Desenvolvimento de Anfíbios

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Desenvolvimento de Anfíbios
Sistema Modelo: Rã de dedos em garra (Xenopus laevis - Classe Amphibia)
Originária da África. O estudo da embriologia nessa espécie é a base para a compreensão de inúmeros processos sobre o desenvolvimento de vertebrados.
Motivos: Desenvolvimento fácil em água de torneira; tamanho – fácil dissecção; embriões resistentes e não susceptíveis a infecções. Muitos estudos clássicos em embriologia vieram de estudos em salamandras e tritões
Ovos: Correspondem a ovócitos secundários e variam de 1-2mm de diâmetro. São do tipo mesolécitos (possui bastante vitelo, mas não o suficiente para completar o desenvolvimento). Dessa forma, a reprodução ocorre em meio aquático e há formação de estágio larval. 
Polaridade do ovo: Apresentam uma nítida polaridade devido à pigmentação no polo animal enquanto o vitelo se acumula no polo vegetal não pigmentado. A pigmentação protege contra os raios UV e auxilia na captação de calor. A quantidade de plaquetas de vitelo aumenta em direção ao polo vegetal, mas para as organelas e componentes do citoesqueleto ocorre o inverso. 
O eixo antero-posterior está relacionada com a assimetria dos eixos animal e vegetal. Tal assimetria resulta da diferença de concentração de outros morfógenos, como a proteína VG-1. Essa proteína é responsável pela formação do endoderma e mesoderma dorsal. Os fatores são os RNAm depositados durante a diferenciação do ovócito. A região anterior será formada na região correspondente ao polo animal.
Responsáveis:
- RNAm para a proteína Vg-1 (molécula sinalizadora da família do fator de crescimento transformante-β-TGF-β). Sem a Vg-1 – sem endoderma e mesoderma dorsal.
- RNAm para a Proteína Xwnt – relacionada a formação do padrão corporal e descrita inicialmente em Drosophila.
Fertilização: Cada ovo é envolvido individualmente por uma camada gelatinosa, estando associados por uma massa gelatinosa comum, cuja forma e consistência é variável. 
Na fertilização, os espermatozoides entram pela região do polo animal do óvulo, ou seja, no polo pigmentado. O contato do espermatozoide com o ovo irá desencadear a REAÇÃO CORTICAL, ocorrendo liberação dos grânulos corticais. 
- Rotação de equilíbrio: A membrana vitelínica se descola da membrana plasmática e ocorre um influxo de água para o espaço entre elas. Dentro de 30 a 40 min o ovo gira dentro deste líquido sob a influência da gravidade de modo que o polo vegetal fica voltado para baixo.
- Rotação de simetria ou rotação cortical: Rotação do citoplasma cortical em direção ao ponto de entrada do espermatozoide – formação do crescente cinzento.
Ocorre ativação do metabolismo do ovo, induzindo o término da meiose II, com a formação do segundo corpúsculo polar. Além disso, ocorrem os bloqueios rápido (despolarização da membrana plasmática) e lento (exocitose dos grânulos corticais), impedindo a entrada de outros espermatozoides. Fusão dos pró-núcleos masculino e feminino. 
Rotação de simetria
No local de entrada do espermatozoide, serão direcionadas respostas intracelulares relacionadas com a movimentação do citoesqueleto do citoplasma cortical, causando uma movimentação do córtex celular em direção ao ponto de entrada. Como consequência, fatores morfogenéticos (RNAm para proteínas Dsh) são reposicionados para 180º do ponto de entrada do espermatozoide. 
Esse local de transição entre as regiões pigmentada e não pigmentada, perde parte de seu pigmento resultando na formação de uma área em forma de maia lua conhecida como crescente cinzento. Devido à existência de moléculas pré-existentes no ovo e ao reposicionamento da proteína Dsh, esse local funcionará como um centro de sinalização, conhecido como centro de Niewkoop. Esse centro irá induzir a formação da região organizadora da gastrulação, conhecida como Organizador de Speeman, com potencial para direcionar o desenvolvimento de estruturas dorsais (lábio dorsal do blastóporo). Dessa forma, o ponto de entrada do espermatozoide é responsável pela determinação do eixo dorso-ventral. 
A entrada do espermatozoide leva a: ativação do metabolismo do ovo – rearranjo do citoplasma; rotação do citoplasma cortical em torno de 30º em direção ao ponto de entrada do espermatozoide enquanto o restante do citoplasma permanece estacionário; formação do crescente cinzento. 
Clivagem: Classificada como holoblástica desigual radial. Padrão determinado por fatores maternos (quantidade e distribuição de vitelo, quantidade de elementos do
citoesqueleto) e fatores genéticos do zigoto.
Devido a maior quantidade de vitelo, a citocinese é dificultada no polo vegetal. Portanto, o número de divisões é maior no polo animal, resultando na formação de células menores (micrômeros) e mais numerosas nessa região e um número menor de células maiores (macrômeros) no polo vegetal. O germe é designado como mórula, na fase de 16-44 blastômeros, e ao fim da clivagem, de blástula. 
As moléculas de adesão mantêm as células unidas: caderina-E. Se elas não são expressas a blástula não se forma adequadamente.
Blástula: Possui blastoderme estratificada, contendo as duas populações de células em polos opostos e uma cavidade contendo líquido entre elas, a blastocele. A blastocele é excêntrica e pequena. Além de permitir a migração celular, ela previne que os macrômeros interajam prematuramente com os micrômeros, o que se relaciona à diferenciação do mesoderma. 
O tipo de ambiente determina o tipo de ovo, que determina o padrão de clivagem, que determina as características da blástula, as quais governam a gastrulação. 
Gastrulação: Transforma a blástula esférica em uma estrutura com:
- Eixos ântero-posterior e dorsoventral
- Simetria bilateral
- Os três folhetos germinativos
A gastrulação difere consideravelmente entre as classes de vertebrados, o que, pelo menos em parte, é devido às diferenças com relação à quantidade de vitelo do ovo e consequentemente as características da blástula. O estudo da gastrulação de anfíbios é ao mesmo tempo uma das mais velhas e das mais novas áreas da embriologia experimental.
A gastrulação resulta no rearranjo de células da blastoderme, que passam a se localizar em posições apropriadas em relação ao plano corporal geral do animal e aos tecidos que eles vão originar na larva. 
Início da Gastrulação: A gastrulação inicia-se pela formação de um pequeno dobramento ou fenda na região do centro de Niewkoop, chamado de lábio dorsal do blastóporo. Essa dobra forma-se devido à mudança da forma das células superficiais da blastoderme, cujo ápice contrai, resultando na sua transformação em células de garrafa. O embrião passa a ser chamado de gástrula. 
Assim, ocorre inicialmente a invaginação de células nesse local. Em seguida, as células que invaginaram, formam uma frente de migração e causam a involução de futuras células da mesoderme, que são progressivamente internalizadas, posicionando-se abaixo das células da futura ectoderme. As células prospectivas da ectoderme realizam movimentos de epibolia para revestir totalmente a gástrula e recobrir os macrômeros, que são assim internalizados. 
Esse movimento é progressivo, e acompanhado da convergência das células superficiais, primeiro em direção ao lábio dorsal do blastóporo, em seguida às regiões laterais, levando a formação dos lábios laterais do blastóporo e, por fim, quando as células da região ventral convergem, forma-se o lábio ventral do blastóporo. 
Dessa maneira, o blastóporo é uma dobra circular, que representam um sítio de convergência e involução das células. Nessa fase, os macrômeros são observados através do blastóporo, o que é chamado de rolha de vitelo. 
A invaginação que inicia a formação do blastóporo dá origem a uma nova cavidade, o arquêntero, e à medida que as células se reorganizam, o arquêntero aumenta e a blastocele é deslocada e diminui, até desaparecer. O arquêntero ou intestino primitivo não é revestido completamente pelas células da endoderme e quando isso acontece forma-se o intestino verdadeiro.Após a involução, das células prospectivas da mesoderme se estendem, sob a ectoderme, ao longo do eixo antero-posterior devido à extensão convergente. 
Blástula
Intercalação dos micrômeros
Mesoderme involuindo
Involução
1. No centro organizador surgem células com formato semelhante a células em garrafa. Assumem esse formato devido a alterações no citoesqueleto de actina com contração do citoplasma apical.
 2. Isso induz uma leve invaginação e surgimento do lábio dorsal do blastóporo.
3. As células da mesoderme e endoderme começam a rolar em volta do blástoporo em direção ao interior da blástula – involução.
7
8
6
5
4
3
1
2
Gástrula intermediária
Blástula
Gástrula
Mesoderma
Lábio dorsal 
do blastóporo
Surgimento do
 blastóporo
Determinação do eixo dorso-ventral: A primeira clivagem passa através do ponto de entrada do espermatozoide, dividindo o as metades direita e esquerda, uma contendo o ponto de entrada do espermatozoide e outra o ponto oposto – centro de Niewkoop. Verificou-se que a primeira metade não se desenvolvia adequadamente, formando um embrião amorfo. A outra formava um embrião típico com as estruturas dorsais. No centro de Niewkoop, há moléculas que irão induzir a gastrulação e diferenciação das estruturas dorsais (Proteínas: VG-1, Dsh e catenina).
Formação do centro de Nieuewkoop
A catenina é uma proteína multifuncional, envolvida na via de transdução de sinal da via Wnt: 
- Atua como âncora para as proteínas de adesão célula-célula, as caderinas e do citoesqueleto
- Também se localiza no núcleo onde age em associação com outras proteínas, como fator de transcrição.
O centro sinalizador é uma região do embrião que exerce influência especial nos tecidos adjacentes, determinando como eles vão se diferenciar. Ele irá influenciar a formação do Organizador de Spemann.
O centro sinalizador de Niewkoop induz a formação, logo acima, de outro centro sinalizador com capacidade de induzir a diferenciação de estruturas dorsais – é o organizador de Speeman. Tal região é visualizada como o lábio dorsal do blástóporo, na gástrula inicial. Organizador é capaz de induzir as células a mudar o seu destino para formar o tubo neural e o mesoderma dorsal. 
Experimento de transplante do organizador de Spemann: O transplante da região contendo o lábio dorsal do blastóporo para outro embrião em fase de desenvolvimento semelhante era capaz de induzir a formação de um eixo corporal secundário ectópico, resultando em embriões germinados. 
Organizador de Spemann – região capaz de induzir a formação do lado dorsal com as suas estruturas típicas (notocorda, tubo neural e somitos). Situado acima do centro de Niewkoop.
Houve a descoberta do fenômeno de indução: Capacidade de um tecido de dirigir o desenvolvimento de outro. 
Neurulação (Gastrulação tardia)
É a fase final da gastrulação e envolve a origem do sistema nervoso central e diferenciação da mesoderme. O desenvolvimento do sistema nervoso central ocorre pela formação de uma estrutura tubular, o tubo neural a partir da ectoderme. 
A neurulação depende do papel indutor das células da notocorda sobre a ectoderme adjacente (indução secundária). A proteína neggin secretada pelas células notocordais é a principal implicada nesse processo. Ela inibe a ação do BMP, um fator de crescimento, que por sua vez, inibe a diferenciação em tecido neural. Portanto, a inativação do BMP leva à diferenciação em tecido neural. 
Sob estímulo da notocorda, as células da ectoderme se diferenciam em placa neural. As bordas dessa placa formam elevações, as pregas neurais, que são observadas na superfície do germe. Quando as pregas neurais começam a ser observadas, o embrião é chamado de nêurula. 
As pregas neurais se aproximam, enquanto a placa se invagina, formando um sulco neural. Em sequencia, ocorre fusão das pregas, originando internamente o tubo neural e uma camada contínua de ectoderme na superfície. Posteriormente, o tubo neural irá se desenvolver no cérebro e medula espinhal e a sua cavidade ou neurocele irá formar os ventrículos cerebrais e o canal do epêndima. 
- A notocorda começa a formar-se na linha média
- Induz a formação da placa neural
- Desenvolvem-se duas dobras neurais paralelas - as pregas neurais
- À medida que as pregas se aproximam forma-se uma depressão - o sulco neural
- As pregas neurais se fundem na linha média para formar o tubo neural, que então se separa da ectoderme
- Alongamento do embrião no eixo antero-posterior
Neuróporo
Formação do mesoderma: À medida que a neurulação ocorre, as células da futura mesoderme e endoderme se movem extensão em direção opostas, as primeiras em direção à região ventral e as segundas em direção à região dorsal, formando camadas contínuas e originando o padrão tridérmico dos organismos triblásticos. 
O mesoderma irá se subdividir em mesoderma paraxial, situado em ambos os lados do eixo axial (tubo neural e notocorda), mesoderma intermediário e mesoderma lateral. O mesoderma paraxial se fragmenta em somitos, o intermediário é contínuo e irá originar a região dos rins e das gônadas. O mesoderma lateral se delamina em folheto parietal e visceral, os quais se associam respectivamente com a ectoderme e endoderme para formar a somatopleura e esplancopleura. 
Estádio Filotípico: O plano básico de organização corporal dos vertebrados é muito similar: além dos eixos antero-posterior e ventro-dorsal, todos possuem região cefálica distinta, tubo neural se estendendo ao longo da linha média dorsal, abaixo do qual se estende a notocorda, flanqueada de cada lado pelas subdivisões do mesoderma (somitos). Assim, durante o desenvolvimento embrionário eles passam por um estágio comum conhecido como estágio filotípico, onde as características acima mencionadas são observadas. As características particulares de cada grupo, como bicos, asas, nadadeiras aparecem mais tarde.
“ A Ontogenia recapitula a filogenia”
Brotamento da Cauda: O tubo neural irá crescer em sentido caudal e o mesoderma se formará na região pós-anal. Quando a musculatura caudal se forma, o germe eclode da membrana vitelínica, cerca de um dia após a fertilização. 
Metamorfose: A região da membrana bicofaríngea e da membrana cloacal se rompem originando o opérculo bucal e o ânus. A fase de organogênese vai até aproximadamente o 4º dia de vida, quando ocorre o desenvolvimento das brânquias, estruturas cefálicas, tubo digestório, etc. 
Ao final desse período, têm-se o estágio larval ou girino. Esse passa por um período pré-metamorfose, onde se desenvolvem o cérebro e o brotamento dos membros. Outro período, de pró-metamorfose, onde são formados os membros posteriores e então os anteriores. Então, a cauda é reabsorvida, as brânquias degeneram e os órgãos internos são remodelados, resultando em um indivíduo jovem.