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5/9/2014 1 Profa. Dra. Daniela L. Ambrósio ENZIMAS - Alto poder catalítico, alta especificidade para seus substratos e funcionam em soluções aquosas sob condições moderadas de temperatura e pH Introdução às enzimas - Fim de 1700: a catálise biológica foi conhecida – digestão da carne pelas secreções do estômago - 1800: conversão de amido em açúcar pela saliva e extratos de plantas - 1850: Pasteur concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” (não separáveis de céls vivas) - A vida depende da existência desses catalisadores, toda reação bioquímica é catalisada 5/9/2014 2 - Somente em 1930 esse pensamento foi aceito, após a cristalização de outras enzimas que eram proteínas (enzimas digestivas) - 1897: Buchner observou que o extrato de levedura poderia fermentar - Kuhne chamou essas moléculas de enzimas - 1926: a urease foi isolada e cristalizada por Sumner – todas as enzimas eram proteínas Muitas enzimas são proteínas - Com exceção dos RNAs catalíticos (ribozimas), todas as enzimas são proteínas - A atividade depende da conformação nativa - As enzimas tem PM que variam de 12 kDa a 1.000 kDa 5/9/2014 3 - Algumas requerem componentes químicos adicionais para o desempenho da função, chamados de co-fator (íons inorgânicos) e/ou coenzima (complexo orgânico ou molécula metalorgânica) - Grupo prostético: coenzima ou íon metálico ligado muito forte ou covalentemente à proteína - Holoenzima: enzima cataliticamente ativa completa, juntamente com sua coenzima ligada e/ou íon metálico - Apoenzima ou apoproteína: parte protéica da enzima - Isoenzima: enzimas diferentes que catalisam a mesma reação Denominações 5/9/2014 4 - Algumas enzimas apresentavam 2 nomes diferentes, por isso, foi criada uma concordância internacional para a nomenclatura e classificação das enzimas Classificação das enzimas - Muitas foram nomeadas pela adição do sufixo “ase” ao nome do substrato ou nome que descreva a atividade. Ex: urease (hidrólise da uréia), DNA polimerase (polimerização dos nts para formar o DNA) - Outras foram nomeadas pelos descobridores para uma função ampla, antes que a reação específica fosse determinada. Ex: pepsina, do grego pepsis, que significa digestão, lisozima de lise de paredes bacterianas. - 6 classes contendo subclasses, baseadas no tipo de reação catalisada 1) Oxidorredutases: transferência de elétrons (íons hidretos ou átomos de H) 2) Transferases: reações de transferência de grupos 3) Hidrolases: reações de hidrólise (transferência de grupos funcionais da água) 4) Liases: adição de grupos a ligações duplas, ou formação de duplas ligações pela remoção de grupos 5) Isomerases: transferência de grupos dentro de moléculas para produzir formas isoméricas 6) Ligases: formação de ligações C – C, C – S, C – O e C – N pelas reações de condensação acopladas à clivagem do ATP 5/9/2014 5 - A cada enzima é atribuído 4 números para classificação e um nome sistemático que identifica a reação que catalisa ATP glicose fosfotransferase (nome trivial – hexoquinase) n. EC (comissão de enzimas): 2.7.1.1 2 – nome da classe – transferase 7 – subclasse – fosfotransferase 1 – fosfotransferase com um grupo hidroxila como receptor 1 – D-glicose como grupo receptor de fosfato Lista completa da nomenclatura e classificação é mantida pelo Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímicos e Biologia Molecular (www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme) ATP + D-glicose → ADP + D-glicose 6-fosfato Como as enzimas trabalham? - A enzima fornece um ambiente específico dentro do qual uma reação possa ocorrer mais rapidamente - Ligação do substrato à enzima no sítio ativo - A superfície do sítio ativo está revestida com resíduos de aas com grupos que ligam o substrato e catalisam a sua transformação química - O complexo enzima-substrato foi proposto em 1880 por Wurtz 5/9/2014 6 - As enzimas afetam a velocidade da reação e não o seu equilíbrio - A energia livre do estado basal de P é menor do que de S, então o Go é negativo e o equilíbrio favorece a formação de P - Barreira energética: energia requerida para alinhamento dos grupos que reagem, a formação de cargas transitórias instáveis, os rearranjos de ligações e outras transformações requeridas para que a reação prossiga - Energia de ativação (G): diferença entre os níveis de energia do estado basal e do estado de transição. Alta energia de ativação corresponde a uma reação mais lenta - Estado de transição: nível energético mais alto 5/9/2014 7 - A velocidade da reação pode ser aumentada pela elevação da temperatura ou pela adição dos catalisadores que diminuem a energia de ativação, sem afetar o equilíbrio da reação Conversão da sacarose em CO2 e H2O - Go é grande e negativo - Sacarose é estável e a barreira de energia de ativação é elevada - Nas céls a sacarose precisar ser degradada rapidamente em CO2 e H2O para a obtenção de energia - enzimas - Intermediários de reação: formação e decaimento de espécies químicas transitórias – ES e EP 5/9/2014 8 Poder catalítico e especificidade - As enzimas são catalisadores poderosos – velocidade 5-17x Como a velocidade de reação é aumentada? - Durante a reação, os grupos funcionais catalíticos podem formar uma ligação covalente transitória com o substrato ou um grupo pode ser transferido transitoriamente – menor energia de ativação - A formação de ligações fracas no complexo ES específico libera energia livre (energia de ligação) 1894: Fischer – enzima complementar ao substrato como uma chave e fechadura 5/9/2014 9 - Polanyi (1921) e Haldane (1930) propuseram a moderna noção de catálise enzimática, que foi proposta por Linus Pauling em 1946 - Para catalisar uma reação, a enzima deve ser complementar ao estado de transição da reação - Nas enzimas então, algumas interações fracas são formadas no ES, mas a complementariedade total se dá quando o substrato alcança o estado de transição - Enzimas são grandes - interações suficientes para ligação e catálise do substrato 5/9/2014 10 - habilidade de discriminar entre o substrato e outra molécula competidora - Grupos funcionais na enzima fazem interações fracas com o substrato no estado de transição, uma outra molécula é incapaz de interagir no mesmo grau. Ex: OH no substrato interage com o Glu Especificidade - As enzimas são estereoespecíficas, conseguem distinguir isômeros - A energia de ligação é importante para a catálise: Rearranjo dos grupos nos C1 e 2, mas 80% da aceleração da reação se deve à interação do C3 com a enzima 5/9/2014 11 Fatores que contribuem para barreira da reação ES 1) Redução da entropia - Decréscimo da liberdade de movimentação das moléculas na solução, o substrato pode ser alinhado na enzima com interações fracas (energia de ligação) 2) Dessolvatação - O substrato faz ligações de H com a água. Essas ligações são substituídas pelas ligações fracas entre E e S 3) Distorção do substrato - A energia de ligação formada somente no estado de transição compensa termodinamicamente qualquer distorção do substrato 4) Alinhamento dos grupos funcionais catalíticos - Ajuste induzido – a enzima sofre alteração na conformação quando o substrato se liga, trazendo grupos funcionais específicos da enzima para a posição apropriada de catálise e também permite a formação de ligações fracas adicionais ao estado de transição 5/9/2014 12 Grupos catalíticos específicos - Mecanismos que envolvem a interação covalente transitória com o S ou a um grupo de transferência para ou de um S A) Catálise ácido-base geral - Intermediários carregados instáveis tendem a se degradar rapidamente às suas espécies reagentes constituintes- No sítio ativo da enzima, várias cadeias laterais podem atuar como doadores e receptores de prótons, reduzindo a energia livre. Essa transferência de prótons podem aumentar a velocidade de 102 a 105x 5/9/2014 13 B) Catálise covalente - Ligação covalente transitória é formada entre E e S, se considerarmos X como o grupo nucleofílico da enzima: C) Catálise por íons metálicos - Os metais ligados às enzimas podem ajudar o orientar o substrato para a reação ou estabilizar estados de transição e podem também mediar reações de oxido-redução - Quase 1/3 das enzimas requerem íons metálicos para a atividade - Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ e Co2+ 5/9/2014 14 - A maioria das enzimas utiliza uma combinação de várias estratégias catalíticas para o aumento da velocidade de reação. Ex: quimotripsina (catálise covalente e ácido-base geral) Cinética Enzimática - Determinação da velocidade de catálise de uma enzima e estudo de como ela se altera em resposta a modificações dos parâmetros experimentais - A concentração do substrato altera a velocidade das reações - Estudar o efeito da [S] é complicado pois a sua concentração se altera com o curso da reação in vitro a medida que o S é convertido em P Vo = velocidade inicial Vmáx = velocidade máxima (região do platô) saturação 5/9/2014 15 - 1913: Michaelis & Menten – a enzima primeiro se combina reversivelmente ao S numa etapa rápida e depois a quebra para produzir E + P é mais lenta - Estado estacionário: quando a [ES] permanece aproximadamente constante com o tempo Km = constante de Michaelis: (k2+k-1)/ k1 Quando Vo é ½ Vmáx: Diagrama de Lineaweaver-Burk ou duplo recíproco 5/9/2014 16 - A regra prática de que Km = [S] quando Vo = ½ Vmáx vale para todas as enzimas que seguem a cinética de Michaelis-Menten (a exceção são as enzimas reguladoras) - O Km pode variar grandemente de uma enzima para outra e para diferentes substratos para uma mesma enzima - O Km não pode ser considerada uma simples medida de afinidade do substrato, somente pode ser uma medida se afinidade se k2 < k-1 - Quanto menor o valor de Km, a eficiência catalítica máxima será atingida em baixas concentrações de S 5/9/2014 17 Enzimas que catalisam reações com 2 ou mais substratos Ex: hexoquinase - Reações com 2 substratos usualmente envolvem a transferência de um átomo ou um grupo funcional de um substrato para o outro - Os diferentes substratos podem se ligar simultaneamente à enzima ou não ATP + D-glicose → ADP + D-glicose 6-fosfato Mecanismos de ligação de 2 substratos A) Reação enzimática envolvendo um complexo ternário a) Ordem ao acaso b) Ordenado B) Reação enzimática sem a formação de complexo ternário 5/9/2014 18 Como o mecanismo enzimático pode ser determinado? - Um diagrama duplo recíproco é feito utilizando-se variações de [S1] enquanto [S2] é mantida constante Forma complexo ternário Não forma complexo ternário Inibição da atividade enzimática - Inibidores enzimáticos: diminuem ou param as reações enzimáticas - Muitos inibidores enzimáticos estão entre os compostos utilizados com fins farmacêuticos. Ex: aspirina inibe a enzima da primeira etapa da produção de prostaglandinas, que estão envolvidas com a dor 5/9/2014 19 1) Inibição reversível a) Competitiva - O inibidor compete com o substrato para a ligação no sítio ativo da enzima - O inibidor se assemelha ao substrato - A competição pode favorecer o S se adicionarmos mais S Inibição competitiva na terapia: tratamento na ingestão de metanol (gases anticongelantes) - O etanol compete com o metanol pelo sítio ativo da álcool desidrogenase do fígado metanol formaldeído Álcool desidrogenase 5/9/2014 20 b) Não-competitiva - Enzimas com sítios ativos para 2 ou + substratos - O inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio do S c) Mista - Se liga a um sítio diferente do S, mas se liga tanto em E quanto em ES 5/9/2014 21 2) Inibição irreversível - Se ligam de forma covalente ou destroem o grupo funcional da enzima ou se ligam de forma não-covalente, mas extremamente estável - Ferramenta útil para estudos de mecanismo de reação. Ex: quimiotripsina é inibida pelo diisopropilfluorofosfato (DIFP) - Inativadores suicidas: não são reativos até se ligarem ao sítio ativo de uma enzima específica. Ele sofre uma reação química e ao invés de ser convertido em um produto, é convertido em um composto que se liga irreversivelmente à enzima - Esses inativadores são importantes no planejamento racional de fármacos – específico para uma única enzima e que tenha ação somente no sítio ativo da mesma 5/9/2014 22 Atividade enzimática dependente de pH - Enzimas possuem um pH, ou um intervalo de pH, ideal para a máxima atividade - Relacionado com a presença das cadeias laterais do sítio ativo que podem funcionar como ácidos ou bases fracos (estado de ionização) Enzimas Reguladoras - Vias metabólicas: reações múltiplas de degradação ou síntese em vias seqüenciais, onde o produto de uma reação é o substrato para a outra - Enzimas reguladoras: aumento ou diminuição da atividade catalítica em resposta a certos sinais – ajuste às necessidades da célula - Em geral, a primeira enzima da via é a enzima reguladora - Tendem a ser proteínas com multisubunidades 5/9/2014 23 Modulação da atividade 1) Moduladores alostéricos - Geralmente metabólitos pequenos ou co- fatores que atuam por interação não- covalente reversível - Enzimas moduladas por este mecanismo são chamadas de enzimas alostéricas e sofrem uma mudança de conformação ao ligar o modulador - Os moduladores podem ser inibitórios ou estimuladores - Frequentemente o modulador é o próprio substrato – enzimas homotrópicas - A enzima alostérica geralmente possui 1 ou mais sítios reguladores para a ligação específica do modulador - As enzimas alostéricas são geralmente maiores e mais complexas que as não-alostéricas Ex: aspartato transcarbamilase – reação inicial na biossíntese de nt de pirimidina - Possui 12 subunidades, as subunidades reguladoras estão em vermelho e bege 5/9/2014 24 Inibição por retroalimentação - A enzima reguladora é inibida pelo produto final da via toda vez que a quantidade de produto excede as necessidades da célula - Quando a atividade da enzima reguladora é diminuída, as outras enzimas também diminuem a velocidade de catálise pela diminuição de substrato - Ex: conversão de L-treonina em L- isoleucina pela treonina desidratase - inibição alostérica heterotrópica Divergência da cinética de Michaelis-Menten Michaelis-Menten: curva hiperbólica Enzima alostérica: curva sigmóide [S]0,5 = K0,5 = [S] qdo Vo = ½ Vmáx 5/9/2014 25 2) Modificação covalente reversível - Grupos são removidos ou ligados a enzimas reguladoras por ação de outras enzimas - A modificação mais comum é a fosforilação (1/3 a ½ das proteínas eucarióticas) Fosforilação protéica - Adição de grupos fosfato é catalisada por proteínas quinases e a remoção por proteínas fosfatases - Se a cadeia lateral modificada estiver localizada em uma região crítica para a conformação, a modificação pode ter efeitos na ligação do substrato e catálise - A estrutura tridimensional determina se uma quinase terá acesso a um certo resíduo e reconhecê-lo como substrato 5/9/2014 26 Clivagem proteolítica de precursor enzimático - O precursor inativo, chamado de zimogênio (ou proenzima), é clivado para formar a enzima ativa (reação irreversível) – várias proteases são reguladas dessa forma Ativação de uma proenzima (zimogênio) A pela retirada de um segmento D pela enzima C, permitindo a conexão com o substrato B e sua hidrólise nos segmentos E. Ex: quimotripsina e tripsina 5/9/201427 Doenças relacionadas à enzimas - fenilcetonúria: mutação na fenilalanina hidroxilase, enzima da primeira etapa da conversão de fenilalanina em tirosina. O acúmulo de fenilalanina leva ao atraso mental – teste do pezinho - Xerodermia pigmentosa: mutações em enzimas envolvidas no reparo de DNA, podendo levar à formação de cancros Enzimas na Clínica - As enzimas podem ser utilizadas como reagentes altamente específicos e sensíveis em ensaios colorimétricos quantitativos Glicose + 2H2O + O2 ác glicônico + 2 H2O2 H2O2 + o-dianisidina d-dianisidina oxidase (corado) + H2O glicose oxidase peroxidase - Podem ser indicadores de lesões celulares e teciduais (Ex: infarto agudo do miocárdio, hepatite, etc) - Métodos que analisam o consumo do substrato Amido glicose + maltose + dextrinas Amido não hidrolisado + iodo complexo azul amilase 5/9/2014 28 - Métodos que analisam o produto formado p-nitrofenilfosfato p-nitrofenol (amarelo) + PiFosfatasealcalina timolftaleína monofosfato timolftaleína + Pi timolftaleína + tampão alcalino coloração azul Fosfatase alcalina - Métodos de absorção da coenzima (NADH absorve luz UV) Ác láctico + NAD+ ác pirúvico + NADH + H+desidrogenaseláctica (LDH)
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