aula biotecnologia 2018 elisa.pptx

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ELISA
ensaio imunosorvente de enzima acoplada
Introdução
Tecnologia do ELISA
ELISA direto
https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisa-formats.html
Antígeno
Anticorpo com
enzima acoplada
Enzima
cromogênica
Rápido
Pouca margem de erro
Ruído 'alto
“Background” alto
Pouco flexível
Menos sensível
ELISA indireto
https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisa-formats.html
Anticorpo
primário
Anticorpo secundário com
enzima acoplada
Alta sensibilidade
Econômico
Muito flexível
Sujeito a ruído
Mais trabalhoso
ELISA sanduíche
https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisa-formats.html
Anticorpo
de captura
Anticorpo com
enzima acoplada
O mais sensível
O mais específico
Muito flexível
Mais complexo
Mais trabalhoso
ELISA de competição
Antígeno 
controle
bloqueio
Antígeno
desconhecido
Anticorpo 
secundário
Reação 
colorimétrica
https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisa-formats.html
Pode ser usado em amostras brutas
Muito reprodutível
Pode ser feito na forma direta ou sanduíche
Neste formato os anticorpos presentes na amostra competem e bloqueiam a ligação de um anticorpo específico associado à enzima cromogênica
A adição de um substrato cromogênenico faz com que a cor se desenvolva. 
Esta cor é inversamente proporcional à quantidade de anticorpo ligado. 
Quanto mais anticorpos presentes na amostra, menor é o desenvolvimento da cor nos poços de teste. 
ELISA de competição
Componentes do ELISA
Equipamento para o ELISA
Pipetas
• de canal único, de volume fixo e ajustável volume (1-20 ml,
10-100 uL, 20-200 uL, etc)
• Multicanal, de 8 e 12 canais
• Unidades Semi-automatizadas de distribuição
• sistemas totalmente automatizado que podem processar múltiplas placas
Sistemas de Lavagem de Placas
• Sistemas manuais que lavam uma linha ou coluna de cada vez
• Sistemas Semi-automatizados que lidam com uma faixa ou uma placa de cada vez
• sistemas totalmente automatizado que pode processar múltiplas placas
Pipeta monocanal
Pipeta multicanal
Unidade de lavagem de placas
Equipamento para o ELISA (cont.)
Leitor de placas de ELISA 
• Manuais, que lêem uma linha ou bem de cada vez
• Semi-automatizado que lê uma placa de cada vez
• sistemas totalmente automatizados que podem processar múltiplas placas simultaneamente
Leitor de placas de ELISA
Placa de ELISA
Planilha de Manutenção e Calibração
Diário
Semanal
Mensal
Quadrimestr.
Anual
Procedimento
Pipetas
Lavador de Placas
v
v
v
v
v
Leitor de Placas
Limpeza externa
Checar calibração
Limpar interior e “O-rings”
Passar água destilada no sistema
Checar “traps” e filtros
Checar agulhas de aspiração e distribuição para gotejamentos e sujeiras
Verifique os tubos e frascos para o crescimento microbiano
Descontaminação – passar álcool ou água sanitária no sistema
Checar calibração e purgar o sistema
Limpeza externa
Executado um "ciclo de limpeza" com água
Checar/ trocar tubulação
v
v
Checar
Trocar
Placa de calibração
Alinhamento de lâmpada
Limpar sistema ótico
Limpar exterior
Após troca de lâmpada
Manuseio de Reagentes e Preparação
Ao receber o kit:
Registrar data
Registrar na planilha de controle
Checar se o material não está danificado
Armazenar 2-8°C
Usar primeiro o que chegou primeiro
Observar datas de validade
A contaminação dos reagentes pode comprometer o resultado dos testes. Rotular os reservatórios de reagentes ajuda a minimizar o risco.
Reservatórios rotulados
Rótulo de kit com anotações
Lembre-se:
Meça todos os reagentes em vidrarias limpas. 
Tenha cuidado de preparar apenas o que seja necessário para o número de placas a ser executado. Isso ajudará a manter a integridade dos reagentes. 
Não devolva reagentes para o estoque 
É altamente recomendável usar ponteiras e reservatórios
 descartáveis quando manuseamento de reagentes para minimizar o risco de contaminação. 
No entanto, se você optar por reutilizar qualquer dispositivo descartável, use um reservatório separado para cada reagente e certifique-se de rotulá-los. 
Além disso, lavar e enxaguar bem o poços com água destilada ou deionizada após cada utilização. Alterar e descartar o reservatórios descartáveis tão frequentemente quanto possível. 
Nunca use o mesmo reservatório para o conjugado e substrato, mesmo que tenha sido lavado.
Controle de Qualidade
Controles Setembro
 Densidade Óptica
Contr. Positivo
Contr. Negativo
Dia
Monitoramento da Temperatura
 Temperatura °C
Dia
Manuseio de Amostras
A qualidade da amostra pode ter um impacto significativo sobre os resultados finais do ensaio. 
A maioria dos laboratórios não têm escolha em relação à qualidade das amostras recebidas. 
Em muitos casos, a formulação diluente da amostra compensa as variações na qualidade da amostra.
grave fúngica ou contaminação bacteriana pode ter efeitos adversos sobre anticorpos ou outras proteínas componentes de uma amostra e podem ter uma efeito indesejável sobre os resultados do teste. 
Se a qualidade da amostra é altamente questionável, a obtenção de uma nova amostra é altamente recomendável, quando possível.
Entrada de Amostras
Manuseio de Amostras
Caldo de Carne
Sangue
Leite
Retirar a amostra onde indica a seta
Tipos de Amostras
Manuseio de Amostras
Armazenamento, congelamento e descongelamento
Hemólise Leve
Hemólise Escura
Amostra descongelada. 
Não homogeneizada. 
Proteínas no fundo
Evite numerosos ciclos de congelamento e descongelamento, pois isso pode danificar os anticorpos ou antígenos presentes na amostra. Recomendamos não mais do que 3-5 ciclos.
Soro2-8 ° C por até 5 dias. 
Se necessário congelar,
usar -20 ° C. 
rotular 
selar para evitar evaporação. 
liofilização (concentração da amostra) pode ocorrer em “frost-free”
Descongelamento temperatura ambiente ou na geladeira
Misturar bem amostras descongeladas 
Misture em vortex (suave) ou invertendo pelo menos cinco vezes. 
Evitar formação de espuma
Armazenamento
Usando amostras congeladas
Pipetagem
Encher a ponteira com o volume desejado
A gota na extremidade da ponteira deve ser removida
Toque a parede interna do tubo para remove-la
Tenha certeza que você realmente pegou o volume desejado na ponteira
Posição adequada para dispensar reagentes em poços vazios usando uma pipeta multicanal; no canto inferior de cada poço
Posição apropriada para distribuir reagentes para os poços que contêm liquido utilizando uma pipeta multicanal; acima do líquido
Incubação das Placas
Cronômetros devem ser usados para 
o controle do tempo de incubação
Os tempos de incubação devem ser tão precisos quanto possível
Geralmente o processo de adição de amostras à placa exige a maior parte do tempo. Quando você dispensar amostras na placa, que é importante manter a diferença de tempo entre a primeira e a última amostra a um mínimo.
Usar uma pipeta de múltiplos canais, sempre que possível, para minimizar o intervalo de tempo desde o início da placa até ao fim. 
Resultados
Leitura da placa e manejo de dados
Ultimo passo
Leitor de placas ELISA
“Escolha” do comprimento de onda (450 nm or 650 nm)
Filtros
Ler placas imediatamente após parada da reação
Leitura
Software
Replicatas
Estatística
Gráficos
Controles
Dosagens
Dados
Interface do software
Leitor de placas
Ração do ABTS
 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 
Forma 
oxidada
Forma 
reduzida
peroxidase
H2O2
2H2O2
Espectro de Absorção do ABTS
Absorbance spectra of HRP-ABTS reaction medium containing 0 mol L−1 and 10−4 mol L−1 H2O2.
Forma 
oxidada
Forma 
reduzida
Comprimento de onda (nm)
Substratos da Peroxidase