromos (conjugado). Geralmente se usa o IgG, mas 
tanto faz o anticorpo usado, já que se pesquisa o antígeno.
▪
Se a amostra do paciente tiver aquele determinado antígeno, o anticorpo conjugado consegue se ligar. Na presença de luz UV, o
conjugado é excitado e emite a fluorescência, sendo possível visualizar o complexo antígeno-anticorpo.
▪
Aplicações: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecido, etc. Também é utilizada na 
fenotipagem de células tumorais, pesquisando o antígeno tumoral. 
▪
Vantagens: Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.▪
Desvantagens: Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar.▪
Imunofluorescencia indireta
Objetivo: Detecção de anticorpo na amostra do paciente.▪
Utiliza um anticorpo anti-imunoglobulina marcado com fluorocromo para detecção de anticorpos específicos na amostra do paciente, 
estes que se fixaram em antígenos celulares ou particulados. 
▪
A especificidade de conjugado permite identificar diferentes classes de imunoglobulinas. ▪
O antígeno vem fixado e liofilizado na lâmina, fazendo parte do teste. Depois de colocar a amostra, adiciona-se o conjugado anti 
anticorpo (anti IgG ou anti IgM) ligado ao fluorocromo. Se na amostra do paciente tiver anticorpo, este irá se ligar ao antígeno e quando 
colocar o conjugado, ele irá se ligar ao anticorpo da amostra. Se faz lavagens para retirar os anticorpos inespecíficos que não se ligaram 
ao antígeno fixado na lâmina.
▪
O anti anticorpo reage com a porção Fc do anticorpo da amostra, de forma que a especificidade está na porção Fab deste anti anticorpo.▪
Aplicações: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como Doenças de Chagas, HIV, hepatites, sífilis (teste treponêmico, 
sendo um teste confirmatório), complexos em doenças autoimunes como lúpus, etc.
▪
(2) Radioimunoensaio
Primeiro imunoensaio realizado e o primeiro a dosar insulina.▪
O conjugado é composto por Ag ou Ac ligado aos radioisótopos.▪
Os radioisótopos mais utilizados são o I-129, I-125, Co-57 e Cs-137. A radiação emitida por eles é medida com um contador de radiação 
gama.
▪
É um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo mesmo em preparações não purificadas.▪
Sensibilidade analítica: Apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas.▪
Aplicações: Quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos (RAST) e anticorpos/antígenos em doenças parasitárias.▪
Limitações do teste: Custo, vida média dos reagentes e risco operacional.▪
Teste competitivo com antígeno marcado: Usado quando quero pesquisar um determinado antígeno na amostra do paciente. 
No poço do teste, se tem um anticorpo fixado. É colocado nele, simultaneamente, a amostra e o conjugado (mesmo antígeno que 
estou pesquisando, marcado com o radioisótopo). Os antígenos estarão competindo pelo anticorpo fixo. Se na amostra tiver a 
presença do antígeno pesquisado em maior quantidade, estes se fixam no anticorpo. Após a lavagem de antígenos não fixados, se
mede a radioatividade. Quando a amostra apresente o antígeno, se tem ausência de radioatividade porque o conjugadonão se liga 
e é lavado. Se a amostra não apresentar o antígeno, o conjugado irá se ligar ao anticorpo e ao medir a radioatividade, esta será 
intensa. A radioatividade será inversamente proporcional à quantidade do analito na amostra. 
▫
Teste competitivo com anticorpo marcado: Se tem o antígeno na fase sólida fixado no poço. É adicionado a amostra e o 
anticorpo conjugado marcado com o radioisótopo. Se a amostra tiver o antígeno pesquisado, este antígeno se liga ao anticorpo e 
na lavagem, este antígeno ligado ao anticorpo vai embora por não estar fixo, e ao medir a radioatividade, esta será ausente. Se a 
amostra não apresentar o antígeno, o anticorpo marcado iria se ligar ao antígeno fixado e ao medir a radioatividade, esta será 
intensa. A radioatividade será inversamente proporcional à quantidade do analito na amostra. 
▫
Sanduíche para captura de antígeno: Se tem o anticorpo fixado na placa, colocando a amostra. Se a amostra tiver o antígeno 
pesquisado, este se liga ao anticorpo. Depois, faz a lavagem para retirar os anticorpos inespecíficos. É adicionado um segundo 
anticorpo específico marcado com radioisótopo, que irá se ligar ao anticorpo que se ligou ao antígeno, de forma que ao medir a 
radioatividade, esta será presente. É um teste com alta especificidade por ter dois anticorpos reagindo para o mesmo ou diferentes 
epítopos. A radioatividade será diretamente proporcional à quantidade do analito na amostra
▫
Princípios: ▪
 Página 4 de Imunologia Clínica 
 Página 5 de Imunologia Clínica