ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRA SONOGRAFIA E SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVO DE EMBRIÕES BOVINOS

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO MESQUITA”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO
FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E
SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVO
DE EMBRIÕES BOVINOS
Andréa Renesto
Médica Veterinária
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
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Agosto de 2004
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO MESQUITA”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO
FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E
SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVO
DE EMBRIÕES BOVINOS
Andréa Renesto
Orientador: Profa. Dra. Lia de Alencar Coelho
Dissertação de Mestrado
apresentada à Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias
– Unesp, campus de Jaboticabal,
como parte das exigências para
a obtenção do título de Mestre
em Medicina Veterinária
(Reprodução Animal).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Agosto de 2004
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
ANDRÉA RENESTO – Nascida aos 10 dias de março de 1977 em Pereira
Barreto – SP. Graduou-se em Medicina Veterinária na Universidade do Oeste
Paulista – UNOESTE – no período de Janeiro de 1995 a Dezembro de 1999. No
período de Fevereiro de 2000 a Agosto de 2001 cursou a Especialização Lato
Sensu em Reprodução Animal, na Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE.
Em fevereiro de 2001 ingressou na Especialização Lato Sensu em Julgamento
das Raças Zebuínas, da Faculdade de Agronomia e Zootecnia de Uberaba –
FAZU, obtendo o título de Especialista em Julgamento das Raças Zebuínas em
Dezembro de 2001. Graduou-se como Jurada efetiva das Raças Zebuínas através
do Colégio Técnico de Jurados das Raças Zebuínas da Associação Brasileira dos
Criadores de Zebu, no período de Junho de 1999 a Outubro de 2001. Ingressou
no Programa de Mestrado em Medicina Veterinária, Área de Concentração
Reprodução Animal, pela faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP
- Jaboticabal-SP, em março de 2002.
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Agradeço a Deus por essa existência, pela coragem,
vontade e principalmente pela força
nos momentos mais difíceis...
Dedico este trabalho aos meus pais!
É mais uma prova do sinônimo de amor e carinho que
vocês me proporcionaram durante toda minha existência.
.... Vocês que abriram mão de muitos sonhos em função
dos meus... Não há palavras que expressem minha
gratidão e meu amor!!!
“ Se um dia já homem feito e realizado, sentires que a
terra cedeu a teus pés, e que tuas obras morreram, que
não há ninguém a tua volta para te estender a mão,
esquece a tua maturidade, passa pela tua mocidade,
volta a tua infância e balbucia, entre lágrimas e
esperanças, as últimas palavras que sempre estarão na
tua alma: Mãe, Pai...
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Rui Barbosa
Aos meus irmãos, que tanto amo, Silvana e Éden:
Obrigada pelo apoio incessante e por acreditarem em
mim, mesmo nas horas em que eu cheguei a duvidar!!
“ À medida que o nosso amor progride, mais nos convencemos
de que Deus existe e de que a alma é imortal”.
(Dostoievski)
Ao meu querido amigo Irineu Gonçalves Filho;
“ A imortalidade de que se reveste a natureza humana
faz o homem sempre presente.
Presente pela cultura que transmitiu.
Presente pela amizade que conquistou.
Presente pelo exemplo que legou.
Sempre presente porque o homem é educador.”
(Dostoievski)
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Ofereço:
A Profa Dra. Lia de Alencar Coelho
Ao Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia
A Profa Dra. Caliê Castilho
Obrigada ... pela orientação,
valiosos ensinamentos,
pela confiança e inestimável apoio,
pela amizade e convivência enriquecedora...
À vocês, minha eterna admiração!!
Em especial a minha querida amiga Caliê... não tenho
palavras de agradecimento, admiração e respeito...
“ É muito melhor ousar fazer coisas grandiosas,
triunfar gloriosamente, mesmo que com alguns fracassos no
meio do caminho, do que se igualar aquela pobres almas que
não aproveitam nem sofrem muito,
pois vivem na penumbra cinza de quem não sabe o que é a
vitória nem a derrota”
(Theodore Roosevelt)
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“ ...E encontrei liberdade e segurança
em minha loucura:
a liberdade da solidão e
a segurança de não ser compreendido,
pois aqueles que nos compreendem
nos escravizam de algum modo...”
(Gibran Khalil Gibran)
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AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta e indireta
de muitas pessoas. Manifesto minha eterna gratidão a todas elas!!
À Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias
de Jaboticabal, e ao departamento de Medicina Veterinária Preventiva e
Reprodução Animal – DRA pelas instalações, condições de trabalho e
oportunidade oferecida.
À Universidade do Oeste Paulista pelo incentivo a pesquisa, por ceder os animais
da segunda fase do trabalho e colocar a disposição às instalações da Fazenda
Experimental, em nome da amiga Profa Dra. Caliê Castilho, que me guiou no
caminho da pesquisa. Não tenho palavras de agradecimento... é só sentimento!!!
À Gilmar Garcia que gentilmente forneceu os animais e toda instalação da
Agropecuária J Garcia para os experimentos da primeira fase do trabalho.
“ A arte suprema do mestre consiste em despertar alegria, provocando curiosidade
pelo conhecimento criativo. A única finalidade da educação deve consistir em
preparar indivíduos que pensem e ajam como pessoas – independentes e livres”.
(Albert Einstein)
À todos os funcionários que me acompanharam no campo, ajudando
intensamente na realização desse trabalho. Fica aqui minha gratidão, vocês foram
fundamentais para o projeto...e, foram... incansáveis!!
Aos meus companheiros de trabalho e amigos, Dr. Irineu Gonçalves Filho, Dr.
Valdecir Marin Júnior e Dr. Marcelo Moura, inicialmente pela amizade e por
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acreditarem em mim e posteriormente pela confiança, compreensão e força...
Vocês fizeram parte da realização desse sonho e com vocês aprendo mais a cada
dia os principais valores da vida: ética, companheirismo, conhecimento, respeito,
seriedade e amizade! “... Amigos que se tornaram parceiros, parceiros que se
tornaram amigos. Sementes plantadas e regadas com respeito, admiração e muita
amizade!! “
Ao meu querido e doce JV. Obrigada pela sinceridade, pelos olhos cheio de
carinho pela beleza e grandeza dos seus sentimentos. Você foi fundamental em
um momento da minha vida em que cheguei a achar que as pessoas eram só
maldade e que a vida era repleta de injustiças e incompreensão.
“ Parece que tudo já foi dito entre nós. Agora só vale a pena dizer da saudade que
você deixou...” (Carlos Drummond de Andrade)
A todos meus familiares que mesmo distantes sempre me apoiaram e torceram
por mim em mais essa etapa da minha vida.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Reprodução Animal
pela amizade, convívio harmonioso e colaboração. Em especial a Bel e a Roberta
pela paciência e atenção.
Ao Médico Veterinário eamigo José Otávio Folino pelo auxílio na colheita de
embriões, pela ajuda em um dos momentos mais difíceis e tão engrandecedor que
passei na minha vida e principalmente pela amizade! A você e sua esposa Milene,
nunca esquecerei o carinho, a amizade, o apoio, o incentivo, as palavras de fé, de
esperança... pela mão amiga estendida, pelo estímulo e conforto...
Ao Médico Veterinário Fábio Mustafá pelo auxílio no desenvolvimento dos
trabalhos na Fazenda Experimental. Obrigado companheiro!!
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Aos funcionários da Avanti Consultoria Pecuária, Carol, Regina e Jú! A realização
desse trabalho contou diretamente com a colaboração de vocês... por me
apoiarem e principalmente pela compreensão da minha inconstância de humor. E,
também aos funcionários da Nelore, Adriana e Maurílio! Obrigada pela força!!
Aos pós-graduandos de Jaboticabal, em especial a Déia e Gabriel que foram
extremamente prestativos quando precisei de ajuda. Companheirismo é uma
qualidade de poucos... Obrigado companheiro!!! Ao Max, Cris, Vi, Letícia, Éricles...
A minha amiga irmã Ka (Karina Ueda Stringuetta). Você, mesmo distante, sentia
quando eu precisava de uma palavra amiga e de um conforto e mesmo quando eu
não queria falar você sempre tinha uma palavra de carinho. Obrigada por você
nunca desistir de mim!!!
A minha amiga irmã Lê (Alessandra Reis).... sempre presente em todos os
momentos em que precisei, sempre pronta para ouvir! Obrigada pelos sábios
conselhos e por me fazer ver, por muitas vezes, a força que existe em mim e que
Deus nos dá a todo instante. Obrigada pela amizade e pelos momentos de alegria
fraterna que sempre marcaram nossa convivência... Você que une a ação ao
sentimento e ao pensamento! Muito obrigada!!!
À minha amiga querida, Janete (Fernanda Prata Cunha)... Muito obrigada pela
força e por se preocupar tanto comigo. Você tem sido uma grande amiga...
sabemos que podemos contar uma com a outra!!! “Toghethersss... foreverssss....”
À minha eterna amiga Maria de Lamare... nem tenho palavras para agradecer toda
força que já me deu. Obrigada pelo querer bem e pela confiança! Saiba que você
é companheira ímpar... parceira cem por cento!
Àos meus amigos: Lu Kahale, Flor (Fabiana), Verinha, Baraldi, Talita Medeiros, Li,
Gabi, Dani Bolota, Dipilik (Bárbara), Dani Tenca, Lala, Dudu, Fer Rezek, Tiago,
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Kel, Gui, SI, Déia Basso, Bidu, Elaine, Ricardo Porção, Mary, Dedé, Thá, Morcega
(Kelma), Paulinha, Flá, Ana Laura, D.Lenita, Mav... enfim a todos MUIIITTOOO
OBRIGADA PELO APOIO E PRINCIPALMENTE PELA AMIZADE!!
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15
II. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................... 17
III. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 25
Local do Experimento.............................................................................................. 25
Animais ..................................................................................................................... 25
Tratamentos.............................................................................................................. 25
Aspiração Folicular.................................................................................................. 28
Lavagem e seleção dos oócitos ............................................................................. 28
Transporte de oócitos ............................................................................................. 29
Maturação in vitro (MIV) .......................................................................................... 29
Fecundação in vitro (FIV) ........................................................................................ 29
Cultivo in vitro (CIV)................................................................................................. 30
Colheita de embriões............................................................................................... 30
Manipulação e Avaliação Morfológica dos Embriões TE ..................................... 30
Análise Estatística ................................................................................................... 30
IV. RESULTADOS......................................................................................................... 32
V. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 38
VI. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 41
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 42
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ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR
ULTRA-SONOGRAFIA E SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN
VIVO DE EMBRIÕES BOVINOS
RESUMO – Visando otimizar o uso alternado das biotecnologias TE e OPU-
FIV o presente trabalho teve como objetivo avaliar em vacas da raça Nelore o
efeito do início da superovulação ovariana (SOV) 48 a 60 horas após a aspiração
folicular em fase aleatória do ciclo estral (OPU 1) e avaliar a produção in vitro de
embriões oriundos de oócitos aspirados (OPU 2) em diferentes momentos da
primeira onda folicular induzida após a SOV. As fêmeas (n=23) foram submetidas
a OPU 1, em fase aleatória do ciclo estral, seguida pela inserção de implante de
progestágeno (Crestar®). Em torno de 48 a 60 horas após a aspiração iniciou-se a
SOV, utilizando-se FSH (Folltropin®) 180 mg por vaca dividida em 8 doses,
durante 4 dias consecutivos. Durante 6a e 7a aplicações de FSH foi administrada
500 mg de PGF2a (Preloban®) e o Crestar foi retirado durante a administração da
sétima dose de FSH. Após 12 horas do término da SOV, as fêmeas receberam
25mg de LH exógeno (Lutropin-V®) para causar ovulação e realizar a IA com
tempo fixo. Foram realizadas 2 inseminações com intervalo de 12 horas, sendo
que a 1ª inseminação ocorreu 12 horas após a administração de LH. Sete dias
após a 1ª IA as fêmeas foram coletadas. No dia da colheita dos embriões as
fêmeas foram divididas em 6 tratamentos, T(0-144) (n=4), T(48-120) (n=5), T(48-
96) (n=4), T(72-96) (n=3), T(96-72) (n=4), T(96-48) (n=3) que variaram de acordo
com o momento da administração de PGF2a em relação a colheita de embriões e
aspiração na primeira onda após a SOV. A aplicação de PGF2a foi realizada no
dia da colheita (dia 0), 48, 72 ou 96 horas após a colheita e a aspiração 144, 96,
72 ou 48 horas após a PGF2a. Não houve diferença significativa na % de oócitos
aspirados e embriões produzidos com a alternância das biotecnologias OPU e TE.
No entanto, foi observada diferença significativa (p>0,05) no número de oócitos
recuperados entre os tratamentos, sendo que a recuperação no T(96-48) foi
significativamente menor quando comparada ao T(48-96) e T(72-96),
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demonstrando que o momento da aspiração muito próxima da PGF2a (48 horas
após) prejudicou a recuperação de oócitos. Concluí-se que a superovulação não
afeta a recuperação de oócitos e a produção in vitro de blasctocistos quando a
OPU é realizada a partir de 48 horas após a PGF2a na onda subseqüente a
superovulação podendo ser utilizada para o incremento na produção de embriões
de vacas da raça Nelore.Palavras chaves: aspiração folicular, competência oocitária, dinâmica folicular,
nelore, superovulação
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xiv
ASSOCIATION OF THE BIOTECHNIQUES: ULTRASOUND-GUIDED
TRANSVAGINAL FOLLICULAR ASPIRATION AND SUPEROVULATION IN
PRODUCTION IN VITRO AND IN VIVO OF BOVINE EMBRYOS
SUMMARY - Aiming at to optimize the alternating use of the biotechnologies
multiple ovulation and embryo transfer (MOET) and Ovum Pick Up and in vitro
fertilization (OPU-FIV) the present work had as objective to evaluate in Nelore
donors breed the effect of the beginning of the superovulation (SOV) at 48-60
hours after the follicular aspiration in randomly phase of the estrous cycle (OPU 1)
and to evaluate the in vitro embryo development of recovered oocytes (OPU 2) at
different moments of the first folicular wave after the SOV. The females (n=23)
were submitted to a OPU 1, in randomly phase of the estrous cycle, followed for
the insertion of progesterone (Crestar®). Around 48 - 60 hours after the aspiration
the superovulaction was induced with FSH (Folltropin®) 180 mg/ cow divided in 8
doses, during 4 consecutive days. Luteolytis was induced with two doses of PGF2á
(Preloban®, 500 µg), during the sixth and seventh infections of FSH and Crestar
was removed during the administration of the seventh dose of FSH. 12 hours after
the end of the SOV, the females received 25mg of LH (Lutropin-V®) to cause
ovulation. Two Artificial inseminations with fixed time were done with interval of 12
hours and the first occurred 12 hours after the LH administration. Seven days after
1ªIA the embryo were collected and all cows divided in 6 treatments, T(0-144)
(n=4), T(48-120) (n=5), T(48-96) (n=4), T(72-96) (n=3), T(96-72) (n=4), T(96-48)
(n=3) that accordance with the injection of PGF2 á , embryo recovery and
aspiration in the first wave after the SOV. The PGF2 á application was carried in
the embryo recovery (day 0), 48, 72 or 96 hours after and aspiration 144, 96, 72 or
48 hours after the PGF2 á. There was no significant difference in % of oocytes
recovery and embryos development with the alternation of the biotechnologies
OPU and SOV. However, significant difference (p>0,05) in the number of oocytes
recovery between the treatments was observed. The recovery in T(96-48) was
significantly lesser when compared with T(48-96) and T(72-96), demonstrating that
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the moment of the aspiration very next to the PGF2á (48 hours after) harmed the
oocytes recovery. The results of the present study concluded that the
superovulation not affect the oocytes recovery and the embryo development when
the OPU is carried 48 hours after the injection of PGF2á in the subsequent wave
after the superovulation and may to be used for the increment of embryos yield of
Nelore donors.
key words: superovulation, follicular aspiration, oocyte competence, follicular
dynamic, Nelore breed.
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I. INTRODUÇÃO
No atual contexto de evolução da produtividade na pecuária nacional,
associado às evoluções científicas e tecnológicas, várias biotecnologias ligadas a
reprodução animal vem sendo desenvolvidas e aprimoradas com o intuito de
aumentar a eficiência reprodutiva, maximizando a produção de animais
geneticamente superiores, visando o aproveitamento deste material genético para
obtenção do maior número de descendentes, em um curto período de tempo.
Seguindo a evolução das principais biotecnologias adotadas e trabalhadas
no Brasil, é importante ressaltar, inicialmente, o papel da Inseminação Artificial
(IA), sendo a primeira biotecnologia adotada nos sistemas de produção brasileiros
que visa a multiplicação genética de touros de alto valor. Com a introdução de
esquemas de ovulações múltiplas, recuperação e transferência de embriões, mais
conhecida como Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET), junto com a
criopreservação de embriões na década de 80, a bovinocultura passou a ter em
mãos ferramentas para aumentar o número de gestações provenientes de fêmeas
de alto mérito genético (RODRIGUES, 2001). A produção embrionária através da
TE é uma biotécnica mundialmente difundida e vem apresentando um crescimento
acentuado onde mais de 500.000 embriões são colhidos e transferidos ou
congelados anualmente (THIBIER, 2000).
A Fertilização In Vitro (FIV), por sua vez, é considerada a terceira geração
de biotecnologia aplicada ao Melhoramento Genético, após a IA e a TE. No início
da década de 90, com a introdução da aspiração folicular guiada por ultra-
sonografia (Ovum Pick-up) seguida pela produção in vitro de embriões (OPU-PIV),
a expectativa no incremento da produtividade das fêmeas aumentou.
Na bovinocultura brasileira, essas tecnologias também vêm sendo
amplamente utilizadas e adaptadas ao nosso sistema de produção e, ao longo da
sua evolução, tem revelado bons índices reprodutivos, confirmando ser um
processo economicamente viável, bastante divulgado e empregado na pecuária
moderna.
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xvii
No entanto, segundo BO et al., (2000) alguns inconvenientes podem ser
observados nos programas de superovulação como a necessidade de iniciar o
tratamento hormonal em momento determinado do ciclo estral e pouca
consistência na produção de embriões viáveis pelas doadoras, sobretudo quando
se considera que 20% a 30% das doadoras não produzem nenhum embrião
transferível. A variabilidade na produção de embrião pode ser influenciada por
fatores relacionados com o tratamento superovulatório ou em maior grau por
fatores individuais associados às características da dinâmica folicular ovariana
(BO et al., 1995; BO et al., 2000) ou condição ovariana no momento da
superovulação (MONNIAUX et al., 1983; DIAZ, 2001).Sem contar que repetidos
tratamentos superovulatórios em novilhas e vacas afetam a fertilidade podendo
causar cistos e dificuldade para estabelecimento de prenhez posterior (GALLI et
al., 2003).
A FIV pode contribuir como uma alternativa para a superovulação e maior
produção de embriões por unidade de tempo quando comparada a TE. No
entanto, mesmo com os progressos obtidos nos processos de maturação in vitro
(MIV), fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) para o desenvolvimento
embrionário, esta técnica ainda apresenta algumas desvantagens que precisam
ser melhoradas e solucionadas. As taxas de blastocistos bovinos oriundos de
oócitos maturados e fertilizados in vitro têm permanecido relativamente estáticas
na última década, onde somente em torno de um terço (LONERGAN, et al., 1994;
THOMPSON; DUGANIZICH, 1996; DAYAN, et al., 2000) dos oócitos selecionados
morfologicamente antes de serem submetidos a MIV resultam em embriões
viáveis.
Tendo em vista que as biotecnologias MOET e OPU-PIV são de extrema
importância para aumentar a velocidade de ganho genético do rebanho nacional, o
presente trabalho visando a otimização pelo uso alternado destas biotecnologias
testou:
- o efeito do início da superovulação (SOV) 48 a 60 horas após a aspiração
folicular em fase aleatória do ciclo estral – aspiração referência (OPU 1);
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- a produção in vitro de embriões oriundos de oócitos aspirados (OPU 2)
em diferentes momentos da primeira onda folicular após a SOV.
II. REVISÃO DA LITERATURA
O ciclo estral (CE) bovino é compreendido pelos eventos reprodutivosque
se apresentam entre dois períodos de receptividade sexual (cio). As fêmeas da
espécie bovina ao atingirem a puberdade exibem comportamento estral em média
a cada 21 dias, variando de 17 a 24 dias tanto em raças européias (ROBINSON;
SHELTON, 1991; WRIGHT; MALMO, 1992; BO; ADAMS; MAPLETOFT; 2000)
quanto zebuínas (GALINA; ARTUR, 1990; PINHEIRO, et al., 1998; FIGUEIREDO,
et al., 1997; GAMBINI, et al., 1999) até que a prenhez se estabeleça.
Durante o ciclo estral ocorrem importantes alterações no córtex ovariano
que incluem crescimento e atresia de vários folículos antrais até o aparecimento
do folículo ovulatório, bem como a formação e lise do corpo lúteo (CASTILHO,
1999). O crescimento folicular na espécie bovina exibe padrão contínuo de
crescimento e atresia dos folículos ovarianos (MATTON, et al., 1981; WOOLUMS;
PETTER, 1994) que se inicia na vida fetal, passa pela puberdade (EVANS, et al.,
1997) e continua na vida reprodutiva até a seniIidade (HAFEZ, 1993). Muitos
estudos com ultra-sonografias seriadas foram realizados e demonstraram que
durante o ciclo estral de novilhas ou vacas zebuínas e européias ocorrem duas
(PIERSON; SIROIS; SAVIO, 1988; GINTHER; KNOPF, 1989; FIGUEIREDO, et al.,
1997) ou três (SAVIO, et al., 1988; GAMBINI, et al., 1998; BARROS, et al., 1993;
FIGUEIREDO, et al., 1997; CASTILHO, et al., 2000) ondas de crescimento
folicular.
Este processo contínuo de crescimento e regressão dos folículos, que leva
ao crescimento do folículo pré-ovulatório, é conhecido como dinâmica folicular,
enquanto que o padrão de crescimento e atresia de um grupo de folículos
ovarianos é denominado onda de crescimento folicular (LUCY, et al., 1992). Cada
onda folicular é composta por 3 fases: recrutamento ou emergência, seleção e
dominância (SIROIS, 1990).
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A emergência da primeira onda folicular é observada em torno de um dia e
meio após a ovulação (ADAMS, et al., 1992; GINTHER, et al., 1997) quando um
conjunto de folículos antrais dependentes de FSH começa a se desenvolver. Foi
observado um aumento na concentração plasmática de FSH que antecede 1 a 2
dias a emergência de cada onda folicular (ADAMS, et al., 1992; GIBONS;
GINTHER, 1999). Em torno de 3 a 4 dias após a emergência da onda o FSH reduz
para níveis basais e o futuro folículo dominante é selecionado, continua seu
crescimento, enquanto o restante dos folículos detém seu crescimento ou
regridem e são chamados de subordinados (BODENSTEINER, et al. 1996;
GINTHER, et al., 1997; GINTHER, et al., 2000).
A fase de seleção do folículo dominante durante a primeira onda folicular foi
observada por GINTHER et al. (1996), como a divergência na taxa de crescimento entre o
futuro folículo dominante (FD) e o maior folículo subordinado (FS) 2,8 dias após a
emergência da onda quando o futuro folículo dominante apresentou 8,5 mm de diâmetro e o
maior subordinado 7,2 mm. CASTILHO; RENESTO; GARCIA (2003), estudando a
seleção folicular em novilhas da raça Nelore observaram que em média 84 horas após a
ovulação o maior folículo subordinado medindo 5,5 mm cessa seu crescimento, enquanto o
futuro dominante com 7,5 mm continua a se desenvolver. Nas novilhas da raça Nelore, 24
horas antes da divergência no crescimento folicular foi observada a menor concentração
plasmática de FSH.
Existe uma relação funcional entre a concentração de estradiol e FSH em novilhas.
O aumento ou decréscimo na concentração de estradiol no início da divergência resulta em
decréscimo ou aumento, respectivamente, na concentração de FSH (KULICK, et al., 1999;
GINTHER, et al., 2000b).
Provavelmente o responsável pela queda do FSH antes da seleção é a produção de
estradiol e inibina, sobretudo pelas células da granulosa do folículo dominante, que atuam
inibindo a liberação de FSH pela hipófise anterior (FINDLAY; CLARKE, 1987). As
concentrações de FSH são mantidas em níveis basais até o folículo dominante da primeira
onda perder sua dominância, resultando em aumento nos níveis de FSH e subseqüente
emergência da segunda onda folicular (BODENSTEINER, et. al., 1996).
Alguns trabalhos têm demonstrado que qualquer folículo saudável ou em
crescimento é capaz de se tornar dominante. O aumento da concentração sérica de FSH,
decorrente da destruição do folículo dominante após a divergência, resulta na dominância
do maior folículo subordinado (KO, et al., 1991, GINTHER, et al., 2000). Da mesma
forma, um folículo aleatoriamente escolhido dentre um grupo de folículos de 5 mm, no
início da onda folicular, pode ser direcionado para a dominância após a aspiração de todos
os outros da onda (GIBBONS; GINTHER, 1997).
Tratamentos com FSH no início do desenvolvimento folicular estimulam muitos
folículos a obterem diâmetro de dominância (ADAMS, et al., 1994), sendo à base dos
protocolos de superovulação com FSH para colheita de embriões.
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A superovulação é uma eficiente técnica para se obter várias progênies de
fêmeas geneticamente superiores e pode ser realizada mediante aplicação
seriada de FSH no início da 2a onda folicular, ou seja, entre os dias 9 a 12 do ciclo
estral (GOULDING, et al., 1990). A resposta ovariana a superovulação depende
do número de folículos presentes no ovário sensíveis a gonadotrofina e do estágio
da onda folicular no momento em que a aplicação de FSH é iniciada
(DRIANCOUT, 2001). No entanto, um dos principais inconvenientes observados
nos programas de superovulação é a necessidade de iniciar o tratamento
hormonal em momento determinado do ciclo estral (BO, et al., 2000).
Outro inconveniente da SOV é a baixa consistência na produção de
embriões viáveis pelas doadoras, um terço das doadoras tratadas não respondem
a SOV, por outro lado um terço produz em média 3 embriões e somente o terço
restante resulta em grande número de embriões transferidos (GALLI, et al., 2003).
Esta variação na resposta, têm-se transformado em fator limitante para o uso em
larga escala da tecnologia (ARMSTRONG, 1993; MAPLETOFT; PIERSON, 1993,
BO, et al., 1995). Dentre os fatores que podem ser responsabilizados por tais
variações, podemos citar a influencia do tipo, o grau de pureza, a dose e o
esquema de administração do hormônio (BECKER; PINHEIRO, 1986;
MAPLETOFT; PIERSON, 1994), estado nutricional da doadora (YAAKUB, et al.,
1999; SIDDIQUI, et al., 2002), histórico reprodutivo, idade, estação do ano, efeito
de repetidas superovulações (MAPLETOFT; PIERSON, 1994), raça, Bos indicus
quando comparada a raças européias (BARROS; NOGUEIRA, 2001), além da
condição folicular no início do tratamento superovulatório (MONNIAUX, et al.,
1983; GRASSO, et al., 1989; PIERSON; GINTHER, 1988; BUNGARTZ;
NIEMMAN, 1994, BO, et al., 1995) que pode estar diretamente relacionada a fase
ideal para se iniciar a estimulação hormonal exógena.
A estimulação hormonal com FSH pode ser iniciada antes da emergência
da onda folicular ou no dia da emergência (GOULDING, et al., 1990; NASSER, et
al., 1993; ADAMS; ROBERTS, et al., 1994; BO, et al., 1995; STOCK, et al., 1996),
ou seja, antes dos folículos subordinados iniciarem seu processo de atresia (BO,
et al., 1995).
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xxi
Segundo PIERSON et al. (1988), GRASSO et al. (1989), GUIBAULT et al.
(1991) e ADAMS et al. (1993), o início de tratamentos com gonadotrofinas na
presença de um folículo dominante ou após a seleção do folículo dominante
resulta em uma redução da resposta superovulatória.
BERGFELT et al. (1994) e MERTON et al. (2002), iniciaram a
superovulação 48 e 38 a 46 horas, respectivamente, após a aspiraçãoe obtiveram
melhores resultados.
Em vista dessas informações, uma alternativa para se obter uma melhor
resposta superovulatória é controlar a dinâmica folicular (BO, et al., 2000), ou a
emergência da nova onda folicular em programas de transferência de embriões. A
sincronização da emergência da onda folicular tem como objetivo remover o efeito
supressivo do folículo dominante e iniciar uma nova onda (BO, et al.,1995; 2000),
situação que ocorre normalmente em animais entre os dias 8º e 12° após a
detecção do estro.
Existem diferentes métodos pelos quais se pode controlar a dinâmica
folicular em bovinos. Estudos demonstraram que a eliminação do folículo
dominante, por métodos físicos ou hormonais, resultam em aumento de FSH e
desta forma emergência de uma nova onda folicular num período de tempo
conhecido (ADAMS, et al., 1992; BO; GHINTHER, et al., 1996; MIHM, et al.,
1997). A possibilidade de utilização de estradiol (BO, et al., 1993,1994;
CARRIERE, et al., 1995) ou estradiol associado a progestágenos (BO, et al., 1991;
1996) para sincronizar a onda folicular, vem sendo muito utilizado em protocolos
de superovulação em bovinos (BO, et al., 1995b, 1996; BROADBENT, et al., 1995;
ANDRADE, et al., 2002a,b,c; OLIVEIRA, et al., 2002). Quando a progesterona é
usada associada ao estrógeno, a emergência da nova onda folicular ocorre ao
redor de 4 ou 5 dias após o tratamento ( BO, et al., 1995, 1996; CACCIA; BO,
1998; MAPLETOFT, et al., 1999). BO et al. (2000), demonstraram que o início do
tratamento com gonadotrofinas 4 dias após o tratamento com progesterona e
estradiol resulta em resposta superovulatória semelhante a iniciada na emergência
da segunda onda folicular ou entre os dias 8º e 12º do ciclo estral.
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xxii
O mesmo foi observado em vacas da raça Nelore, onde trabalhos utilizando
métodos hormonais para sincronizar a onda folicular para início da SOV
demonstraram que não há comprometimento da morfologia do embrião ou taxa de
gestação, quando comparado ao protocolo padrão e elimina a necessidade de
observar o cio, permitindo a superovulação de grande número de doadoras em
curto período de tempo (AZEVEDO; COELHO,1991; ANDRADE; OLIVEIRA, et al.,
2002; ANDRADE, et al., 2003).
Além dos métodos hormonais empregados para promover a sincronização
da emergência da onda folicular em vacas, o método físico através da aspiração
folicular guiada por ultra-sonografia transvaginal vem sendo utilizado com
sucesso.
BERGFELT et al. (1994), realizaram aspiração folicular de todos os folículos
maiores ou iguais a 5 mm de diâmetro, em estágio aleatório do ciclo estral, e
constataram aumento no nível sérico de FSH em 24 horas e emergência da nova
onda folicular em torno de 48 horas após a aspiração folicular. O mesmo foi
constatado por trabalhos com aspiração somente do folículo dominante, tanto em
novilhas Bos taurus (AMARIDIS, et al., 1999; ADAMS, et al., 1994; BERGFELT,
1994) quanto Bos indicus (BURATINE, et al., 2000).
SHAW et al. (1999) e MERTON (2003), estudando procedimentos de
superovulação com aspiração prévia do folículo dominante observaram aumento
no índice de embriões viáveis de 3,9 a 5,9. GRADELA et al. (2000), avaliando em
vacas Nelore a resposta da SOV iniciada na presença ou ausência do FD e após a
aspiração do FD observaram que a resposta superovulatória das doadoras não
diferiu entre os grupos, mas a taxa de viabilidade embrionária foi maior nos grupos
sem FD (69,4%) e FD aspirado (68,99%) quando comparados ao grupo com FD
presente (48,54%).
No início da década de 90, com a introdução da Ovum Pick-up, seguida
pela produção in vitro de embriões (OPU-PIV), a expectativa no incremento da
produtividade das fêmeas aumentou. A aplicação da OPU-FIV é de grande
importância para a multiplicação rápida de animais, e exibe algumas vantagens
quando comparada com a MOET. NIBART et al. (1995), demonstraram que se
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pode obter até 18 gestações em três meses utilizando aspiração folicular,
enquanto com a TE clássica, no mesmo período, seria possível obter apenas 5
gestações. Desta forma pela OPU-FIV é possível produzir 2 a 3 vezes mais
embriões por unidade de tempo quando comparado à TE convencional. Outras
vantagens da OPU-PIV são a obtenção de oócitos em qualquer fase do ciclo estral
sem tratamento gonadotrófico (MERTON, et al., 2003), possibilitando realizar
repetida recuperação de oócitos de animais vivos sem trauma aparente do trato
reprodutivo, permitindo, desta forma, a produção de embriões oriundos de vacas
senis (BROGLIATTI; ADAMS, 1996), com patologias reprodutivas adquiridas
(LOONEY, et al., 1994; HASLER, et al., 1995; RODRIGUES; GARCIA, 2000),
prenhes, durante o primeiro trimestre de gestação (BUNGARTZ, et al., 1995;
MEINTJES, et al., 1995) ou em novilhas pré-púberes (ARMSTRONG, et al.;
ADAMS, 1994; BROGLIATTI, 1996). Outra vantagem particular da FIV em relação
a outras biotecnologias é a maximização do uso do sêmen, permitindo maior
produção de embriões com doses de alto valor comercial e inclusive sêmen
sexado (FABER, et al., 2003).
Entretanto, as taxas de blastocistos bovinos oriundos de oócitos maturados
e fertilizados in vitro têm permanecido relativamente estáticas na última década,
somente em torno de um terço (LONERGAN, et al., 1994, THOMPSON;
DUGANIZICH, 1995), 15 a 20% (HENDRIKSEN, et al., 2000) ou 35% (DAYAN,
2001) dos oócitos selecionados morfologicamente antes de serem submetidos a
MIV resultam em embriões viáveis. Segundo PEIXER et al. (1995), além dos
baixos índices de blastocistos, a produção in vitro de embriões ainda apresenta
algumas limitações: qualidade biológica dos embriões, dificuldades na
criopreservação dos embriões e dos oócitos, menor viabilidade dos oócitos obtidos
de bezerras em relação aos de vacas e novilhas, e o custo, que é superior ao
embrião produzido pela transferência de embriões (TE).
Buscando obter maior número de embriões em curto espaço de tempo, os
protocolos têm geralmente consistido de uma ou duas aspirações semanais
usando animais superovulados ou não (LOONEY, et al., 1994; BOLS;
BUNGARTZ, et al., 1995; HASLER, et al., 1995; STUBBINGS, 1995). Embora a
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aspiração realizada 2 vezes por semana aumente o número de folículos, oócitos
recuperados e embriões produzidos (GIBBONS, et al., 1994), a alta freqüência e o
curto intervalo entre as aspirações afeta negativamente o número de oócitos
(HASLER, et al., 1995; BOUSQUET, et al., 1999) a longo prazo.
Têm sido reportadas taxas de recuperação de oócitos em torno de 2 a 3 por
doadora, por sessão de aspiração (PIETERSE, et al., 1988), 4,7 (BOUSQUET, et
al., 1999), 9,7 (DAYAN, et al., 2000) e acima de 11 oócitos (BORDIGNON, et al.,
1997) .
Existe também uma ampla variação na produção de oócitos e embriões,
KRUIP et al. (1994), relataram variação entre as doadoras de 9 a 26% e HASLER
et al. (1995), variação entre 4% a 33%. DAYAN et al. (2000a), observaram
variação entre 14 e 54% na produção de embriões em 20 doadoras submetidas a
OPU-FIV.
Essa variação pode estar diretamente relacionada ao fato de que o oócito
para ser fertilizado in vivo é obtido através da ovulação de um folículo saudável,
durante uma fase específica do ciclo estral e os oócitos aspirados para a produção
in vitro são obtidos de folículos em diferentes estágios do desenvolvimento
(LONERGAN, et al., 1994; HENDRIKSEN, et al., 2000), em fases distintas do ciclo
estral (MACHATKOVÁ, et al., 1996), portantoexpostos a diferentes concentrações
de FSH, podendo levar a uma diminuição na competência oocitária
(MACHATKOVA, et al., 2004).
Vários estudos têm demonstrado que a fase do ciclo estral e inclusive do
desenvolvimento folicular influenciam a competência oocitária, uma vez que o
diâmetro do folículo afeta diretamente o oócito (MACHATKOVA, et al., 2004). Em
alguns estudos, oócitos provenientes de folículos maiores se desenvolvem melhor
in vitro, onde se observou aumento na produção de embriões de oócitos aspirados
de folículos médios e grandes quando comparado a folículos pequenos (PAVLOK,
et al., 1992; LOONERGAN, et al., 1994; ARLOTTO, et al., 1996; HAGEMANN, et
al., 1999b). Provavelmente devido a fase de dominância do ciclo estral onde o
folículo dominante afeta negativamente a competência oocitária dos folículos
subordinados induzindo avanço no estádio de atresia (HENDRIKSEN, et al.,
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2000). No entanto, CAROLAN et al. (1996), SENEDA et al. (2001), não
observaram influência do diâmetro folicular sobre a competência do oócito,
analisando oócitos aspirados de folículos pequenos e grandes.
MACHATKOVA et al. (1996), comparando a aspiração em diferentes
estádios do ciclo estral, demonstraram que oócitos colhidos nos dias 14 a 16 do
ciclo apresentavam melhores índices de competência para o desenvolvimento até
balstocisto quando comparados aos aspirados nos dias 7, 8 e 9. Em outro estudo,
oócitos colhidos de folículos subordinados nos dias 2, 3 e principalmente no dia 7
da onda, demonstram menor competência que aqueles recuperados no dia 5
(VASSENA, 2003). HAGEMAN (1999), MACHATKOVA et al. (2000), concluem
que o desenvolvimento até balstocisto é significativamente maior em oócitos
colhidos durante a fase de crescimento folicular comparado à fase de dominância
independente do diâmetro do folículo, porém a competência oocitária tendeu a
aumentar em oócitos oriundos de folículos maiores.
CASTILHO; GARCIA (2003), estudando a fase da 1ª onda e o diâmetro
folicular sobre a competência oocitária em Nelore observaram que não houve
efeito do diâmetro folicular sobre a produção de balstocistos, mas houve interação
do diâmetro com a fase folicular e concluíram que a competência é melhor nos
folículos pequenos no início da onda e melhora nos folículos maiores com o
avanço da onda. O mesmo foi observado por MACHATKOVA et al. (2004) em Bos
taurus.
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III. MATERIAL E MÉTODOS
Local do Experimento
Os experimentos para colheita de material (oócitos e embriões) foram
desenvolvidos na Agropecuária J. Garcia localizada no município de Regente Feijó
– SP e Fazenda Experimental da Unoeste localizada no município de Presidente
Bernardes – SP. Posteriormente os oócitos foram enviados ao Laboratório de
Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução
Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária (FCAV) da Universidade
Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de Jaboticabal – SP, para produção in vitro
(PIV) dos embriões.
Animais
Foram utilizadas 23 fêmeas adultas da raça Nelore (Bos taurus indicus), com idade
entre quatro a nove anos, pesando em média 500 Kg. As fêmeas, em perfeitas condições
sanitárias e reprodutivas foram mantidas em pasto de Brachiaria decumbens, com acesso a
água e sal mineral Ad libitum.
Tratamentos
As fêmeas foram submetidas a uma aspiração folicular – aspiração folicular
referência (OPU 1) em fase aleatória do ciclo estral, seguida pela inserção de implante de
liberação lenta de progestágeno (Crestar® Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda).
Em torno de 48 a 60 horas após a aspiração iniciou-se o tratamento de supererovulação
ovariana (SOV) utilizando-se FSH (Folltropin® Vetrepharm Inc. Ontário, Canadá) na dose
total de 180 mg por vaca, com duração de quatro dias consecutivos, em oito aplicações
(quadro 1). Durante a sexta e sétima aplicação de FSH foi administrada por via IM 500 mg
de PGF2a (Preloban® Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda) e o implante de
progestágeno foi retirado durante a administração da sétima dose de FSH.
Quadro 1. Esquema de superovulação com FSH:
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Horário Dia 1
(FSH)
Dia 2
(FSH)
Dia 3
(FSH/ PGF2a)
Dias4
(FSH/ PGF2a)
7:00 h 40mg 20mg 20mg 10mg + 500 mg
19:00 h 40mg 20mg 20mg + 500 mg 10mg
Aproximadamente 12 horas após o término da SOV, as fêmeas receberam 25mg de
LH exógeno (Lutropin-V® Vetrepharm, Beleville, Ontário, Canadá) para causar ovulação e
realizar a IA com tempo fixo. Foram realizadas 2 inseminações com intervalo de 12 horas,
sendo que a 1ª inseminação ocorreu 12 horas após a administração de LH, utilizando sêmen
congelado da raça nelore em palhetas de 0,5 mL, descongelado de acordo com o critério
indicado pelas centrais (36°C por 30’).
No dia da colheita dos embriões as fêmeas foram divididas em seis tratamentos que
variaram de acordo com o momento da aplicação de PGF2a após a colheita de embrião
(Dia 0) e a aspiração folicular (OPU2) realizada após a SOV (figura 1). Os tratamentos
realizados foram:
T (0-144) – aplicação de PGF2á imediatamente após a colheita de embriões e
aspiração 144 horas após a administração de PGF2á;
T (48-120) – aplicação de PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração
120 horas após a administração de PGF2á;
T (48-96) – aplicação de PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração
96 horas após a administração de PGF2á;
T (72-96) – aplicação de PGF2á 72 horas após a colheita de embriões e aspiração
96 horas após a administração de PGF2á;
T (96-72) – aplicação de PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração
72 horas após a administração de PGF2á;
T (96-48) – aplicação de PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração
48 horas após a administração de PGF2á
A PGF2a foi administrada em diferentes momentos para avaliar se haveria efeito da
fase da primeira onda folicular na segunda aspiração folicular (OPU 2) e avaliar se esta
segunda aspiração seria afetada pela prévia superovulação.
Tratamento – T(0-144) (n=4)
144 horas
Dia 0 OPU 2
PGF2á
Tratamento – T(48-120) (n=5)
48 horas 120 horas
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Dia 0 PGF2á OPU 2
Tratamento – T(48-96) (n=4)
48 horas 96 horas
Dia 0 PGF2á OPU 2
Tratamento – T(72-96) (n=3)
72 horas 96 horas
Dia 0 PGF2á OPU 2
Tratamento – T(96-72) (n=4)
96 horas 72 horas
Dia 0 PGF2á OPU 2
Tratamento – T(96-48) (n=3)
96 horas 48 horas
Dia 0 PGF2á OPU 2
Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados após a colheita de
embriões em 23 fêmeas nelore.
D 0 – dia da colheita dos embriões/ n – número de animais
Aspiração Folicular
O procedimento de aspiração folicular foi realizado utilizando-se equipamento de
ultra-som Aloka SSD-500 com transdutor microconvexo de 5 mHz (UST 974-5) conectado
a guia de biópsia adaptado por Chuck Bolland, com agulhas 18 G, (Cook VBOAS 1855) e
linha de aspiração (Cook VBOA 18L) em tubos de centrífuga de 50 mL. A pressão de
vácuo foi obtida com uma bomba Cook V-MAR 5000, ajustada entre 72 e 78 mmHg.
Para evitar movimentos peristálticos e desconforto ao animal foi feita anestesia
epidural com 5 mL de Lidocaína a 2% (Pearson®) e em seguida o transdutor foi inserido
até o fundo vaginal e, com o auxílio da manipulação transretal, os ovários foram
posicionados para obtenção de uma boa visualização na tela do ultra-som. Os folículos a
serem aspirados foram posicionados no percurso da linha depunção indicada na tela do
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ultra-som e quando a agulha se aproximou do folículo a ser aspirado, o pedal da bomba de
vácuo foi pressionado e o folículo aspirado (NIBART et al., 1995), o mesmo procedimento
foi repetido em todos os folículos visíveis de cada ovário. A lavagem da agulha e o meio de
recebimento dos oócitos foi composto de DPBS (Dulbeco Modificado - Nutricell) acrescido
de 5,0 UI/mL de heparina sódica (Liquemineâ ) e 50 mg/mL de Gentamicina (Gentocinâ ).
Lavagem, seleção dos oócitos
O material aspirado foi transferido para o filtro de colheita de embriões
(EmCom®) e lavado com a mesma solução utilizada na aspiração. O sedimento
restante no filtro foi observado em placas de Petri e efetuado a busca e contagem
dos oócitos e posterior classificação da qualidade. Os oócitos foram classificados
de acordo com sua morfologia (número de camadas de células do cumullus e
aspecto do citoplasma) em graus I, II e III (GI, GII e GIII), oócitos sem cumullus
(s/c), expandidos (exp), degenerados (deg) e atrésicos (atr), segundo LONERGAN
(1992). Os oócitos considerados viáveis foram classificados como GI, GII e GIII,
lavados em solução TCM 199 Hepes (Gibco) suplementado com 10% SFB
(Gibco), 50 µg de gentamicina, 2,2 µg de piruvato e transportados em criotubos
(Corning®) contendo meio de maturação em banho Maria a 35°C.
Transporte dos oócitos
Os oócitos foram transportados em meio de maturação composto por meio
TCM 199 Bicarbonato, suplementado com 10% SFB, 50UI de hCG/mL, 0,5 mg/mL
de FSH, 1mg/mL de estradiol, 2,2µg/mL de piruvato, 70 µg/mL de amicacina em
atmosfera de 5% de CO2 e 5% de O2. O tempo médio de transporte variou de 6 a
8 horas, não ultrapassando 8 horas do início da aspiração na primeira vaca até a
chegada dos oócitos ao laboratório.
Maturação in vitro (MIV)
Chegando no laboratório os oócitos foram lavados três vezes em meio de lavagem
TCM-199 Hepes, suplementado com 10% de SFB e 70 mg de amicacina. Em seguida,
foram transferidos para placas de Petri, em microgotas de 100 mL de meio de maturação,
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que consistiu de meio TCM 199 Bicarbonato, suplementado com 10% SFB, 50UI de
hCG/mL, 0,5 mg/mL de FSH, 1mg/mL de estradiol, 2,2µg/mL de piruvato, 70 µg/mL de
amicacina. Os oócitos permaneceram incubados por 24 horas a 38,5°C em atmosfera de 5%
de CO2 em ar.
Fecundação in vitro (FIV)
Os oócitos maturados foram lavados três vezes em meio de fecundação
TALP-FIV e transferidos para microgotas de 100mL de meio de fecundação Tyrode
modificado (TALP) suplementado com 10 mg/mL de heparina e 160 mL da solução
PHE. O sêmen congelado foi separado em Gradiente de Percoll 90 e 45%,
submetido a uma força de centrifugação de 900g durante 30 minutos. O sedimento
foi recuperado e avaliado quanto ao volume, concentração e motilidade
espermática. A concentração final foi ajustada para 25 x 106 espermatozóides
vivos por mL, de modo que, ao adicionar 4mL do sêmen em cada microgota de
100mL de meio TALP-FIV-Gotas, obteve-se a concentração final de 100x103
espermatozóides vivos por gota. Posteriormente, foram incubados em temperatura
de 39°C por 18 a 20 horas, com atmosfera de 5% de CO2 em ar, para a
fecundação.
Cultivo in vitro (CIV)
Após o tempo de fecundação, os zigotos foram lavados por três vezes em meio SOF
e as estruturas transferidas para microgotas com 100 µL de meio de cultivo, recobertas por
óleo mineral, permanecendo nestas por um período de 6 a 8 dias até os zigotos atingirem os
estádios de mórula (Mo) e blastocisto (Bl). O meio de cultivo foi renovado em cada
microgota no terceiro e quinto dia (feeding) e no 6º e 7º dia foi observado o
desenvolvimento embrionário.
Colheita de embriões
Sete dias após a primeira IA, os embriões foram colhidos pelo método não cirúrgico
como descrito por NEWCOMB et al. (1978), utilizando-se Solução Salina Fosfatada
Tamponada (DPBS – Dulbecco Modificado-Cutilab), contendo 1% de Soro Fetal Bovino
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(SFB), ou seja, 10 mL de SFB em 1 litro de DPBS, ambos a 37°C e recuperados em filtro
próprio (EmComÒ ).
Manipulação e Avaliação Morfológica dos Embriões TE
Os embriões foram rastreados e transferidos para Placa de Petri contendo DPBS
enriquecido com 10% de SFB. Posteriormente foi avaliado o estádio de desenvolvimento
do embrião (mórula, blastocisto, blastocisto em expansão e balstocisto eclodido)
(LINDNER & WRIGHT-JR, 1983). Quanto ao formato e integridade da zona pelúcida e a
morfologia foram classificados em normais, degenerados, não fertilizados e sem zona
pelúcida (BOLAND et al., 1978).
Análise Estatística
Os dados referentes à aspiração folicular realizada após a superovulação
(OPU 2) foram avaliados pelo teste do Qui-Quadrado. Para verificar se houve
diferença com relação aos resultados da OPU 2 quando comparamos com os
resultados da OPU 1 (referência), utilizou-se um delineamento inteiramente
casualizado
utilizando o procedimento GLM (General Linear Model) no software
Statystical Analysis System (SAS), seguido pelo teste de Duncan para estabelecer
a comparação entre médias. Neste caso, as variáveis analisadas (percentual de
oócitos viáveis e a taxa de blastocistos) foram obtidas a partir das diferenças com
relação aos resultados da OPU 2 quando comparados com os resultados da OPU
1 (referência).
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IV. RESULTADOS
A aspiração folicular referência (OPU 1), em 23 vacas da raça Nelore, foi
realizada em 6 sessões de aspiração resultando na recuperação de 299 oócitos
(média de 13 por animal), dos quais 223 (74,5%), uma média de 9,6 por animal,
foram submetidos a maturação e fecundação in vitro produzindo 44 blastocistos
(19,7%), uma média de 1,9 por animal. Embora a OPU 1 tenha sido realizada em
fase aleatória do CE os dados foram agrupados por tratamento, pois a aspiração
referência (OPU 1) e OPU 2 foi realizada nos mesmos animais para avaliar a
resposta destes mesmos indivéduos aspirados em fase aleatória e posteriormente
em tempo determinado. Portanto quando os animais foram agrupados por
tratamentos, o percentual de oócitos viáveis variou de 61,5 a 88,9%, sendo em
média 74,5%, enquanto o desenvolvimento dos oócitos maturados até blastocisto
variou de 1,9 a 54,2%, sendo em média 19,7% (Tabela 1).
Tabela 1. Número de animais aspirados, total de oócitos recuperados, número e
percentual de oócitos viáveis e número e percentual de blastocistos obtidos em
fase aleatória do ciclo estral na aspiração referência (OPU 1) de 23 vacas da raça
nelore agrupadas em 6 sessões de acordo com o tratamento da OPU 2.
Número de oócitos BlastocistosSessões
OPU
no de
animais
Total Viáveis (%) no %
1ª T (0 – 144) 4 38 29 (76,3) 9 31,0
2ª T (48 – 120) 5 61 53 (86,9) 1 1,9
3ª T (48 – 96) 4 52 32 (61,5) 6 18,8
4ª T (72 – 96) 3 34 23 (67,6) 4 17,4
5ª T (97 – 72) 4 87 62 (71,3) 11 17,7
6ª T (96 – 48) 3 27 24 (88,9) 13 54,2
Total 23 299 223 (74,5) 44 19,7%
Resultados da produção in vitro das sessões de aspiração folicular realizadas em fase aleatória do ciclo estral na aspiração
referência (OPU 1), agrupadas conforme os tratamentos da OPU 2: T (0-144), T (48-120), T (48-96), T (72-96), T (96-72), T
(96-48).
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Após a aspiração folicular referência (OPU 1) as mesmas fêmeas foram
superovuladas para colheita in vivo de embriões e aspiradas novamente (OPU 2)
em diferentesmomentos da 1º onda folicular após a superovulação (Tabela 2). Do
total de 252 oócitos recuperados (média de 10,9 por animal), 73,8% ou 186 (média
de 8,1 por animal) foram classificados morfologicamente como viáveis e
submetidos à maturação e fecundação in vitro, resultando em 17,2% ou 32
blastocistos (média de 1,4 por animal).
O número de oócitos recuperados e produção de blastocistos (total e
percentual) foram afetados (P<0,05) pelo momento da aplicação de PGF2a e a
segunda aspiração folicular (OPU 2) e podem ser observados na tabela 2.
Tabela 2. Número de animais, total de oócitos aspirados, número e percentual de
oócitos viáveis e número e percentual de blastocistos obtidos de vacas da raça
nelore aspiradas em diferentes momentos da 1ª onda folicular após a
superovulação (OPU 2) nos tratamentos T (0-144), T (48-120), T (48-96), T (72-
96), T (96-72) e T (96-48).
Número de oócitos BlastocistosTratamento no de
animais
Total Viáveis (%) no %
T (0 – 144) 4 41 29 (70,7) b 14 48,3 a
T (48 – 120) 5 58 52 (89,7) a 6 11,5 b
T (48 – 96) 4 61 41 (67,2) bc 6 14,6 b
T (72 – 96) 3 21 17 (81,0) ab 2 11,8 b
T (96 – 72) 3 56 42 (75,0) ab 3 7,1 b
T (96 – 48) 4 15 05 (33,3) c 1 20,0 ab
Total 23 252 186 (73,8%) 32 17,2%
Letras diferentes diferem entre si dentro da coluna (p<0,05). Tratamentos:
T (0-144) – PGF2á imediatamente após a colheita de embriões, aspiração 144 horas após a injeção de PGF2á
T (48-120) – PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 120 horas após a injeção de PGF2á
T (48-96) – PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 96 horas após a injeção de PGF2á
T (72-96) – PGF2á 72 horas após a colheita de embriões e aspiração 96 horas após a injeção de PGF2á
T (96-72) – PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 72 horas após a injeção de PGF2á
T (96-48) - PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 48 horas após a injeção de PGF2á
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O percentual de oócitos viáveis foi menor (P<0,05) no T (96-48) (33,3%),
quando a PGF2a foi aplicada 96 horas depois da colheita de embriões e 48 horas
após foi realizada a OPU 2, comparando aos demais tratamentos. No tratamento
T (48-120), a PGF2á foi administrada 48 horas após a colheita de embriões e 120
horas após foi realizada a OPU 2 e obteve-se o maior percentual de oócitos
viáveis entre os tratamentos (89,7%), diferindo dos tratamentos T (0-144), T (48-
96) e T (96-48) que obtiveram 70,7%, 67,2% e 33,3%, respectivamente. Os
tratamentos T (72-96) e T (96-72) não diferiram entre si (P<0,05) do tratamento T
(48-120) quanto ao número de oócitos viáveis.
Com relação à taxa de embriões produzidos in vitro, o melhor tratamento
observado foi o T (0-144) com 48,3% de blastocisto, que diferiu dos tratamentos T
(48-120), T (48-96), T (72-96) e T (96-72) e não diferiu (P<0,05) do T (96-48).
(Tabela 2)
Uma vez que os animais foram submetidos a duas aspirações foliculares
com um tratamento superovulatório intermediário foi estabelecida uma
comparação da produção in vitro entre a OPU 1 (referência) e OPU 2 como
demonstra a tabela 3, onde observa-se que a produção de embriões no T (96-48)
foi significativamente menor (p<0,05) quando comparada aos demais tratamentos,
os quais não deferiram entre si (p>0,05).
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Tabela 3. Comparação entre médias dos resultados de número de oócitos viáveis
e taxa de blastocisto obtidos na OPU 2 e comparadas aos resultados
da OPU 1 (referência) em 23 vacas da raça nelore aspiradas em fase
aleatória do ciclo estral ou agrupadas em diferentes tratamentos.
Diferenças entre OPU 1 e OPU 2*
Tratamentos Oócitos viáveis
Diferença (%)
BlastocistosNS
Diferença (%)
T (0-144) -6,08 a 17,42
T (48-120) 8,34 a 0,66
T (48-96) -4,93 a 12,13
T (72-96) 8,77 a 6,3
T (96-72) -11,98 a -10,63
T (96-48) -61,1 b -34,97
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de Duncan (p<0,05).
NS –não significativo (p>0,05). * diferenças entre os resultados (percentual de oócitos viáveis e a taxa de
blastocistos) da OPU 2 comparada a OPU 1 (referência) para estabelecer a comparação entre médias.
O gráfico 1 demonstra o percentual de oócitos viáveis e balstocistos obtidos
na aspiração referência (OPU 1) e na aspiração folicular realizada em diferentes
momentos da primeira onda folicular após a superovulação.
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OPU1 e OPU2 - % oócitos e Bl
76,3
86,9
61,5
67,6
88,9
71,370,7
89,7
67,2
81
33,3
75
31
1,9
18,8 17,4
54,2
17,7
48,3
11,5 14,6 11,8
20
7,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 - 144 48 - 120 48 - 96 72 - 96 96 - 48 96 - 72
Tratamentos
%
oó
ci
to
s
vi
áv
ie
s/
%
Bl
% oócitos viáveis - OPU 1 % oócitos viáveis - OPU 2 % Bl viáveis - OPU 1 % Bl viáveis - OPU 2
Gráfico1. Resultado da % média de oócitos viáveis recuperados e taxa de
blastocistos obtidos de oócitos aspirados em fase aleatória do ciclo
estral na aspiração referência (OPU 1) e em diferentes momentos
da primeira onda folicular após o tratamento superovulatório (OPU
2), realizado em 23 fêmeas da raça nelore, agrupadas nos
tratamentos T(0-144), T (48-120), T(48-96), T(72-96), T(96-72) e T
(96-48), de acordo com o tempo de administração de PGF2á após
a colheita de embriões e o momento da segunda aspiração após a
SOV (OPU 2).
A produção in vivo de embriões (TE) nas 23 vacas da raça Nelore resultou
em 72 embriões (3,1 por animal), dos quais 73,6% ou 53 (2,3 por animal) foram
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classificados morfologicamente como viáveis e 26,3% ou 19 (3,1 por animal) foram
classificados como não viáveis (Tabela 4).
Tabela 4. Número de animais, número e média total de embriões recuperados,
número de embriões não viáveis, número, média e percentual de
embriões viáveis produzidos in vivo.
Produção de embriões in vivo
Sessões n Total e
média
Não
viáveis
Viáveis
e média
% Viáveis
1ª T (0 – 144) 4 17 (4,2) 1 16 (4,0) 94,1
2ª T ( 48 – 120) 5 7 (1,4) 6 1 (0,2) 14,3
3ª T (48 – 96) 4 12 (3,0) 1 11 (2,7) 91,7
4ª T (72 – 96) 3 1 (0,3) 1 0 (0,0) 0,0
5ª T 96 – 72) 4 19 (4,7) 7 12 (3,0) 63,2
6ª T (96 – 48) 3 16 (5,3) 3 13 (4,3) 81,3
Total 23 72 (3,1) 19 (26,3%) 53 (2,3) 73,6%
Produção in vivo de embriões realizada após a aspiração referência (OPU 1) e que precedeu a OPU 2.
V. DISCUSSÃO
No presente estudo com vacas da raça nelore a aspiração referência (OPU
1) realizada em fase aleatória do CE resultou em uma média 9,6 oócitos viáveis e
na OPU 2 a média, independente do tratamento, foi de 8,1 oócitos. Quando os
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animais foram agrupados por tratamentos o percentual de oócitos viáveis variou
de 33,3% no T (96-48) a 89,7% no T (48-120).
Essas médias obtidas são semelhantes as taxas de recuperação de oócitos
observadas por CASTILHO, (2003), SENEDA, et al., (2001) e DAYAN et al.,
(2000), 9,0, 9,2 e 9,7, respectivamente.
Com relação à taxa de blastocistos, na OPU 2, embora não houve diferença
significativa, os tratamentos que resultaram em maior taxa de desenvolvimento
embrionária foram o T (0 – 144) com 48,3% e T (48-120) com 11,5 % dos oócitos
maturados e fecundados atingindo o estágio de blastocisto. O desenvolvimento
embrionário em todos os tratamentos da OPU 2 variou de 7,1% a 48,3% e na OPU1, excluindo o valor de 1,9%, variou de 17,4% a 54,2% e ampla variação também
foi observada por KRUIP et al. (1994), 9 a 26% e HASLER et al. (1995), 4% a 33%
e DAYAN et al. (2000a), 14 e 54%.
Na produção in vivo de embriões, iniciada 48 a 60 horas após a OPU em
fase aleatória do CE, obtivemos uma média de 2,3 embriões por animal, que não
diferiu da média nacional nas doadoras zebuínas observada por BECKER et al. e
RODRIGUES et al., (1988), ALVIM et al., 2000; ANDRADE et al., 2000; FONSECA
et al., 2000; NOGUEIRA et al., 2000; PENNA et al., 2000; PINTO et al., 2000) que
variou de 2,4 a 9,9 embriões. GRADELA et al. (2000), também não observaram
aumento de estruturas quando realizaram a SOV na ausência do FD, embora
houve melhora na viabilidade embrionária.
Quando analisamos por tratamentos obtivemos as melhores médias de
embriões produzidos in vivo nos tratamentos T (0-144) e T (96-48), 4,0 e 4,3, as
taxas intermediárias nos tratamentos T (48-96) e T (96-72), 2,7 e 3,0 e ausência
de produção nos tratamentos T (48-120) e T (72-96) que de acordo com GALLI
(2003) confirmam a baixa consistência na produção in vivo de embriões, sendo
que um terço das doadoras tratadas não respondem a SOV, um terço produz em
média 3 embriões e somente o terço restante resulta em grande número de
embriões transferidos.
Quando comparamos os tratamentos realizados na OPU 2, observou-se
que a recuperação no T(96-48), 5 oócitos (33,3%), foi significativamente menor
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que os demais tratamentos, demonstrando que o momento da aspiração folicular
muito próxima a administração de PGF2a apenas 48 horas prejudicou a
recuperação dos oócitos. È importante ressaltar que a resposta a superovulação
desses animais foi boa e a presença de muitos CLs nos ovários pode ter
dificultado a recuperação dos oócitos na OPU 2, reforçando o fato que a aspiração
realizada muito próxima a administração de PGF2a pode prejudicar a posterior
recuperação de oócitos. Por outro lado podemos observar que nos tratamentos
em que a aspiração folicular foi realizada a partir de 96 horas da aplicação de
PGF2á as taxas de oócitos não variaram, demonstrando que a recuperação e a
produção in vitro após a SOV é possível sem prejudicar os índices de produção.
Além da possibilidade da diminuição da recuperação dos oócitos em função
da presença de vários CLs nos ovários , outro fator que pode ter afetado
diretamente essa recuperação é a ausência da emergência da onda folicular até
48 horas após a colheita de embriões. Segundo ADAMS et. al (1992), FORTUNE
et al. (1993), GIBONS, GINTHER (1999), em torno de 24 a 36 horas após a
ovulação ocorre o crescimento de um grupo de folículos que é caracterizado como
a emergência da onda folicular no CE normal. No entanto, não existe na literatura
trabalhos que demonstrem o tempo de emergência da onda folicular após
superovulação, mas no presente trabalho podemos afirmar que até 48 horas após
a PGF2á não houve emergência da onda folicular e esta provavelmente ocorre
mais tarde em animais superovulados, pois acima de 72 horas observamos
aumento no percentual de oócitos recuperados e acima de 96 horas não houve
comprometimento da taxa de oócitos recuperados e produção de blastocistos.
É importante ressaltar que assim como no T (0-144) obteve-se a maior taxa
de blastocistos produzidos in vitro, também observou-se maior taxa de blastocistos
produzidos in vivo, demonstrando que a SOV além de não ter prejudicado a
recuperação na OPU 2, ainda gerou bom índice na produção de embriões in vivo.
Os resultados de recuperação de oócitos e taxa de balstocistos das
aspirações não variaram significativamente entre a OPU 1 e OPU 2, concluindo
que é possível realizar a alternância das biotecnologias sem prejudicar os índices
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de produção, desde que a OPU ocorra após a lise dos CLs presentes nos ovários
após a superestimulação.
VI. CONCLUSÃO
- a aspiração folicular realizada muito próxima à colheita de embriões
diminui significativamente a recuperação de oócitos;
- a superovulação realizada a partir de 96 horas após a aplicação de
PGF2a em animais previamente superovulados para colheita de embriões in vivo
não afeta a recuperação de oócitos e a produção in vitro de blasctocistos;
- é possível realizar a alternância das biotecnologias sem prejudicar
significativamente os índices de produção.
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VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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