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3 1. INTRODUÇÃO 1.1 Catalase Algumas das reações oxidativas na degradação de aminoácidos e gorduras produzem radicais livres e peróxido de hidrogênio (H2O2), espécies químicas muito reativas que podem lesar a maquinaria celular. Para proteger as células desses subprodutos destrutivos, tais reações são segregadas dentro de pequenas vesículas, envoltas por membranas, chamadas de peroxissomos (NELSON, 2014). O peróxido de hidrogênio é degradado pela catalase, uma enzima presente em altas concentrações nos peroxissomos, que catalisa a reação: 2 H2O2→ 2 H2O + O2 Enzimas são proteínas, polímeros de cadeia longa com aminoácidos sucessivamente ligados uns aos outros através de ligações peptídicas em uma sequência determinada geneticamente, que apresentam atividade catalítica. As enzimas são catalisadores das reações bioquímicas, isto é, atuam tornando possível uma nova reação com energia de ativação menor. Isso significa que simplesmente com a sua presença e sem serem consumidas durante o processo, as enzimas conseguem acelerar os processos bioquímicos. A eficiência das enzimas como catalisadores é medida pelo número de transformações moleculares, que é explicada pelo número de moléculas de substrato que uma enzima converte por unidade de tempo (MARZZOCO, 2007).. As enzimas são sintetizadas por células vivas e atuam em quase todas as reações químicas do metabolismo dos organismos vivos e, portanto, também estão presentes nos vários alimentos, atuando na hidrólise do material alimentício em compostos mais simples, por exemplo, as lipases que hidrolisam as gorduras sem glicerol e ácidos graxos, e as amilases que hidrolisam amido em açúcares mais simples. As enzimas podem ser classificadas de acordo com vários critérios. O mais importante foi estabelecido pela União Internacional de Bioquímica (IUB), e estabelece seis classes. As oxidorredutases são enzimas que catalisam reações de transferência de elétrons, ou seja, reações de oxiredução. São as desidrogenases e as oxidases. Se uma molécula se reduz, tem que haver outra que se oxide. As transferases são 4 enzimas que catalisam reações de transferência de grupamentos funcionais, como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Como exemplo, temos as quinases e as transaminases. As hidrolases catalisam reações de hidrólise de ligação covalente. Um exemplo são as peptidases. As liases catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico. As dehidratases e as descarboxilases também exemplos. As isomerases catalisam reações de interconversão entre isômeros ópticos ou geométricos. As epimerases são exemplos. E, as ligases, que catalisam reações de formação e novas moléculas a partir da ligação entre duas já existentes, sempre à custa de energia (ATP) (MARZZOCO, 2007). As principais enzimas envolvidas no processamento de alimentos são as oxidoredutases e as hidrolases. As oxidoredutases são enzimas relacionadas com as reações de óxido-redução em sistemas biológicos e, portanto, com os processos de respiração e fermentação. Dentro desta classe de enzimas pode-se destacar a glucoseoxidase, catalase e lipoxigenase. 1.2 Métodos de determinação das estruturas das proteínas Cromatografia de exclusão (filtração em gel) O volume de eluição da proteína na cromatografia de exclusão é determinado pelo tamanho da proteína. Esse volume de eluição tem relação direta com o logarítmico da massa molecular da proteína (Log Mr). Com a finalidade de determinar a massa de uma proteína, primeiro é necessário construir uma curva de calibração (curva padrão) utilizando várias proteínas de massa conhecida. Em geral faz-se a cromatografia de exclusão utilizando-se o equipamento de HPLC com colunas cujas dimensões variam de 1 a 30 cm e fluxos de 1 mL/min. Curvas de calibração lineares são obtidas plotando-se o Log Mr vs Kd (eluição relativa). O Kd é calculado seguindo a equação: 𝐾𝑑 = (𝑉𝑒 − 𝑉𝑜)/(𝑉𝑡 − 𝑉𝑜) Onde, Vo é o volume morto (volume necessário para que as moléculas totalmente excluídas da coluna saiam, em geral é um volume muito pequeno), Vt é o volume necessário para que moléculas muito pequenas que entram em todos os poros saiam 2 (volume total da coluna) e Ve é o volume necessário para que a proteína de 5 interesse saia. Esse método dá valores de massa com precisão de 10% (WILSON, 2010). A cristalografia de macromoléculas é a ciência destinada a estudar sistemas biológicos através da determinação da estrutura tridimensional em nível atômico de importantes classes de moléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucléicos e vírus. Informações sobre a estrutura tridimensional de uma molécula podem ser obtidas por várias metodologias: difração de raios X por monocristais, difração de nêutrons por monocristais, ressonância magnética nuclear, espalhamento de raios X a baixo angulo [SAXS] em solução, microscopia eletrônica, modelagem teórica, entre outros. Dentre essas, o método cristalográfico apresenta-se como o mais adequado devido à alta resolução com que se pode descrever a densidade eletrônica. O método cristalográfico tem contribuições relevantes em diversas áreas, dentre as quais se podem citar Genômica, Proteômica e Bioinformática (NONATO, 1997). A estrutura e a função de uma macromolécula são propriedades intimamente ligadas. Os segredos dos mecanismos de reconhecimento e respostas das macromoléculas biológicas dependem de suas estruturas químicas, e ainda de suas estruturas tridimensionais. Os cristais de macromoléculas biológicas são diferentes dos cristais de pequenas moléculas em vários aspectos. Eles diferem em tamanho, cristais de macromoléculas são normalmente bem menores, dificilmente excedem 1mm3 em volume. Outra diferença é que cristais de macromoléculas biológicas são bem mais frágeis e possuem um alto conteúdo de solvente. A fragilidade dos cristais de macromoléculas biológicas é uma conseqüência das fracas interações entre as macromoléculas biológicas dentro da rede cristalina e do alto conteúdo de solvente nestes cristais (de 20% a mais de 75%) (NONATO, 1997). O espaçamento de diferentes tipos de átomos em moléculas orgânicas complexas, até mesmos as grandes como as proteínas, também pode ser analisado utilizando o método de difração de raios X. O espaçamento dos átomos em um retículo cristalino pode ser determinado pela medida da localização e da intensidade dos pontos produzidos por um feixe de raios X, de um dado comprimento de onda, em um filme fotográfico, depois desse feixe ser difratado pelos elétrons dos átomos. Entretanto, essa técnica de análise de cristais de moléculas complexas é muito mais trabalhosa do que a de cristais de sais simples. Quando o padrão de repetição do 6 cristal é uma molécula tão grande quanto uma proteína, o número de átomos da molécula resulta em milhares de pontos de difração que precisam ser analisados por computador. Considere como as imagens são geradas em um microscópio óptico. A luz de uma fonte pontual é focalizada em um objeto. O objeto espalha as ondas de luz, e estas ondas espalhadas são reagrupadas por uma série de lentes para gerar uma imagem aumentada do objeto. O tamanho mínimo do objeto cuja estrutura pode ser determinada desta forma – isto é, o poder de resolução do microscópio – é determinado pelo comprimento de onda de luz, neste caso, luz visível, com um comprimento de onda entre 400 e 700 nm. Objetos menores do que a metade do comprimento de onda da luz incidente não têm resolução. Para resolver objetos tão pequenos quanto as proteínas, é necessário usar raios X, com comprimentos de ondana faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm). Entretanto, não há lentes que possam reagrupar os raios X para formar a imagem. Em vez disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente, e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas. A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra (NELSON, 2014). Os métodos utilizados para a resolução de estrutura de moléculas pequenas, como métodos diretos que envolvem relações estatísticas entre os fatores de estrutura e o método de Patterson, não podem ser utilizados na determinação da estrutura de proteínas, pois esses métodos podem ser empregados para resolver estruturas de no máximo 100 átomos e uma proteína que é considerada pequena possui na ordem de 1000 átomos. Por fim, é realizado o refinamento da proteína, um processo com o objetivo de encontrar uma melhor concordância entre o modelo proposto para a estrutura da molécula e a sua estrutura real. Esta concordância deve refletir numa igualdade entre os fatores de estrutura calculados (Fcalc) e os fatores de estrutura observados (Fobs). O acompanhamento da qualidade deste processo é feito por meio do cálculo do fator R (Rfator) durante o processo. Para estruturas cristalográficas de proteínas resolvidas à resolução melhor de 2,0 Å, espera-se que o R atinja valores menores que 20%. Como R pode ser minimizado artificialmente e levando em consideração a redundância dos dados de raios X, uma pequena porcentagem das reflexões são excluídas do refinamento e utilizadas como um conjunto de teste no cálculo de um novo fator R chamado Rlivre, que é isento de minimização artificial. Normalmente o 7 Rlivre possui um valor um pouco mais alto que o R, normalmente não excedendo os 10% para estruturas refinadas a alta resolução (JUNIOR, 2004). 1.3 Repositório Virtual de Macromoléculas (Protein Data Bank) O número de estruturas proteicas tridimensionais conhecidas está na casa das dezenas de milhares e esse número crescer a cada dois anos. Esse vasto campo de informações está revolucionando o entendimento sobre a estrutura de proteínas, a relação estrutura-atividade e as rotas evolutivas pelas quais as proteínas chegaram ao seu estado atual, que podem ser vistas nas semelhanças que aparecem entre as famílias à medida que os bancos de dados de proteínas são examinados e classificados. Um dos recursos digitais mais importantes disponíveis aos bioquímicos é o Protein Data Bank (PDB, ou banco de dados de proteínas; www.pdb.org). O PDB é um arquivo de estruturas tridimensionais de macromoléculas biológicas determinadas experimentalmente, contendo quase todas as estruturas macromoleculares (proteínas, RNA, DNA, etc.) elucidadas até o momento. A cada estrutura é atribuído um código de identificação (um código de quatro caracteres, chamado de PDB ID). Tais identificadores são fornecidos nas legendas das figuras para cada uma das estruturas derivadas do PDB ilustradas nesse texto, de forma que os estudantes e os professores podem explorar essas mesmas estruturas. Os arquivos de dados no PDB descrevem as coordenadas espaciais de cada átomo cuja posição foi determinada (muitas das estruturas catalogadas não estão completas). Arquivos de dados adicionais fornecem informações de como as estruturas foram determinadas e sua precisão. As coordenadas atômicas podem ser convertidas em uma imagem da macromolécula com a ajuda de programas de visualização de estruturas (NELSON, 2014). 8 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Analisar a atividade enzimática e a estrutura tridimensional da Catalase. 2.2. Objetivos Especificos Observar a ação do peróxido de hidrogênio (H2O2) na batata. Explorar o recurso digital Protein Data Bank, afim de obter tais informações: sequência primária da Catalase humana, percentual de α-hélice e β-folha pregueada, dados cristalográficos, além da estrutura tridimensional. 3. METODOLOGIA 3.1. Materiais utilizados 1 batata crua e fresca 1 frasco de água oxigenada 30 volumes Copos descartáveis 1 faca de corte Computador com acesso a internet 3.2. Procedimentos Experimentais Cortou-se as batatas em pedaços bem pequeno. Logo após, as batatas foram transferidas para o copo descartável. Foi adicionado um volume de água oxigenada até as superfícies das batatas. Observou-se a reação entre a água oxigenada e a catalase da batata. 9 Em seguida, foi realizada uma análise da estrutura da catalase humana usando o recurso digital Protein Data Bank (PDB). 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1Decomposição do Peróxido de Hidrogênio (H2O2 Volume 10) com a Batata Inglesa crua e fresca. Foi observado a formação de bolhas quando acrescentou o peróxido de hidrogênio ao copo descartável contendo uma parte da batata Inglesa, ou seja, o Oxigênio liberado na reação. A decomposição da água oxigenada (H2O2) pode ser realizada por uma enzima chamada catalase. O átomo central da catalase é o átomo de Ferro que reage com a H2O2, sendo que o íon ferro (Fe) está com número de oxidação igual a 3+. O mecanismo da reação de decomposição desse peróxido catalisada por Fe 3+ ainda não está bem definido, porém alguns artigos descrevem essa reação em duas etapas: H2O2 (aq) + Fe (III)-E (aq) → H2O (l) + O=Fe (IV)-E (aq) (etapa 1) H2O2 (aq) + O=Fe (IV)-E (aq) → H2O (l) + Fe(III)-E (aq) + O2 (g) (etapa 2) 2 H2O2 (aq) → 2 H2O (l) + O2 (g) (equação global) Sendo que Fe-E está representando o ferro de um grupamento HEMO ligado à enzima. Relativamente, a catalase é uma enzima que tem uma dificuldade na saturação, por tanto, só irá atingir a velocidade máxima da reação quando estiver frente a elevadas concentrações de peróxido. A velocidade de uma reação enzimática aumenta com a crescente de temperatura, isto é provocado pela maior agitação das moléculas e, deste modo, maiores probabilidades de elas colidirem para reagir. Porém, a partir de uma assentada temperatura, a velocidade da reação diminui consideravelmente, porque a agitação das moléculas se tornará tão intensa que as ligações estabilizariam e a estrutura espacial da enzima irá romper-se e ela é desnaturada. 10 Cada tipo de enzima existe uma faixa de temperatura adequada, na qual a velocidade da reação é mais próxima do máximo. A maior parte das enzimas humanas tem sua temperatura ideal entre 36 e 37ºC que é a faixa de temperatura estimada normal para o corpo humano. Tento também o fator pH que irá influenciar no processo de degradação, a escala de pH vária de 0 a 14 e mede a concentração relativa de íons hidrogênio (H+) no meio. Valores de X > 7 o pH ácido e valores 7 < X básico, cada enzima tem um pH excelente de atuação, no qual a sua atividade é máxima, O pH ótimo para a maioria das enzimas fica entre 6 e 8, e em muitos casos sendo necessário a reação acontecer em um sistema tampão. 4.2 Análise da estrutura tridimensional na plataforma Protein Data Bank A catalase é uma enzima que reage com o peróxido de hidrogênio para que ocorra a degradação através de uma reação de oxirredução, inibindo o efeito tóxico do mesmo ao ser humano. Possui uma estrutura definida que pode ser visualizada na plataforma Protein Data Bank. A estrutura analisada tem como código de identificação 5SYK, do autor: Loewen, P.C. foi depositada nesse banco de dados no dia 11/08/2016 e sendo liberada apenas no dia 21/09/2016, sendo feita a análise partindo do método da Difração de raio-X, com uma boa resolução no valorde 1.8 Å na qual o valor de uma melhor resolução, de acordo com a literatura, é de 2,0 Å. Estruturas nas diferentes formas: Cartoon, Backbone, Space Fill, Ball and Stick. Imagem 1: Cartoon (Desenho animado). 11 Na molécula com a forma de Cartoon, é possível observar uma estrutura com uma aparência lúdica, em quem facilita a compreensão, pois a definição é bem mais visível das ligações β-Folha Pregueada e das α-Hélices. Quando aproximamos a imagem, podemos fazer uma investigação minuciosa da molécula. Imagem 2: Beckbone (Ossos). Na estrutura Beckbone, pode observar as ligações que estão interagindo na molécula, sem distinção entre β-Folha Pregueada ou α-Hélices, apenas diferenciado pelas cores dos átomos que compõem a proteína. Imagem 3: Space fill ( Preencher o espaço). Podemos observar que a ilustração é formada pela densidade eletrônica dos átomos que compõe a proteína, porém, apresenta um maior nível de abstração, havendo maiores dificuldades ao realizar à análise de todos os átomos, pois como podemos observar, átomos internos não é possível identificá-los. 12 Imagem 4: Ball and Stick (Bolas e varetas) Dessa forma, conseguiremos observar tanto a ligação quanto o átomo, nela o interessante é que tanto poderemos observar a variação atômica nas diferentes regiões da enzima, ocasionado pela diferença das cores nas bolas representativas dos átomos. A enzima Catalase é composta de uma sequência de 748 aminoácidos com cerca de 45% de conformações α-Hélices sendo que desta percentagem apenas 46 conformações são α-Hélices, 329 são de resíduos e 7% de são das conformações β-Folha pregueada, na qual 26 possuem as caracteristicas de β-Folha e 55 são resíduos de aminoácidos. 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS O peróxido de hidrogênio é um produto secundário do metabolismo celular, e apresenta algumas funções úteis, incluindo uma resposta imune saudável. No entanto, a H2O2 em excesso é prejudicial, porque ocasiona a origem de radicais livres destrutivos (OH•) que são altamente reativos e tóxicos para as células. Esses radicais livres podem atacar as membranas lipídicas, o DNA e outros componentes essenciais das células. Por esse motivo, a presença da catalase é importante nos organismos vivos, porque neutraliza e equilibra a produção contínua da água oxigenada. Tendo 13 em vista, que o produto formado da decomposição da H2O2 é água e oxigênio, que não faz mal algum para corpo humano. A aula prática com a análise realizada através de um recurso digital é importante para facilitar a compreensão do mundo microscópico das interações moleculares, podendo proporcionar ao aluno o entendimento sobre a estrutura de proteínas, a relação estrutura-atividade e as rotas evolutivas pelas quais as proteínas chegaram ao seu estado atual. Os arquivos de dados das proteínas, determinados experimentalmente, no Protein Data Bank descrevem as coordenadas espaciais de cada átomo cuja posição e como foi determinada, acompanhada de sua precisão. As coordenadas atômicas podem ser convertidas em uma imagem da macromolécula com a ajuda de programas de visualização de estrutura. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS JÚNIOR, W.F.A. Refinamento cristalográfico de biomoléculas. São José do Rio Preto, 2004. MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo Baptista. Bioquímica básica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. NONATO, M.C. Estudos cristalográficos em macromoléculas biológicas: Aplicações em Calgranulita C de Glanulócitos porcinos. Tripanotiona redutase de Trypanosoma cruzi e Fosfolipase A2 Extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni. São Carlos, 1997. WILSON, K.; Walker, J. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 7º ed. Cambridge Univ. Press. 2010. 1. INTRODUÇÃO
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