Aula 11 Resumo Aula Desenho de primers Parte 02

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ 
CAMPUS DE PARNAÍBA 
CURSO DE BIOMEDICINA 
Disciplina: BIOINFORMÁTICA 
Prof. Jefferson Soares de Oliveira 
 
Resumo aula - Desenho de Primers – Continuação... 
 
 Uma vez que o programa Primer 3 sugeriu o par de primers, devemos verificar algumas de 
suas características. Dentre os parâmetros a serem analisados, devemos verificar as colunas 
“any_th”, “3’_th” e “hairpin”. Estas colunas indicam as temperaturas de formação de estruturas 
secundárias ou dímeros entre os primers. Caso ocorram em temperaturas próximas daquelas 
utilizadas nas etapas da PCR, ao invés do primer parear com a região do DNA de interesse ele estará 
pareando com outro primer, reduzindo a eficiência do processo. Como o programa realiza buscas por 
regiões que apresentem primers com boas características, dificilmente encontraremos sugestões de 
primers com valores próximos da temperatura de trabalho de uma PCR. Existem alguns programas 
(ex. GeneRunner) que permitem uma análise mais detalhada dos primers, mostrando as 
temperaturas em que cada um destes eventos (dímeros ou estruturas secundárias) se formam. Mas 
esta abordagem não será explorada em nossa disciplina. 
 Após obtenção dos primers, iremos realizar uma busca com o objetivo de verificar se o nosso 
par de primers anela preferencialmente com a região flanqueadora do éxon de interesse ou se há a 
possibilidade dele anelar com outras região do DNA. Caso ele apresente complementariedade com 
outras regiões, esta deverá ser analisada quanto a possibilidade deste evento acontecer durante a 
PCR. Para isso, o banco de dados do Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html) possui uma 
ferramenta exclusiva para se realizar este tipo de análise. Na pagina inicial do banco de dados, 
devemos acessar a ferramenta “BLAST/BLAT”, presente no topo da página. No campo “sequence 
data” devemos introduzir as sequências dos primers da direita e o da esquerda, lembrando que os 
mesmos devem ser introduzidos no formato FASTA. Em seguida, devemos verificar se mais abaixo a 
opção DNA está selecionada. Na linha “search against” confirmar o organismo selecionado (no nosso 
caso homo sapiens) e “DNA data bank” uma vez que estamos trabalhando com sequencias de 
nucleotídeos. Na linha “Search tool” devemos escolher a opção “BLASTN” e na linha “Search 
sensitivity” devemos escolher a opção “near match”. Esta ultima opção permite que sejam 
apresentados todos os possíveis alinhamentos, e não somente a região de melhor 
complementariedade. Em seguida devemos clicar na opção “Run” para iniciar a consulta. O processo 
de busca pode demorar alguns minutos e quando concluído aparecerá o texto “done” (feito), 
indicando que a consulta foi finalizada. 
 Em seguida, daremos início análise dos resultados. Clicando sobre o link “view results” do 
primeiro primer (Job 1) teremos informações sobre os seus possíveis pareamentos. Uma tabela será 
apresentada contendo informações gerais, como a localização genômica dos anelamentos (Genomic 
Localization), se o primer apresenta complementariedade com a região de algum gene (Overlapping 
gene) a orientação das fitas (Orientation), o comprimento do pareamento (Lenght), dentre outros. 
Com base nas informações apresentadas na tabela, para que nós possamos utilizar o par de primers, 
deveremos observar os seguintes parâmetros: 
1 – Todos os nucleotídeos do alinhamento que apresentou maior valor de score apresentaram 
complementariedade? 
2 – O resultado com o melhor valor de score apresenta complementariedade com o cromossomo em 
que o gene está localizado? 
3 – A diferença entre o comprimento do alinhamento do melhor valor de score e o segundo maior 
valor de score é superior a 3 (≥3)? 
 Observem que esta análise deve ser realizada de forma independente para cada um primes. 
Se os dois primers se encaixarem nestes parâmetros, eles podem ser utilizados para amplificação na 
PCR. Caso um deles, ou os dois não apresente uma das características, os mesmos devem ser 
modificados ou escolhidos outros primers para que se obtenha êxito no processo. Toda esta 
abordagem experimental que utiliza etapas de bioinformática é denominada de abordagem in silico. 
Esta etapa se configura como um importante passo durante a construção dos primers, uma vez que 
minimiza a possibilidade de erros durante a PCR.