Introdução à biologia molecular

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Introdução à biologia celular
	Biologia Molecular (genética molecular) é uma disciplina híbrida, pois suas ferramentas são usadas em diversas áreas (Botânica, Zoologia, Parasitologia, Neurofisiologia, Imunologia, Genética, Biologia Forense, etc.). O termo que abrange: 
- estudo da codificação e fluxo da informação genética através do DNA, RNA e proteínas 
- estudo das interações entre as moléculas em nível intra e inter-celular. 
- técnicas para a manipulação do material genético em laboratório;
O que é um genoma? 
Constituição genética total de uma espécie 
Informação genética total presente nas células de um indivíduo 
3 pg de DNA (10-12g) por genoma haplóide (n) 
Genoma de mamíferos: ~3x109 pares de bases 
~25.000 genes.
Ou seja, é todo o DNA contido numa célula (DNA nuclear, mitocondrial, do cloroplasto).
O genoma de eucariotos está organizado em cromossomos, o número (exceto gametas), tamanho e forma são constantes para a espécie. Em mamíferos há reorganização do material genético (fusão ou quebra).
Cromossomos
Cromossomos são moléculas gigantes de DNA, condensadas por proteínas histônicas e não-histônicas.
Na metáfase (máxima condensação) apresentam centrômero (constrição primária);
Alguns cromossomos apresentam constrição secundária;
Telômeros nas extremidades;
Braços: p (curto) e q (longo);
Cromátides irmãs: 2 filamentos unidos pelo centrômero (observados na metáfase);
Classificação quanto à posição do centrômero:
Metacêntrico;
Submetacêntrico;
Acrocêntrico;
Telocêntrico.
Par de cromossomos homólogos: 1 de origem materna e outro paterno;
Locus: localização de um gene no cromossomo;
Um par de alelos nos cromossomos homólogos: formas alternativas de um gene em um locus → homo ou heterozigoto;
Três pares de genes: três diferentes loci nos cromossomos homólogos.
Erros comuns: “presença do gene” // “frequência do gene” → correto: presença/frequência do ALELO.
História do DNA
	1865 → Mendel: Princípios fundamentais da herança: dentro da célula tem pares de fatores e cada par é responsável por uma característica específica.
	
1910:
Genes localizados nos cromossomos; 
Introduziram o conceito de herança ligada ao sexo; 
Introduziram e elaboraram o conceito de ligação genética; 
Origem de mapeamento de genes; 
Construíram o 1º mapa gênico de um cromossomo; 
Demonstraram recombinação entre cromossomos homólogos.
1920’s:
Hereditariedade;
Composição da molécula de DNA: nucleotídeo (base nitrogenada, grupo fosfato e açúcar desoxirribose.
1928: Estudos de vacinas apontaram o DNA como material genético (transformação bacteriana):
linhagens virulentas X linhagens não virulentas
 (LISAS - S) 	 (RUGOSAS - R)
 com cápsulas 	 sem cápsulas
virulência
	Experimento: 
	Bactérias mortas podem transformar geneticamente bactérias vivas?
Conclusão: Um componente químico de uma célula é capaz de transformar geneticamente outra célula (princípio transformante).
1944: Natureza do fator transformante → DNA.
Princípio transformante:
1949: 
Regras sobre a quantidade das bases nitrogenadas na molécula de DNA;
A composição do DNA é diferente em diferentes organismos.
	1952: Experimento de Hershey-Chase com Fago T2 (vírus de bactéria) + isótopos enxofre e fósforo:
Bacteriófago T2 (E. coli): 50% DNA P / 50% proteínas S
Surgiu a pergunta: qual a estrutura do DNA? 
A função do DNA depende de sua estrutura, sua composição já era conhecida.
1953: DIFRAÇÃO DE RAIOS X:
Feixes de raios X em cristais de moléculas purificadas;
Raios defletados pelos átomos das moléculas em padrões específicos (padrões de difração);
Padrões registrados em filmes sensíveis a raios X e fornecem informações sobre organização dos componentes das moléculas;
DNA → estrutura bifilamentar altamente ordenada com subestruturas repetidas espaçadas em 0,34nm (1nm = 10-9) ao longo do eixo da molécula;
DNA é longo e fino; 
2 partes similares paralelas no comprimento da molécula; 
Forma de espiral (hélice);
Estrutura da molécula de DNA: componentes dos ácidos nucleicos →base nitrogenada + açúcar (pentose) + grupo fosfato.
DNA:
Estrutura do DNA:
Bases nitrogenadas: 
Pirimidinas: Timina e Citosina
Purinas: Adenina e Guanina
Açúcar desoxirribose: 
Grupo fosfato:
→ Base nitrogenada + Pentose: nucleosídeo;
→ Base nitrogenada + Pentose + Fosfato: nucleotídeo;
Molécula de DNA:
Propriedades da molécula de DNA:
As partes da molécula não são similares e paralelas, mas sim complementares e antiparalelas, apresentando polaridade: 5’ (fosfato) – 3’ (hidroxila). As bases apresentam pareamento específico: A = T; C ≡ G. A estabilidade da molécula se deve as ligações de hidrogênio existentes entre as bases nitrogenadas, assim, as regiões que apresentam mais C-G (3 ligações de H) são mais fortes que as regiões que apresentam A-T (2 ligações de H).
A ligação entre a base nitrogenada e a pentose é uma ligação covalente, a ligação entre o fosfato e a pentose é uma ligação fosfodiéster.
	Por seus filamentos serem antiparalelas, a polaridades destes também são opostas:
	O DNA forma uma estrutura em dupla-hélice dextrogira (cadeias em espiral), cada cadeia é polinucleotídica (sequência de nucleotídeos ligados por ligações fosfodiéster), os pares base estão empilhados distando ~0,34nm com 10pb por volta de 360º, os lados planares não polares são hidrofóbicos.
→ Grupo fosfato + açúcar (parte hidrofílica): externamente na molécula; 
→ Bases nitrogenadas (parte hidrofóbica): internamente na molécula.
O DNA ocupa uma posição central como repositório das informações genéticas. As sequências de nucleotídeos codificam todos RNAs e proteínas celulares, por isso deve ser preservado com o mínimo de alterações, sendo transmitido intacto entre as gerações, entretanto, se o DNA for replicado identicamente não gera variabilidade, mas se for replicado com muitos erros pode causar mutações. A taxa de mutação é constante entre os organismos da mesma espécie, mas é diferente entre espécies.
Conformação do DNA:
DNA-A: é a forma menos hidratada, apresenta-se em dupla-hélice torcida para a direita (dextrógiro), possui a dupla hélice mais curta e com maior diâmetro; 11bp por torção; altura entre bp: 0,23nm. 
DNA-B: é a forma mais hidratada, com dupla-hélice torcida para a direita (dextrógiro); apresenta dupla hélice mais longa e com menor diâmetro; 10,5 bp por torção; altura entre bp: 0,34nm. É encontrado na célula.
DNA-Z: é a forma encontrada em cristais de DNA sintéticos contendo alternância de G e C na mesma fita, sua dupla hélice é torcida para a esquerda e é mais alongada e estreita que o B-DNA; 12 bp por torção; altura entre bp: 0,38nm; aparência da fita: zig-zag.
Forças que atuam no DNA:
Várias forças atuam em conjunto estabilizando a dupla hélice que deve ser forte e ao mesmo tempo flexível:
- ligações covalentes: unem átomos em moléculas;
- efeitos hidrofóbicos: estabilizam o pareamento – anéis aromáticos das bases nitrogenadas são forçados para o interior da dupla hélice por coesão interna de moléculas de água e os sítios hidrofílicos ficam expostos na cavidade;
- força de Van der Walls: entre os anéis aromáticos de bases adjacentes no empilhamento das bases no interior da dupla hélice.
- interação com cátions: cadeias de açúcar-fosfato (-) interagem com cátions (Mg+2) em solução, neutralizando a repulsão entre as duas cadeias e estabilizando a dupla hélice;
- pontes de hidrogênio: pareamento das bases entre as duas fitas da molécula de DNA.
Dogma central da biologia: o processo de tradução da informação
O fluxo de informação DNA-RNA não se dá apenas em um sentido. Nem todo DNA é traduzido (existência de éxons e íntrons), existem sequências repetitivas e elementos transponíveis;
Manutenção da sequência do DNA:
Para a sobrevivência imediata do organismo é necessário estabilidade gênica, já para a sobrevivência da espécie a longo prazo é necessário que exista variabilidade (DNA sofre alterações= mutação), assim a replicação do DNA apresenta alta fidelidade, mas não é perfeita.
Complicadores do processo:
- Tamanho da molécula;
- Compactação e ligação a outras proteínas;
- Velocidade;
- Simultaneidade;
- Momento certo dentro do ciclo celular;
- Fidelidade.
Replicação:
Mecanismos de replicação:
Cada uma das fitas originais (velhas) atuam como molde para a formação da fita nova. As fitas novas não são cópias das velhas (moldes), mas sim complementares e não idênticas. Ou seja, é um processo semiconservativo.
Modelos propostos para a replicação do DNA:
- Experimento de Meselson e Stahl:
1. Cultivaram E. coli em meio contendo N15 (isótopo pesado) ao invés de N14 (forma leve normal); 
2. Após muitas divisões celulares: DNA das bactérias com N15 ;
3. Bactérias removidas e colocadas em um meio com N14. Em F1 obteve-se DNA de densidade intermediária;
4. F2: DNA de baixa e intermediária densidade.
Se o modelo fosse: 
- Conservativo: nenhuma molécula híbrida (50% pesado / 50% leve);
- Dispersivo: mudança de leve para pesado em cada geração.
- Modelo semiconservativo: cada dupla hélice filha contém 1 filamento original + 1 recém-sintetizado, mantendo o padrão de herança ao longo das gerações.
	Em procariotos:
- A replicação é contínua em meio favorável;
- Apresentam apenas uma origem de replicação (ORI);
- Replicação em E. coli inicia-se num sítio específico do cromossomo, denominado origem de replicação, onde se forma a bolha de replicação que se expande bidirecionalmente via garfos de replicação (Y) até encontrar o ponto de término - origem de replicação em E. coli (ori-C): 245pb e apresenta sequências repetidas: sequência 13 bp repetida em tandem (5x) ricas em A:T – facilita formação da bolha.
 
	Em eucariotos a replicação dos cromossomos ocorre ao mesmo tempo e se dá através da formação da forquilha de replicação (ponto no qual 2 filamentos de DNA se separam para permitir a replicação), essa região é rica em A e T (menor quantidade de ligações de H – mais fácil de separar as fitas do DNA). Há vários pontos de origem de replicação (ORI).
A replicação deve ser simultânea nas duas fitas. A região da replicação se move pela dupla hélice em forma de Y (região ativa de replicação) = forquilha de replicação.
A fita sintetizada no sentido 5’→3’ ocorre em direção ao movimento do garfo de replicação. Nenhuma polimerase é capaz de sintetizar na direção 3’→ 5’. A fita complementar é sintetizada também no sentido 5’→3’, porém em direção oposta à do movimento do garfo de replicação, implicando na replicação descontínua com pequenos fragmentos. Ou seja, a forquilha de replicação é assimétrica. Os fragmentos sintetizados são conectados pela DNAligase.
	A replicação do DNA ocorre com a participação do replissomo (enzimas que atuam na forquilha), entre elas as Helicases, Topoisomerases, Proteínas SSB, Primase (Primossomo), DNA polimerase, Cinta deslizante (grampo β), Ligase, Nucleases.
Helicase: reconhece a ORI C e duas enzimas se ligam ao DNA, uma em cada fita, quebrando as pontes de hidrogênio entre as fitas de DNA dupla hélice e deselicoidizam o DNA, formando a bolha. Necessitam da presença de ATP (energia).
Topoisomerases: 
- Desfazem as torções do DNA (superelicoidização), resultantes do desenrolamento das fitas pelas helicases, para abrir os garfos de replicação (forquilhas): DNA girasse;
- Atuam separando moléculas de DNA-filhas em cromossomos circulares (procariotos): Topoisomerase II.
Proteínas ligadoras de fita simples (SSB): ligam-se fortemente à fita simples de DNA; auxiliam as helicases estabilizando a conformação distorcida da fita e retardando a formação do duplex (que podem impedir a síntese de DNA).
Primase: a enzima DNA polimerase não tem capacidade de iniciar a síntese na ausência de um iniciador, a primase faz o primer de RNA (primossomo) para que a DNApolimerase sintetize a fita complementar. Ela é a enzima central do primossomo. Na fita líder há um iniciador na origem de replicação, na fita descontínua há um iniciador para cada fragmento de Okasaki.
DNApolimerase (DNAp): catalisa a reação de replicação (adição sequencial de desoxirribonucleotídeo à extremidade 3’-OH); promovem o crescimento da cadeia na direção 5’→3’; ativada na presença de Mg2+ e DNA pré-existente (primer e molde).
O primer: fornece terminal 3’OH livre para adição de nucleotídeos durante a síntese (ponte fosfodiéster entre 3’-OH do primer e 5’-fosfato do nucleotídeo livre), o molde dita a sequência de bases a ser sintetizada. Além de adicionar nucleotídeos, a DNAp também reconhece erros de pareamento e os elimina através de reação exonucleásica.
		Tipos de DNAp em procariotos:
- DNAp I: possui 3 atividades:
	→ Polimerase 5’→3’: catalisa o crescimento da cadeia;
	→ Exonuclease 3’→5’: remove bases pareadas erradas;
	→ Exonuclease 5’→3’: degrada DNA ou RNA fita simples e remove os primers de RNA;
Embora participe da replicação do DNA, a DNAp não é responsável pela maior parte da síntese, pois é muito lenta (~20nt/s), ela se dissocia do DNA após a incorporação de ~20 a 50 nt.
- DNAp II: enzima de reparo (repara o DNA danificado);
- DNAp III: atua na replicação com a Pol I.; atividade polimerase 5’→3’ (síntese de DNA) e exonuclease 3’→5’ (remove bases erradas); velocidade de síntese: ~1.000 nt/s.
Cinta deslizante (grampo β): DNA polimerase tende a se dissociar da fita de DNA, o grampo β circunda o DNA como um donut e impede que a DNA polimerase III se dissocie, transforma a DNA polimerase III de enzima distributiva (capaz de adicionar ~10 nucleotídeos) em uma enzima processiva (adiciona milhares de nucleotídeos).
DNA ligase: catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3’-OH e o 5’-P de nucleotídeos adjacentes. 
Nucleases: “editam”/procuram por bases erradas:
- EXONUCLEASES: clivam o DNA a partir do final da molécula;
- ENDONUCLEASES: clivam em qualquer local da molécula.
Mecanismos de reparação: 
Alguns erros escapam da atividade de exonuclease da DNA polimerase I e III; o sistema de reparo detecta potenciais distorções da hélice que resultam da interação incorreta de bases não complementares; detecta qual a fita que tem que ser corrigida (caso contrário 50% de erro ao corrigir a fita molde)
Como sabe qual é a fita antiga (molde)?
Em bactérias: sequências metiladas.
Em humanos: conjunto de proteínas de verificação identificam a fita nova e eliminam erros.
Estágios da replicação: 
INICIAÇÃO: origens de replicação e montagem do spliceossomo;
ELONGAMENTO: síntese das fitas líder e tardia envolvendo diversas proteínas;
TERMINAÇÃO:
- Procariotos: as duas forquilhas de replicação se encontram (DNA circular) – topoisomerase II
- Eucariotos: sequências de nucleotídeos específicas no final dos cromossomos, incorporadas a telômeros – telomerase (estende a fita moldede forma que o material genético não seja perdido).
Particularidades de eucariotos:
 - Diferenças fundamentais: estrutura nucleoproteica complexa; molécula de DNA maior (150 x 106 vs 4,7 x 106); cromossomos lineares.
- Soluções: maquinário enzimático mais complexo; múltiplas origens de replicação; telômeros.
- Sequências Teloméricas: 
→ sequências conservadas compostas de repetições ricas em TG 
Ex. humanos: sequência de RNA 3’-AAUCCC-5’ atua como molde para a repetição no DNA de 5’-TTAGGG- 3’.
→ telomerase (atividade polimerase): ribonucleoproteína (RNA + proteína); sintetiza 5’3’; replicação independente: utiliza seu próprio RNA como molde (transcriptase reversa) → não há perda das extremidades cromossômicas.
Transcrição e processamento de RNA
Transcrição:
A transcrição varia conforme as necessidades da célula, espelhando seu estado fisiológico. Ela deve ser iniciada e terminada em pontos específicos, promotores e terminadores, respectivamente. A célula deve controlar quais os genes que devem ser transcritos, quando e quanto RNA deve ser sintetizado.
Pelo processo de transcrição são sintetizados todos os tipos de RNA da célula.
DefiniçãoMolecular do Gene
Gene é uma “sequência completa de ácidos nucleicos necessária para a síntese de um produto gênico funcional”.
Produto genético funcional: proteína e RNA.
Composição de um gene:
Região reguladora: controle da transcrição
Promotor: sítio no DNA onde se liga a RNA polimerase;
Terminador: sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase da fita de DNA molde ao final do processo de transcrição;
Região codificadora: éxons (codifica a sequência de aa da proteína ou a sequência do RNA estável).
Características da Transcrição
A síntese de RNA ocorre de modo semelhante a de DNA, exceto por serem precursores são ribonucleosídeos trifosfatos (rNTP) e não desoxirribonucleosídeos trifosfatos (dNTP), apenas 1 filamento do DNA é utilizado como molde para síntese de um RNA e que a síntese pode ser iniciada sem a necessidade de um filamento (primer) pré-existente.
A síntese da cadeia de RNA também ocorre no sentido 5’→ 3’, com adição de nucleotídeos ao grupo 3’-OH da ponta da cadeia, porém as duas fitas servem de molde e a enzima utilizada é a RNA polimerase. 
	Replicação
	X
	Transcrição
	O cromossomo inteiro é replicado
	
	Apenas segmentos específicos do DNA são utilizados como molde (genes)
	A transcrição ocorre de forma que haja economia de tempo e energia, ou seja, apenas os genes necessários naquele determinado momento da vida do organismo são transcritos.
Há um processo seletivo, as enzimas e proteínas reguladoras devem ser capazes de distinguir sinais nas sequências de interesse, onde começar e terminar a transcrição.
Classes de RNA 
RNA informacionais: intermediários no processo de decodificar os genes em cadeias polipeptídicas (mRNA)
PROCARIOTOS – transcrito primário = mRNA
EUCARIOTOS – transcrito primário (pré-mRNA) → processado = mRNA
O mRNA é convertido em aminoácido na tradução.
RNA funcionais: nunca são traduzidos e apresentam papéis diversos (estruturais e funcionais).
tRNA, rRNA, snRNA, miRNA, lncRNA
Estrutura das moléculas de RNA
Há 4 tipos de RNA que participam do processo da transferência da informação (DNA → proteína):
1. RNA mensageiro
2. RNA transportador
3. RNA ribossômico
4. Pequenos RNAs nucleares
Todos apresentam papéis essenciais na expressão gênica.
1. RNA mensageiro (mRNA):
sintetizado a partir da molécula molde (3’--5’) de DNA
função: molde na síntese das proteínas, ele determina a sequência de aminoácidos no polipeptídio
mRNA: mesma sequência que a fita de DNA não molde (exceto U → T)
Procariotos:
Transcrito primário: mRNA exatamente complementar à molécula de DNA utilizada como molde.
Eucariotos:
Transcrito primário: pré-mRNA → processamento: mRNA
2. RNA transportador (tRNA)
Funcionam como adaptadores durante a tradução
Função: transportar os aminoácidos até o local de síntese das proteínas
70-90 nt de comprimento e se dobram em estruturas em forma de trevo (pareamentos de bases);
aminoácidos específico ligado (3’-OH)
trinca de nucleotídeos (anticodon)
1 a 4 tRNA para cada um dos 20 aminoácidos do código genético
3. RNA ribossômico (rRNA)
Componentes estruturais dos ribossomos: tradução de nucleotídeos (mRNA) em aminoácidos
Procariotos:
Interagem com mais de 50 proteínas ribossômicas para produzir a complexa estrutura do ribossomo;
3 rRNA: 5S, 16S e 23S (denominadas pela velocidade de sedimentação durante centrifugação).
Eucariotos:
Interagem com mais de 80 proteínas ribossômicas;
4 rRNA: 5S, 5.8 S, 18S e 28S.
Pequenos RNAs nucleares (snRNA)
Componentes estruturais dos spliceossomos (excisam íntrons em eucariotos);
Tamanho: de 100 a 251 nucleotídeos;
Nunca deixam o núcleo;
Interagem com ~40 proteínas nucleares para formar os spliceossomos;
Micro-RNA (miRNA):
Pequenos RNAs fita-simples (~22 nt) formados a partir de transcritos em forma de grampo (hairpin = pre-miRNA ~70 nt);
Função: regulam negativamente os genes codificantes de proteína pela repressão da tradução ou degradação do mRNA;
Podem ter expressão constitutiva ou com controle de expressão temporal - e/ou tecido-específica;
~30% dos genes codificante são regulados por miRNA
Localização no genoma: regiões gênicas (éxons ou íntrons) eintergênicas;
Atuação dos micro-RNAs:
Ligam-se a região 3’-UTR do mRNA (geralmente imperfeita)
Degradação ou Inibição: quanto melhor o pareamento, maior a probabilidade de degradação do mRNA
miRNA são altamente conservados em grupos filogenéticos afastados
Pequenos RNA de interferência (siRNA)
Pequenos RNAs fita-simples (21 a 25 nt) que ajudam a proteger a integridade do genoma de plantas e animais;
inibem a produção de vírus (degradam RNA viral)
em plantas restringem os elementos de transposição
RNA de interação piwi (piRNA)
pequenos RNAs fita-simples (24 a 31 nt) que ajudam a proteger a integridade do genoma de plantas e animais
em animais impedem a dispersão de elementos de transposição para outros loci cromossômicos
RNA não codificantes longos (lcnRNA ou ncRNA)
pequenos RNAs fita-simples
transcritos na maioria das regiões do genoma de eucariotos
alguns lcnRNA participam de fenômenos genéticos clássicos (ex. compensação de dose)
até o momento não se sabe qual a função da maioria dos lcnRNA
Ex.: Gato Tortoiseshell
Flexibilidade da molécula de RNA
RNA é muito mais flexível que o DNA: fita simples → emparelhamento de bases gera estruturas bastante complexas;
Não é tão estável quanto a molécula de DNA (por ser fita simples);
Podem apresentar sítios ativos que catalisam reações químicas;
Flexibilidade do RNA permite executar atividades fundamentais na célula:
interpretar o código de nucleotídeos e codificá-lo em aminoácidos;
intermediar o fluxo de informações da célula (DNA  proteínas)
RNA polimerase
produz todos os tipos de RNA;
reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA (genes);
desnaturam a dupla hélice de DNA expondo a sequência de nucleotídeos a ser transcrita;
mantêm as fitas de DNA separadas na região de síntese;
renaturam o DNA na região imediatamente posterior à síntese;
sozinhas, ou com o auxílio de proteínas específicas terminam a síntese do RNA;
mecanismo de revisão;
sintetizam somente no sentido 5’→ 3’(DNA molde no sentido 3’ → 5’);
identificam sinais específicos no DNA, os quais direcionarão a transcrição de genes específicos no momento adequado
a região do gene que contém as sequências de reconhecimento: promotor (onde a RNA polimerase se liga para dar início à transcrição;
há vários sinais nas regiões promotoras de genes: locais importantes no controle da expressão gênica
Processo de transcrição:
É diferente entre procariotos e eucariotos;
Pode ser dividido em 3 fases:
1. Iniciação
2. Elongação (Alongamento) da cadeia
3. Terminação
Transcrição em Procariotos
Elementos da transcrição em procariotos:
 RNA polimerase – E. coli:
transcreve todos tipos de RNA
formada por uma parte central (2α, β, β’, ω) + subunidade (σ - sigma):
Subunidades α: montagem da enzima e interações com proteínas reguladoras;
Subunidade β: sítio de ligação ao ribonucleotídeo trifosfato → centro catalítico do processo
Subunidade β’: ligação ao DNA molde
Subunidade σ (sigma):
envolvida apenas no início da transcrição (posicionamento e montagem da enzima) e na regulação da expressão gênica;
não tem papel no alongamento da cadeia;
após o início da cadeia de RNA, σ é liberado;
FUNÇÃO: reconhecer e ligar a RNA polimerase ao ponto de início da transcrição (sítios promotores específicos: -10 e -35)
RNA polimerase possui mecanismos de correção (taxa de erro: 1 erro a cada 10.000.000)
Os distintos fatores sigma reconhecem promotores diferentes.
Promotores de genes – E. coli:
regiões altamente conservadas: sinalizam o início da transcrição:
Sequência -10 (TATAAT) - TATA box
Sequência -35 (TTGACA)
a. Iniciação:
1. Ligação da RNA polimerase à região promotora (iniciadora), que fica antes do sítio de iniciação; 
2. Desligamento da subunidade σ da RNA polimerase;
3. Desenrolamentodo DNA pela RNA polimerase (região -10) formando a bolha de transcrição
filamento livre para o pareamento de bases com nucleotídeos;
4. Formação das ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos na cadeia de RNA.
b. Elongação:
O alongamento do RNA é catalisado pelo cerne da enzima RNApolimerase, após a liberação do fator sigma. A extensão da cadeia ocorre dentro da bolha de transcrição (segmento de DNA desenrolado (18 pb em E. coli)).
A RNAp desenrola DNA dupla fita frente ao sítio e reenrola DNA atrás do sítio.
Durante a elongação, a RNA polimerase:
rompe a dupla hélice
mantém a dupla hélice aberta, estabilizando a dupla hélice formando DNA/RNA sintetizado
reconhece se o nucleotídeo a ser incorporado é o correto
catalisa a incorporação dos nucleotídeo à cadeia de RNA
inicia a liberação da cadeia de RNA sintetizada
refaz o pareamento da dupla hélice do DNA
c. Terminação
RNA polimerase encontra o sinal de término: o complexo de transcrição se dissocia, liberando a molécula de RNA recém sintetizada
Existem 2 tipos de terminadores:
1.Dependentes da proteína rho (ρ)
2.Independentes da proteína rho (ρ) (90% dos genes de E. coli)
Término Indireto - dependente da proteína rho (ρ)
Rho (46kDa) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase;
Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação (rica em C), Rho alcança a enzima;
Rho desenrola o híbrido RNA-DNA. 
Término Direto - independente da proteína rho (ρ)
região rica em G/C seguida de ~6bp A/T;
estrutura em forma de grampo → retardam movimento da RNApoli;
terminal UUUU → sinal para liberação da RNApoli.
Em PROCARIOTOS, a tradução e degradação da molécula de mRNA em geral começa antes da síntese completa do mRNA (meia vida do mRNA: ~5 minutos)
Os processos de iniciação, elongação e terminação são simultâneos.
Em organismos procariotos o RNAm é policistrômico.
Transcrição em eucariotos:
Semelhante, porém mais complexa do que em procariotos;
RNAs produzidos no núcleo devem ser transportados para o citoplasma
Diversas etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos
TRANSCRIÇÃO
SPLICING
TRADUÇÃO TRANSPORTE
meia vida do mRNA: ~5 horas
 Elementos de transcrição em eucariotos:
RNA polimerases:
RNA pol I: síntese de todos rRNA (exceto 5S)
RNA pol II: transcreve genes que codificam as proteínas (mRNA) e alguns snRNA
RNA pol III: síntese dos tRNA, rRNA 5S e alguns snRNAs
RNApol de mitocôndrias e cloroplastos: transcrevem genes dessas organelas, sendo menos complexas, mais parecidas com as RNApolimerases bacterianas.
São mais complexas que em procariotos: muitas subunidades e necessitam da ajuda de proteínas (fatores de transcrição) para iniciar a síntese.
Promotores
São sequências reguladoras conservadas, situadas antes do ponto inicial da transcrição, que servem de sítio de ligação do complexo de transcrição
- Promotores (upstream): sequências 100-200bp, próximos ao sítio de transcrição apresentando sequências consenso
Ex.: TATA(T/A)A(A/T) -TATA box.
Fatores de transcrição:
São proteínas que reconhecem promotores, interagem com outros fatores de transcrição, formando um complexo onde a RNApolimerase se associa (≠ procariotos)
TFIID: contém proteína de ligação ao TATA box (TBP) + pequenas proteínas; é o 1º fator a interagir com o promotor
TFIIF: liga-se a RNApoli II (complexo início transcrição)
TFIIE: liga-se ao DNA em seguida ao ponto de início da transcrição
a. Iniciação:
RNAs polimerases de eucariotos não iniciam a transcrição (diferente de procariotos). Os fatores de transcrição se ligam a região promotora no DNA formando um complexo de iniciação para que a RNA polimerase se ligue e inicie a transcrição
Diferentes promotores e diferentes fatores de transcrição são usados pelas deiferentes
RNA polimerases.
b. Elongação:
RNA polimerase se acopla no ponto de início, começa a polimerização da nova cadeia de RNA (~ procariotos);
Ligações fosfodiéster ligam os nucleotídeos recém-sintetizados.
c. Terminação:
Localização da sequência consenso AAUAAA, transcrição continua 11 a 30 nucleotídeos depois ocorre a clivagem
Após a clivagem ocorrem as etapas de processamento do pré-mRNA: os Pré-mRNA produzido nos eucariotos devem ser processados antes de saírem do núcleo → pré-mRNA (transcritos primários, precursores de mRNA) ou RNAhn (RNA heterogêneo nuclear).
Processamento do pré-mRNA:
Guanina modificada adicionada a extremidade 5’, formando uma ligação 5’-5’, formando um revestimento protetor;
adição da cauda poli A (POLIADENILAÇÃO), quanto maior, mais estável e protegida estará a extremidade 3’;
retirada de sequências não codificantes (íntrons) mRNA maduro.
1. Adição de revestimento na extremidade 5’:
No início do alongamento, 5’ dos pré-mRNA são modificadas pela adição de revestimento 7-metil guanosina (7-MG):
A fosfo-hidrolase retira um grupamento fosfato do 1º nt (que era trifosfatado);
O resíduo de G é ligado covalentemente ao 1º nt do pré-mRNA pela guanilil-transferase;
O grupamento difosfato reage com GTP, resultando uma ligação fosfato 5’-- 5’ (ação da guanilil-transferase), com o resíduo G em posição inversa aos demais nucleotídeos;
Cap sofre metilação na posição 7 da G (catalisada pela 7-metiltransferase), resultando em um nucleosídeo 7-metilguanilato.
Isso protege o mRNA da degradação por enzimas, além de ser importante para o reconhecimento de fatores ligados ao processo de tradução.
2. Poliadenilação:
Adição da cauda poli (A) na extremidade 3´do pré-mRNA (transcrito primário): ~200 Adeninas;
não é codificada no DNA e não existe nos rRNAs e tRNAs;
produzida pela enzima poli(A)-polimerase: reconhece a sequência AAUAAA (sequência sinal de poliadenilação) no pré-mRNA (11 a 30 nucleotídeos antes do sítio de poliadenilação), onde se liga dirigindo tanto a clivagem quanto a reação de poliadenilação.
cauda poli(A) aumenta a estabilidade do mRNA;
papel importante no transporte do núcleo para o citoplasma mRNA poliadenilado chega no citoplasma e sua cauda poli(A) vai diminuindo com o tempo devido ação de nucleases.
3. Retirada das sequências não codificantes (íntrons):
Os introns nos pré-mRNA são excisados por complexas estruturas ribonucleoproteicas chamadas splicessomos;
Esse processo de excisão é preciso, e garante que os exons sejam lidos corretamente durante a tradução.
Há diferentes tipos de íntrons, removidos de diferentes formas:
splicing com auxílio de endonucleases: alguns tRNAs
auto-splicing: íntrons possuem atividade catalítica;
splicing com auxílio de ribonucleoproteinas: maioria dos mRNAs.
Sequências conservadas em relação à remoção dos íntrons:
 a) Splicing com auxílio de endonucleases
b) Auto-splicing (Atividade auto-catalítica)
 
c) Splicing com auxílio de ribonucleoproteinas (spliceossomos):
Spliceossomos: estruturas complexas formadas por snRNA + proteínas → ~ ribossomos
snRNAs:
U1, U2, U4, U5 e U6
Variam de 100 a 215 nt
Não existem como moléculas de RNA livres
Presentes em complexos snRNA-proteínas denominado snRNP (pequenas ribonucleoproteínas nucleares)
3. Retirada das sequências não codificantes (íntrons)
mRNA maduro:
Splicing Alternativo
um mesmo pré-mRNA origina 2 ou mais mRNAs maduros, dependendo da forma como é processado. Ex: Organização do gene SRC (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase): Duas diferentes proteínas Src são produzidas a partir do gene SRC porque a sequência do exon A está presente somente nas células nervosas. A forma neural apresenta maior atividade. 
éxon em determinado evento e íntron em outro 
Resultado: 1 gene: diferentes proteínas com diferentes funções em diferentes células; em diferentes estágios do desenvolvimento ou em indivíduos de sexos diferentes
Genoma humano: ~23.000 genes e + de 100.000 proteínas
 
Tamanho de introns em vertebrados é variado;
Exons que codificam proteínas são usualmente pequenos.
Tradução
As proteínas são os componentes mais abundantes na célula (depois da água) → 70% peso seco.Tradução é o processo onde a sequência de mRNA é traduzida em aminoácidos para a formação da proteína levadas para o citoplasma pelo mRNA, onde ocorrerá a síntese proteica (eucariotos).
O DNA armazena as informações para a síntese proteica. A ordem dos aminoácidos determina a função da proteína.
Elementos que participam da tradução
A síntese proteica é semelhante em todas as células, sendo considerada a rota bioquímica mais complexa (~300 moléculas).
As principais moléculas que participam desse processo são:
RNA mensageiro (mRNA): moldes de genes nucleares (DNA);
RNA transportador (tRNA): adaptadores (40-60 moléculas);
RNA ribossômico (rRNA): formam as subunidades dos ribossomos;
Ribossomos: 2 subunidades (maior e menor)
Proteínas: interagem com esses elementos durante o processo
RNA mensageiro (mRNA):
Codifica a informação genética (contida no DNA), sob a forma de uma sequência de bases que por sua vez especifica uma sequência de aminoácidos;
RNA transportador (tRNA):
Chave para o código: os aa especificados pela sequência de bases do mRNA são carregados e depositados na extremidade em crescimento da cadeia polipeptídica por tRNA específicos
Adaptadores para tradução da informação mRNA → aminoácidos;
70 a 90 nt
Se dobram em estruturas em forma de trevo, onde cada tRNA tem um aminoácido específico ligado em uma ponta (OH), e uma trinca de nucleotídeos (anticodon) na volta 2.
1 a 4 tRNA para cada um dos 20 aminoácidos do código genético
tRNAs são denominados em função do aa que representam. Ex.: tRNAMet (tRNA contendo o anticódon da metionina);
quando um tRNA está ligado a seu aa, é denominado aminoacil-tRNA. Ex.: Met-tRNA.
O anticódon de cada tRNA ocorre na alça 2 (região sem pontes de H)
No processo de ligação do aminoácido com o tRNA há ligações de alta energia entre o grupo carboxila dos aminoácido e o terminal 3’OH do tRNA → aminoacil tRNA sintetases.
O tRNA deve:
1. ter a sequência correta do anticódon, para se parear com o códon correto;
2. ser reconhecido pela aminoacil-tRNA sintetase correta; cada enzima é capaz de adicionar apenas 1 dos 20 aa;
3.ligar-se aos sítios apropriados nos ribossomos;
4. reconhecer o códon correto do mRNA;
5. Adicionar o aa ao polipeptídio.
3 nucleotídeos (anticódon) são complementares e ficam em uma orientação antiparalela à do códon (3’→5’).
RNA ribossômico (rRNA):
interage com um conjunto de proteínas para formar os ribossomos, que contém sítios para ligação de todas as moléculas que interagem durante o processo de síntese proteica (fatores proteicos, mRNA e tRNA);
ribossomos ligados aos tRNAs e proteínas específicas podem se mover, fisicamente, sobre moléculas de mRNA para traduzir as informações.
Ribossomos:
constituído por moléculas de RNA individuais e mais de 50 proteínas, arranjados em uma subunidade pequena e uma subunidade grande;
proteínas das 2 subunidades diferem, assim como as moléculas de rRNA;
comprimento das moléculas de RNA, a quantidade de proteínas e o tamanho das subunidades diferem entre procariotos e eucariotos.
Os ribossomos tem 3 sítios:
Sítio A: região onde chega o tRNA com o aminoácido ligado; sítio de entrada de um aminoacil-tRNA;
Sítio P: região onde ocorre a ligação do aminoácido do tRNA à fita crescente da cadeia polipeptídica;
Sítio E: região onde ocorre a liberação do tRNA sem aminoácido
O Código Genético
Composto de trincas de nucleotídeos
1 CODON => 3 nucleotídeos => 1 aminoácido
Anticódon
Sítio na molécula de tRNA (volta 2) que reconhece um códon no mRNA. Suas bases são complementares e antiparalelas às bases do códon. Ex: 
Códon: 5’ACG 3’
Anticódon: 3’UGC 5’
Não há sobreposição:
Sem ambiguidade: 1códon → somente 1 aminoácido
Códons são lidos consecutivamente
Degenerado (Redundância):
todos aminoácidos são especificados por mais de um códon, exceto: metionina e triptofano
61 códons → 20 aa
mais de um tRNA para um único aminoácido;
Via de regra: 1 tRNA para cada códon, porém um determinado tRNA pode parear com mais de 1 códon
um determinado tRNA pode parear com mais de 1 códon:
pareamento da 3ª base do códon (com a 1ª base do anticódon) é menos rígida, devido à conformação da molécula de tRNA
pareamento oscilante (wobble base-pairing)
Permite que 1 tipo de tRNA carregando um aa possa reconhecer 2 códons no mRNA
Ex.:
Serina: codificado por 6 códons, porém possui apenas 3 tRNAs
Arranjo da tabela ordenado (não aleatório)
vários códons para 1 aa → propriedades químicas ~ (geralmente difere 1 nt)
organização da tabela baseia-se em propriedades do código:
maioria dos sinônimos difere apenas na 3ª posição, agrupados na mesma caixa da Tabela, exceto os que possuem 6 códons.
mutações na 3ª posição, em geral, não provocam mudanças de aa (fenotipicamente silenciosas)
evolução do código tende a minimizar os efeitos deletérios das mutações
maioria das mutações que levam a substituição de 1 aa são provocadas pela mudança de 1 base → mutações de ponto
Códons de início e de término
Códon de Iniciação:
Todas as proteínas de procariotos e eucariotos começam com um mesmo aa - a metionina, cujo códon é AUG
em bactérias, pode ser utilizado GUG (valina) ou, mais raramente, UUG (leucina)
Códons de terminação - Stop códons
códons que não especificam aa
não são reconhecidos por tRNA, mas por fatores protéicos denominados “fatores de liberação”
RF1: UAA e UAG
RF2: UAA e UGA
 “Universal” (quase universal)
mesmo significado em todos organismos
Exceções são encontradas em mitocôndrias de mamíferos, protozoários ciliados e em leveduras. Ex: mitocôndrias
UGA: que seria término de cadeia, em mitocôndria é triptofano
AUA: isoleucina, mas em mitocôndria é metionina
AGA e AGG: arginina, mas em mitocôndria é término da cadeia.
O código em mitocôndrias é diferente quando se compara várias espécies, sugerindo que houve uma evolução distinta e não por descendência, a partir de um código genético mitocondrial ancestral.
Processo de Tradução
Pode ser dividido em 3 etapas:
Iniciação: 
É o conjunto de reações que precedem a formação da primeira ligação peptídica da proteína:
acoplamento da subunidade menor do ribossomo ao mRNA,
união do primeiro tRNA ao códon de início da proteína (AUG),
junção das 2 subunidades do ribossomo.
Elongação: 
São as reações que ocorrem desde a formação da primeira ligação peptídica até a incorporação do último aminoácido à proteína.
Terminação: 
São os processos envolvidos na liberação do polipeptídio. O ribossomo separa-se do mRNA e suas subunidades dissociam-se.
Iniciação – PROCARIOTOS:
Envolve códon de iniciação, subunidade 30S do ribossomo, tRNA iniciador especial, mRNA, fatores de iniciação e GTP.
códon de iniciação: geralmente AUG, mas podem ser utilizados GUG ou, mais raramente, UUG;
tRNA iniciador (tRNAi): ligado a uma metionina contendo um grupamento formil ligado ao seu radical amino, formando uma molécula N-formil-metionil-tRNA (tRNAfMet), reconhecendo somente os códons iniciadores AUG, GUG e UUG.
A leitura dos códons depende da localização no mRNA
Ex.: AUG (início) – formil-metionina
AUG (meio) – metionina
GUG (início) – formil-metionina
GUG (meio) – valina
fMet-tRNA i met + GTP + subunidade pequena ribossômica ligam-se ao mRNA num local próximo ao códon de iniciação
RBS (sítio de ligação dos ribossomos): 25-40 nt → códon de iniciação + sequência Shine-Dalgarno (SD) ou sítio de ligação do ribossomo (RBS)
Shine-Dalgarno (SR) ou Sítio de ligação do ribossomo (RBS): complementar a uma sequência próxima à região 3' do rRNA 16S.
coloca o códon de iniciação AUG na posição correta para que a tradução se inicie.
a energia para a síntese proteica é fornecida pela hidrólise de GTP.
formação do Complexo de Iniciação (ribossomo, mRNA e aminoacil-tRNA) se dá em 2 etapas e depende das subunidades ribossômicas 30S e 50S separadas
1.ligação da subunidade 30S no sítio RBS do mRNA
2.formação do ribossomo pela adição da subunidade maior
A ligação da subunidade 30S com o mRNA e o tRNAi necessitade proteínas auxiliares denominadas fatores de iniciação (IFs), que estão envolvidos na formação do complexo de iniciação, dissociando-se durante a formação do ribossomo
Há 3 proteínas (Fatores de Iniciação) que se ligam aos ribossomos: IFl, IF2 e IF3
IF1: 9KDa, cuja função não está ainda bem estabelecida. Pode estar envolvida no processo de estabilização do complexo de iniciação;
IF2: 97KDa, liga-se especificamente ao tRNA iniciador (tRNAfMet) auxiliando na sua apresentação ao complexo de iniciação;
IF3: 23KDa, liga a subunidade 30S com o mRNA além de impedir a ligação da subunidade 50S, mantendo-as separadas.
A iniciação pode ser dividida em 4 etapas:
1ª etapa:
Ligação de IF1 e IF3 com a subunidade ribossômica 30S impede a ligação da subunidade 50S;
tRNAfMet interage com IF-2 para iniciar o processo, onde se ligam ao ribossomo 30S em resposta ao códon de iniciação.
2ª etapa:
ligação da subunidade 30S do ribossomo com o mRNA (RBS) posicionando o códon de iniciação no sítio P ribossômico;
3ª etapa:
ligação códon-anticódon do tRNAi (tRNAfMet) no sítio P;
complexos tRNAfMet + IF-2 e sub 30S + mRNA + IF-3 se combinam e são adicionados IF-1 + GTP
4ª etapa:
liberação dos fatores IF1, IF2 e IF3 e associação da subunidade 50S formando o ribossomo completo (70S). O sítio P contém o tRNAi e no sítio A está o códon para o aminoácido seguinte da cadeia polipeptídica.
ribossomo 70S
tRNAi posiciona-se no Sítio P com seu anticódon alinhado ao códon de iniciação do mRNA;
2º códon do mRNA se alinha ao SÍTIO A, preparando para o Alongamento da Cadeia Peptídica
Em procariotos, um ribossomo pode se ligar a uma molécula de mRNA incompleta, enquanto ela ainda está sendo sintetizada no molde de DNA. Isto não ocorre em eucariotos, já que a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma.
Iniciação - EUCARIOTOS
Envolve códon de iniciação, subunidade 40S do ribossomo, tRNA iniciador especial, mRNA, fatores de iniciação, proteína de ligação de revestimento CAP e GTP.
1 códon de iniciação: AUG
O reconhecimento do sinal de iniciação do mRNA em eucariotos é diferente, pois deve ser o reconhecimento da extremidade 5' do mRNA (CAP).
Iniciação da Tradução envolve o reconhecimento do "cap", seguido por um deslizamento da subunidade 40S até o códon AUG.
O processo de iniciação da síntese protéica é, em vários aspectos, semelhante ao processo em procariotos, exceto:
muitos fatores de tradução (chamados "eIFs");
Met-tRNA i Met é utilizado, mas a metionina do tRNA iniciador não é formilada no grupo N-terminal;
terminal 5' com "cap" no mRNA é necessária para a iniciação
Complexo de Iniciação forma-se na 5’ do mRNA (AUG mais próximo da região 5’do mRNA) e não em um sítio específico (Shine Dalgardo) como em E. coli.
subunidades dos ribossomos: 60S e 40S (completo 80S)
tRNAiMet interage com eIFs;
Ligação da subunidade 40S;
Proteína de ligação ao revestimento (CBP) liga-se ao cap na extremidade 5’ mRNA;
eIFs ligam-se ao complexo CBPmRNA;
Complexo se move 5’→3’ até encontrar AUG;
eIFs se dissociam e sub. 60S liga-se para formar ribossomo 80S
Elongação da cadeia polipeptídica:
cada ribossomo tem dois sítios para ligação de tRNA: sítios Peptidil (P) e Aminoacil (A), além do sítio de Saída (E);
especificidade para um determinado aminoacil-tRNA é dada pelo códon específico do mRNA;
cavidade do ribossomo pode aceitar qualquer aminoacil-tRNA, mas o mRNA a torna específica para um aminoacil-tRNA
Met-tRNA i met entra no sítio P;
todos os aminoacil-tRNAs subsequentes entram no sítio A;
depois que o segundo aminoacil-tRNA é colocado no sítio A, uma ligação peptídica se forma entre a carboxila do primeiro aa e o grupo amina do segundo;
O dipeptídeo resultante fica ligado através da carboxila do segundo aminoácido, ao segundo tRNA.
A elongação pode ser dividido em 3 etapas:
1.Ligação do aminoacil-tRNA ao sítio A do ribossomo
2.Transferência do peptídeo do tRNA no sítio P para o tRNA do sítio A
3.Translocação do polipeptídio crescente do sítio A para o sítio P, e
saída do tRNA pelo sítio E
4.Repetição cíclica dessas 3 etapas
OBS1: Os ribossomos deslocam-se ao longo do mRNA 5’→3’, sintetizando a proteína no sentido amino-terminal para carboxi-terminal;
OBS2: Um mRNA é traduzido simultaneamente por vários ribossomos.
1ª Etapa
entrada do Met-tRNA i met no sítio P;
aminoacil-tRNA entra no ribossomo e se liga ao SÍTIO A com especificidade determinada pelo códon do mRNA alinhado ao SÍTIO A
pareamento ANTICODON – CÓDON no SÍTIO A
requer fator de alongamento Tu levando uma molécula GTP (EF-Tu GTP)
Clivagem de GTP → EF-Tu GDP é liberado do ribossomo
2ª Etapa:
formação da ligação peptídica (peptidil transferase - atividade enzimática na subunidade maior ribossômica) entre grupo amino dos tRNA no SÍTIO A e o terminal carboxila da cadeia crescente ligada ao tRNA no SÍTIO P
3ª Etapa:
tRNA do sítio A translocado para sítio P;
tRNA descarregado no sítio P translocado para sítio E onde será ejetado;
ribossomo se move 3 nucleotídeos sentido 5’→3’ do mRNA
Translocação requer GTP e fatores de alongamento
sítio A fica livre para aceitar um novo aminoacil-tRNA, cuja especificidade é determinada pelo pareamento anticódon/códon
Terminação:
Quando um dos 3 códons de término de cadeia entra no sítio A
UAA/UAG/UGA → FATORES DE LIBERAÇÃO (RF)
Procariotos: 3 RFs bem caracterizados:
RFl: reconhece os códons UAG e UAA
RF2: reconhece UGA e UAA.
RF3: se liga a GTP estimulando a ligação de RF1 e RF2.
ligam-se ao sítio A, liberando o peptídeo do tRNA, o tRNA do ribossomo e dissociando as subunidades ribossômicas;
Eucariotos: um fator de terminação reconhece os três códons de terminação.
com o término da cadeia, a subunidade maior do ribossomo (50S em procariotos e 60S em eucariotos) é liberada do mRNA antes da subunidade menor (30S em procariotos, 40S em eucariotos);
subunidades ficam disponíveis para iniciar a síntese de outro polipeptídeo.
Estrutura das proteínas
Polipeptídios: longa sequência de aa ligados covalentemente
Diferentes combinações de aa = Inúmeras proteínas
Há 20 aa com a mesma estrutura básica, o que varia de um aa para o outro é o radical livre (cadeia lateral)
Níveis de Organização das Proteínas:
1. Estrutura Primária
É a sequência de aminoácidos (ligações peptídicas) formada pela ligação peptídicas entre o grupo amino de um aminoácido e o grupo carboxila de outro com a eliminação de 1 molécula de água, ela determina a forma e a função da proteína, as interações intermoleculares entre seus aa fazem com que a cadeia proteica assuma uma estrutura secundária e uma terciária.
2. Estrutura Secundária
Inter-relações espaciais dos aminoácidos nos segmentos do polipeptídio. Tipos mais comuns: alfa hélices e as folhas beta (estruturas mantidas por pontes de hidrogênio entre as ligações peptídicas)
a) α-Hélice
forma mais comum de estrutura secundária regular;
caracteriza-se por uma hélice em espiral formada por 3,6 resíduos de aminoácidos por volta;
cadeias laterais dos aa se distribuem para fora da hélice;
principal força de estabilização: pontes de hidrogênio.
b) β-Folha
envolve 2 ou mais segmentos polipeptídicos da mesma molécula ou de moléculas diferentes, arranjados em paralelo ou no sentido anti-paralelo;
adquirem aspecto de uma folha de papel dobrada em pregas;
principal força de estabilização: pontes de hidrogênio.
3. Estrutura Terciária
refere-se ao seu dobramento no espaço tridimensional;
mantida por ligações não-covalentes relativamente fracas (ligações iônicas, pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações de Van der Waals) e ligações covalentes (ligações dissulfetos S-S);
a forma da proteína está relacionada diretamente com sua estrutura terciária (proteínas globulares, fibrosas, etc.)
é determinada pelas cadeias laterais dos aminoácidos;
partes hidrofóbicas da proteína agrupam-se no interior da proteína dobrada;
sítio ativos e sítios regulatórios são propriedades da estrutura terciária.
cadeias longas e hidrofóbicasperturbam a estrutura secundária helicoidal, provocando a dobra (looping) da proteína.
4. Estrutura Quaternária
apenas nas proteínas que contém mais de um polipeptídeo.
Ex: hemoglogina – 2 cadeias alfa e 2 Beta, mais 4 grupos hemes
associação de 2 ou mais polipeptídeos em uma proteína multimérica.
As proteínas podem ser:
Simples:
Constituídas somente por aminoácidos
Conjugadas:
Contêm grupos prostéticos, isto é, grupos não aminoácidos, tais como carboidratos, íons, pigmentos, etc.
Ex. hemoglobina: contém 4 grupos prostéticos, cada um consistindo de um íon de ferro. São estes grupos que habilitam a hemoglobina a carregar o oxigênio através da corrente sanguínea.
Organização gênica e genômica em organismos procariotos
Características dos Genomas de Procariotos
Relativamente mais simples que dos eucariotos, com algumas características marcantes:
Ausência do complemento diplóide de genes:
cromossomo único, formado por uma molécula de DNA circular (dupla fita) fechada covalentemente – haploides.
qualquer alteração mutacional no material genético será fenotipicamente expressa → pressão da seleção natural
Uso de quase todo o genoma na codificação e na regulação (praticamente sem a presença de DNA redundante):
genomas de procariotos são geralmente muito menores do que o genoma de eucariotos, apresentam uma estrutura bastante compacta voltada à codificação de proteínas;
a compactação genômica pode causar sobreposição gênica, ou seja, uma sequência gênica codifica 2 proteínas diferentes, isso é muito comum em genomas virais;
Sobreposição pode ocorrer quando:
Um gene é parte de outro: porção inicial (ou final) de um gene pode ser utilizada para codificar outra proteína. Ex: gene A do bacteriófago G4
Sequência de DNA é utilizada para codificar 2 proteínas não-homólogas: mesma sequência de DNA é traduzida em mais de uma fase de leitura.
genoma de bactérias apresentam 106-107bp, com 1.000-6.000 genes
Tamanho do gene corresponde ao tamanho da proteína (ausência de íntrons): 
equivalência entre a sequência de nucleotídeos do gene e a sequência de aminoácidos da proteína. 
Cada códon 3 nt codifica 1 aa: se proteína possui 50 aa → 150 nt. 
Essa é a principal diferença entre organização gênica de procariotos e eucariotos.
Genes codificando funções relacionadas são agrupados em unidades transcricionais
Operon;
unidade funcional do genoma onde dois ou mais genes que codificam produtos com funções relacionadas (mesma via metabólica) ocupam posições adjacentes e estão sob controle de uma única região reguladora.
diferentes genes contíguos presentes no operon são co-transcritos em um único mRNA → mRNA policistrônico
Ocorrência, com frequência aproximadamente igual, de sequências codificantes em ambas fitas de DNA: 
Quanto à orientação distribuição gênica ocorre:
Co-orientação da transcrição e tradução
genes de procarioto são transcritos e traduzidos simultaneamente;
enzimas envolvidas em um processo não podem atrapalhar o outro;
Distribuição das unidades mais ativas perto dos centro de origem da replicação.
perto da origem da replicação (OriC) se encontram os genes mais ativos
Existência de unidades genéticas móveis
unidades acessórias são consideradas móveis porque são capazes de mediar a sua própria transferência para outras bactérias:
 Plasmídeos:
Elementos genéticos extra cromossômicos com capacidade de replicação autônoma;
São formados por moléculas de DNA fita dupla circulares com tamanho variando de 1 a 1000 Kb.
Funções codificadas por plasmídeos:
Genes de virulência: só são patogênicas bactérias que possuem o plasmídeo portador desse gene;
Função bactericida: codificam proteínas que matam outras bactérias ou impedem sua replicação;
Conferem resistência a antibióticos (ampicilina, estreptomicina, canamicina, tetraciclina, cloranfenicol, sulfonamida, etc.) e outros agentes como, por exemplo, metais pesados (mercúrio);
Conjugativos: capazes de mediar a sua transmissão para outras células.
 Elementos de transposição:
São elementos genéticos móveis constituídos por genes que codificam enzimas conhecidas como transposases.
Catalisam a inserção do próprio elemento ou uma cópia dele em um novo sítio genômico, evento chamado de transposição.
Inserção de TEs pode afetar a integridade de suas sequências alvo, (inativando genes).
Podem transportar genes de resistência.
Regulação da Expressão Gênica em Organismos Procariotos
Composição de um gene:
Promotor: sítio no DNA onde se liga a RNA polimerase;
Operador: sítios de ligação no DNA à proteínas intensificadoras ou repressoras da transcrição. Localizam-se próximos à região promotora
Terminador: sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase da fita de DNA molde ao final do processo de transcrição;
Região codificadora: codifica a sequência de aa da proteína ou a sequência do RNA estável.
Gene regulador: controle da transcrição.
Regulação da expressão gênica: ligar/desligar um gene ou um grupo de genes; reconhecer condições extracelulares.
Quando os genes são expressos?
Constitutivos: síntese de mRNA em quantidade constante, independente do estado metabólico do organismo;
tRNA, rRNA, proteínas ribossomais, DNA polimerase, RNA polimerase e proteínas de manutenção celular.
Resposta: hormônios, vitaminas, temperatura, etc. Aumentam/diminuem a síntese de mRNA em reposta ao meio
genes induzíveis: vias degradativas
genes repressíveis: vias biossintéticas
Eucariotos: genes podem ser expressos de acordo com o sexo, a fase do desenvolvimento e/ou o tipo celular.
Procariotos: Oportunistas nutricionais obtêm açucares, aminoácidos e nucleotídeos necessários para o metabolismo ou produzem por vias enzimáticas (dispêndio de energia).
Sistema Repressão-Ativação:
reconhecer sinais extracelulares indicadores
ligar e desligar (ativar/reprimir) genes
REPRESSÃO de genes → proteínas desnecessárias
ATIVAÇÃO de genes → proteínas necessárias
Há diferentes níveis de regulação da expressão gênica em organismos procariotos: transcrição (maioria), tradução e pós-traducional.
Operon
genes organizados em unidades de regulação;
conjunto de genes estruturais adjacentes codificantes de mRNA (policistrônico), com apenas uma região reguladora adjacente que afeta a transcrição de todos os genes estruturais.
Organização de um operon:
Gene regulador: controla a expressão dos genes estruturais de um operon através da proteína reguladora que ele codifica.
Proteína reguladora: controla a expressão transcricional dos genes estruturais de um operon:
Ativadora: é uma proteína reguladora positiva que estimula a transcrição de um operon.
Repressora: é uma proteína reguladora negativa que inibe a transcrição de um operon.
Promotor: região reguladora do DNA localizado antes dos genes estruturais de um operon. É o sítio de ligação da RNA polimerase para iniciar a transcrição.
Operador: região reguladora do DNA, geralmente localizada entre o promotor e os genes estruturais do operon. É o sítio de ligação da proteína reguladora do tipo repressora. Uma vez ligado ocorre a interferência da ligação da RNA pol. no promotor.
Sítio de ligação da proteína ativadora: sítio de ligação da proteína reguladora do tipo ativadora.
Genes estruturais: genes que codificam as proteínas de um operon.
Indutor: agente ambiental que desencadeia a transcrição do operon. Geralmente é a molécula, ou uma forma relacionada à proteína que o operon atua.
Proteínas reguladoras apresentam 2 sítios de ligação
1.Domínio de ligação ao DNA;
2.Sítio alostérico: ajusta o domínio de ligação ao DNA em dois modos: funcional ou não funcional.
ligação do efetor altera a conformação do domínio ligação.
Circuitos Básicos de Controle da Transcrição
Tipos de sistemas reguladores da transcrição
Operons com indução negativa:
- proteína reguladora é um repressor;
- ligação da proteína reguladora ao operador inibe a transcrição.
O gene regulador produz uma proteína repressora que se liga ao operador, a ligaçãodesta proteína ao operador bloqueia fisicamente a ligação da RNA pol ao promotor e impede a transcrição.
- sistema induzível: transcrição está normalmente desligada (inibida).
A transcrição é ligada quando indutor se liga ao repressor, alterando sua forma e impedindo que se ligue ao DNA.
Operon com controle de indução negativa regula a síntese de enzimas economicamente: síntese ocorre somente quando o substrato (indutor) está disponível.
Operons com repressão negativa:
Alguns operons com controle negativo sofrem repressão, significando que:
A transcrição normalmente está ligada e deve ser desligada ou reprimida;
A proteína reguladora é um repressor sintetizada em uma forma inativa e não consegue se ligar ao operador.
Como não há repressor ligado ao operador, a RNA polimerase se liga no promotor e a transcrição dos genes estruturais ocorre.
Então, como a transcrição é desligada?
Molécula chamada de co-repressor se liga ao repressor tornando-o capaz de se ligar ao operador;
Operons que sofrem repressão também são econômicos: as enzimas são sintetizadas somente quando necessárias.
Ambos sistemas (com indução e com repressão) são formas de controle negativo → proteína reguladora é um repressor.
Operons com indução positiva:
Transcrição normalmente está desligada → proteína reguladora (ativadora) é produzida na forma inativa;
Transcrição ocorre quando um indutor se liga na proteína reguladora, tornando-a ativa.
Operons com repressão positiva:
transcrição normalmente está ligada e deverá ser reprimida;
proteína reguladora é produzida na forma ativa que se liga ao DNA e estimula a transcrição;
transcrição será inibida quando a substância se ligar ao ativador tornando-o incapaz de se ligar no DNA. Assim a transcrição não é estimulada.
	Exemplos de operons:
Operon lac (Operon Lactose):
gene I: gene regulador que codifica proteína repressora;
sítio P: sítio no DNA ao qual se liga a RNA polimerase para o início da transcrição - promotor;
sítio O: sítio do DNA ao qual se liga o repressor – operador
Genes estruturais:
lacZ: -galactosidase (lactose = glicose + galactose)
lacY: permease (transporta lactose para a célula)
lacA: transacetilase (transfere grupo acetil de acetilCoA para galactosidases)
Indutor lactose
Na ausência da Lactose:
Na presença de lactose:
proteína repressora é alostericamente alterada, não se ligando no operador → mRNA é sintetizado;
gene regulador (lacI) é constitutivo, portanto, a proteína repressora está sempre disponível;
a célula “percebe” a necessidade para a expressão do operon lac pela presença ou ausência do indutor.
 - Operon lac: Controle positivo – Repressão Catabólica: escolha do melhor açúcar.
bactéria não utilizará lactose (ou outro açúcar) enquanto a glicose estiver presente no meio;
quando a glicose está disponível, genes que participam no metabolismo de outros açúcares terão sua transcrição reprimida, um fenômeno denominado REPRESSÃO CATABÓLICA
operon Lac tem um nível adicional de controle (controle positivo) que faz com que não seja eficientemente transcrito na presença de glicose, mesmo se a lactose também estiver presente.
quebra da glicose modula os níveis de um importante constituinte celular, o monofosfato cíclico de adenosina (cAMP);
cAMP é um sinal intracelular dos níveis de glicose: em baixos níveis de glicose, cAMP é sintetizado a partir de ATP como um sinal intracelular para regular (ativar) a transcrição de operons;
a concentração de cAMP é inversamente proporcional ao nível de glicose disponível.
cAMP é o efetor alostérico da proteína ativadora do catabolismo (CAP). A ligação do cAMP à CAP, permite que a mesma se ligue ao promotor do operon lac (sítio de ligação à CAP), levando ao aumento da afinidade enzimática pelo promotor.
Efeito do nível de glicose na expressão do operon lac:
Operon ara (Operon Arabinose): Sistema com Controle Duplo (Positivo e Negativo)
gene C: proteína ativadora;
sítio O: sítio operador;
sítio I: sítio promotor;
Genes estruturais: envolvidos no metabolismo de arabinose:
araB
araA
araD
Indutor → arabinose
- Sistema de controle positivo: Na presença do açúcar Arabinose o gene C produz uma proteína ativadora que se liga ao I (sítio de ligação da proteína ativadora) favorecendo a ligação da RNA polimerase, ativando a transcrição.
- Sistema de controle negativo: Na ausência do açúcar Arabinose a proteína produzida pelo gene C (ativadora) assume uma conformação diferente, que se liga ao I (promotor) e O (operador) formando uma alça impedindo a transcrição reprimindo o Operon Ara.
Operon Trp (Operon Triptofano): Sistema Repressor de Controle Negativo
gene R: codifica uma proteína repressora;
sítio P: promotor;
sítio O: operador;
sítio L: sequência líder envolvida com o sistema de regulação baseado na atenuação;
Genes estruturais: codificam enzimas para a biossíntese de triptofano
TrpE
TrpD
TrpC
TrpB
TrpA
Sistema repressor de controle negativo:
A síntese de triptofano é desligada quando há seu excesso no meio, o triptofano funciona como um co-repressor, na ausência do triptofano a RNA polimerase se liga ao promotor e transcreve os genes estruturais; na presença do triptofano, o complexo co-repressor/repressor liga-se ao operador impedindo que a RNA polimerase se ligue ao promotor.
Genes podem ainda serem expressos em apenas um estágio do desenvolvimento, ou em resposta a uma infecção viral, por exemplo.
Organização gênica e genômica em organismos eucariotos
Características dos Genomas de Eucariotos
São mais complexos que os genomas de procariotos, possuindo algumas características marcantes:
Diplóides/Triplóides/Poliplóides:
Conjunto diplóide, triplóide, tetraploide ou poliplóide de cromossomos lineares 
Número, tamanho e estrutura (centrômero) dos cromossomos varia muito entre as espécies, mas é o mesmo em indivíduos da mesma espécie.
Genoma nuclear + genoma das organelas:
Vegetais: nuclear + cloroplastos + mitocondrial
Animais: nuclear + mitocondrial
Material genético envolto por uma membrana celular;
Presença de grandes quantidades de DNA sem aparente função regulatória ou codificante:
uma das principais diferenças entre genomas procariotos e eucariotos é o tamanho, isso se deve a presença de sequências de DNA repetitivas em genomas de eucariotos;
eucarioto mais simples (levedura): 3 X mais DNA que E. coli
animais e vegetais: 40-1.000X mais DNA que bactérias
Genomas grandes apresentam muita sequência repetitiva, não necessariamente mais genes, não é possível, também, relacionar número de genes com complexidade do organismo.
Valor C: grandeza que expressa o tamanho do genoma (haplóide)
Implicação: genomas maiores de organismos relativamente simples podem ter mais sequências repetidas e não necessariamente mais genes.
Espécies mais complexas “evoluem” pelo surgimento de genes com novas funções:
Tamanho do genoma está mais relacionado com a quantidade de ELEMENTOS DE TRANSPOSIÇÃO.
Genes formados por éxons e íntrons:
não há relação entre o nº de genes e o nº de proteínas 
geralmente 1 gene → mais de 1 proteína;
		- uso de códons de iniciação e terminação alternativos;
- splicing alternativo (éxons constitutivos x facultativos) → codificação de proteínas diferentes;
Ausência de operons:
Existência de múltiplas cópias de algumas sequências particulares:
Há 3 classes de DNA:
6.1. DNA não repetido, singular ou de cópia única no genoma
Genes: 
Cópia única funcional (codificador) → proteína:
Genes estruturais, representados apenas uma vez no genoma haploide;
Representam 25 – 50% dos genes de eucariotos
	Genes Constitutivos
	X
	Genes Induzíveis
	Expressos em taxas constantes, em todos os tipos celulares;
Relacionados com funções metabólicas de rotina → manutenção celular
Ex: β-actina
	
	Expressão é regulada por fatores externos;
Respondem à estímulos;
Expressos em condições e tecidos específicos;
Ex.: hormônios, infecção, ingestão de metais pesados;
Cópia única não codificadora:
Íntrons: segmentosde um gene transcritos mas não traduzidos. São removidos durante o processamento do pré-mRNA em mRNA maduro.
Cópia única não codificadora funcional → regulação:
Pseudogenes: originados por duplicação ou retrotransposição (transcrição reversa de mRNA e reintegração do cDNA ao genoma). O acúmulo de mutações leva a perda da função de síntese de proteína, porém eles ainda geram micro RNA, que atua na regulação, impedindo a síntese proteica.
DNA espaçador: regiões intergênicas podem ter DNA não repetitivo; frequentemente designado de “DNA lixo”, sem função aparente.
6.2. DNA moderamente repetido, disperso no genoma:
Família gênica: DNA repetitivo codificador
Há genes que estão presentes no genoma em centenas de cópias:
Codificam proteínas ou RNAs funcionais;
Necessários para atingir a demanda celular de transcritos;
Múltiplas cópias agrupadas ou dispersas.
DNA moderadamente repetitivo não codificador:
São aequências mais complexas, moderadamente repetidas dispersas por todo o genoma; a maioria é derivada de elementos transponíveis.
Elementos de transposição: são sequências particulares de DNA, moderadamente repetidas, que podem ter a habilidade de mudar de posição dentro do genoma. O número de inserções dessas sequências dentro do genoma hospedeiro pode variar desde poucas cópias até milhares. 
→Classificação quanto à autonomia para realizar ou não a sua transposição:
Cópias completas (autônomas): codificam as enzimas necessárias para a transposição (transposase).
Cópias incompletas (não-autônomas): dependem dos elementos autônomos produzirem as enzimas necessárias para sua transposição.
Sequências móveis estão sujeitas a altas taxas mutacionais. Assim, a frequência de elementos não-autônomos é relativamente alta.
→ Classificação quanto ao mecanismo de transposição:
Transposon: DNA como intermediário. Utilizam a enzima transposase para sua transposição.
Retrotransposon: RNA como intermediário. Utilizam a enzima Transcriptase Reversa para a transposição. Os mais comuns em mamíferos: SINE e LINE
SINE: Alu (300bp) = 1 milhão de cópias no homem
LINE: L1 (6-7 kb) = milhares de cópias
Os elementos transponíveis assumem importante papel na evolução das espécies, eles podem afetar o genoma (o efeito depende do local de inserção:
aumentando seu tamanho e a variabilidade genética
reestruturando a arquitetura genômica
causando mutações em genes (ativar ou inativar)
regulando a expressão gênica
originando novos genes (domesticação)
atuar como vetores na transposição horizontal de genes
Inserções de TEs em regiões codificadoras de proteínas:
DNA altamente repetido:
É um conjunto de diferentes famílias de sequências curtas, reiteradas milhares de vezes e organizadas em longos arranjos em tandem
Tandem: 
Há 3 classes de DNA altamente repetitivo:
DNA satélite: sequências de DNA altamente repetitivas em tandem, ricas em CG, encontradas na heterocromatina, principalmente próximo aos centrômeros (extremidades dos cromossomos);
DNA minissatélite: múltiplas repetições em tandem de uma unidade representada por sequência de tamanho mediano:
- regiões do DNA que contém pequenas sequências de nucleotídeos (cerne) repetidas em tandem (muitas vezes);
- polimorfismo se dá no número dessas repetições;
- podem ter muitos alelos (cerne e tamanho).
DNA microssatélite: múltiplas repetições em tandem de uma unidade representada por uma sequência de 1 a 6 nt:
- altamente polimórficos;
- detecção feita por PCR e sequenciamento;
Classificação:
- Perfeitas: sem interrupções
- Imperfeitas: interrompidas por nucleotídeos não repetidos
- Compostas: 2 ou + tipos de repetições adjacentes (perfeita/imperfeita)
Aplicações: mapeamento genético, diagnósticos, biologia da conservação, investigação forense, estudos de população, caracterização racial, registro genealógico, certificação e rastreabilidade, MAS e estudos de QTL
Vantagens de estudar microssatélites: pouco DNA requerido; abundância no genoma com distribuição aleatória; alto nível de polimorfismo e alta reprodutibilidade; transferabilidade
Desvantagens: altos custos de desenvolvimento caso os primers não estejam disponíveis; requer a construção de bibliotecas para estudos dos microssatélites espécie-específicos
Como os microsatélites são formados?
Modelos para explicar os processos envolvidos na formação das repetições:
- escorregões da DNA polimerase – DNA slippage
- crossing over desigual
7. Presença de DNA fora do núcleo: cloroplastos e mitocôndrias
codificam proteínas e necessárias para o metabolismo dessas organelas, que são essenciais a vida dos eucariotos.
rRNAs e tRNAs para a tradução
Genoma Mitocondrial (mtDNA):
DNA fita dupla, geralmente circular;
quantia de MIT relacionada com atividade da celular;
processos de replicação, transcrição e tradução dos genomas de organelas são autônomos 
ocorrem no interior da própria organela;
Genoma = semelhantes ao genoma de procariotos (pequenos, organizados operons)
 → Teoria da ENDOSSIMBIOSE
Forma: maioria circular, exceções: algumas algas e protozoários possuem mtDNA lineares
Tamanho: 6 kb até 200 kb
Conteúdo: genes do complexo enzimático relacionados com respiração; genes relacionados ao processo de tradução dos genes da organela
Mt DNA Humano: 16.597 pb
37 genes que codificam:
13 proteínas
22 tRNAs
2 RNA ribossômico
Marcadores Mitocondriais
Genes mitocondriais:
-herança materna
-taxa de mutação 4X maior que genes nucleares
Excelente marcador para estudos de população: relações filogenéticas (espécie/subespécie), estimativa de distância genética, discriminação de sub-populações, investigação de história biogeográfica, etc.
- Auxiliar na catalogação de espécies, facilitando a separação de espécies crípticas, com taxonomia complexas e/ou pouco estudadas
- Estimar de tempo de divergência e filogenia entre grupos
Estudo do genoma mitocondrial completo de diversas raças revelou:
-polimorfismos: 237
-tempo de divergência: 1,7 a 2 milhões de anos
- Variabilidade genética:
O rebanho selvagem Chillingham (Inglaterra) resiste há mais de 300 anos (67 gerações). Em 1947, passou por um gargalo populacional: 5♂ e 8♀ (genoma nuclear quase que homozigoto, baixa variabilidade)
Viabilidade da manada (97Δ) devido à perda de alelos nucleares deletérios: proporciona oportunidade única para estudar uma população em estado selvagem, onde o genoma mitocondrial (↑↑ taxa de mutação) está operando contra um fundo quase que uniforme do genoma nuclear
- Projeto DNA Barcoding of Live:
sequenciamento de 648bp do gene COI como ferramenta na catalogação de biodiversidade e taxonomia
presente em quase todos os organismos
sequência espécie-específica
identificação em qualquer estágio de vida
Genoma dos Cloroplastos ctDNA:
DNA fita dupla circular;
processos de replicação, transcrição e tradução são autônomos, isto é, ocorrem no interior da própria organela;
contém cerca de 120 genes;
alguns organismos: presença de introns
Organização do Genoma Humano:
Genoma nuclear + mitocondrial
Regulação da expressão gênica em organismos eucariotos
Células em meios uniformes - ação coordenada entre:
sinais que provocam mudança da expressão;
resposta a esses sinais;
mecanismo de reposta
Uma célula humana contém ~23.000 genes, os quais podem ser expressos:
a todo momento (genes constitutivos - housekeeping): responsáveis pelas funções metabólicas de rotina, como por exemplo a respiração, que é comum à todas as células;
quando a célula entra em um padrão de diferenciação particular. Exemplo: células do plasma expressam continuamente os genes para a síntese de anticorpos.
quando as condições ao redor ou no interior da célula mudam (genes induzíveis). Exemplo: a chegada de um hormônio pode ligar ou desligar certos genes numa determinada célula alguns são expressos todo o tempo nestas células.
Como a expressão gênica é regulada?
regulação gênica em organismos multicelulares está na especificidade, na forma e função das células em cada tecido → genes de eucariontesnão são encontrados em operons;
cada gene tem suas sequências reguladoras específicas que são essenciais no controle da transcrição;
Genes induzíveis: respondem a ameaças ou estímulos ambientais, como ingestão de metais pesados, infecção viral, etc.
Genes que codificam proteínas possuem:
Exons: sequências traduzidas em aa;
Introns: sequências que serão removidas do mRNA antes de sua tradução;
Sítio de início da transcrição
Promotor
promotor basal ou fundamental ou principal: ~40bp do sítio de inicio da transcrição;
promotor secundário (usptream): pode estar localizado a mais que 200bp distante e anterior ao promotor principal;
Acentuadores (enhancers)
Silenciadores
Isoladores
Para ligação da RNA poli II são necessários:
elementos regulatórios de ação CIS: DNA
elementos regulatórios de ação TRANS: proteínas
1. Elementos regulatórios de ação CIS:
Promotor Principal
região de ligação da RNA polimerase II;
presente em todos os genes codificantes;
~30bp antes do sítio início transcrição
TATAAAA (tata box)
Reconhecida por fatores de transcrição IID (TFIID) o qual forma	 um complexo com mais de 10 proteínas diferentes incluindo a proteína de ligação TATA (TBP), a qual reconhece e se liga na TATA box
Elementos Proximais ao Promotor – Promotores Secundários
onde se ligam as proteínas que auxiliam na ligação da RNA polimerase);
estrutura e fatores de ligação diferem de gene para gene;
genes de diferentes tipos celulares compartilham os mesmos fatores de transcrição: que se ligam no promotor principal e secundários;
um gene específico em uma determinada célula é ligado por meio da combinação única dos sítios promotores e os fatores de transcrição;
100 – 200bp antes do sítio início transcrição (upstream)
CCAAT box		 GC-rich
Uma analogia: Fileiras de caixas de segurança do banco:
Para abrir uma caixa em particular na sala, são requeridas duas chaves:
sua chave (promotor secundário), cujo padrão serve somente na fechadura da caixa reservada para você;
chave geral do banco (promotor principal), que pode ativar o mecanismo de destrave de qualquer caixa;
ambas não abrem a caixa sozinhas
Acentuadores (enhancers)
sítios de reconhecimento (DNA) de proteínas ativadoras que estimulam a transcrição pela interação física com a RNA polimerase e outros fatores transcricionais que se ligam ao promotor.
independentes da distância ao promotor (podem estar localizados à milhares de pares de bases antes ou depois do promotor);
interação requer a formação de DNA looping;
Silenciadores (silencers)
diminuem a taxa transcrição → regiões no DNA são reconhecidas por proteínas repressoras da transcrição → inibem ativadores;
quando proteínas repressoras se ligam à essas sequências de DNA, a expressão do gene que eles controlam é reprimida
também independem da distância ao promotor;
Problema:
acentuadores podem se ligar nos promotores dos genes localizados milhares de pares de bases distantes.
o isolador impede um acentuador de se ligar inapropriadamente e ativar o promotor de algum outro gene na mesma região do cromossomo.
Isoladores (Insulators):
segmentos de DNA (~42 bp) localizados entre acentuadores e promotores e/ou silenciadores e promotores de genes adjacentes;
Impede que um gene seja influenciado pela ativação ou repressão dos seus genes vizinhos, ou seja, impede a atuação desordenada entre os seus promotores e acentuadores e/ou silenciadores;
genes adjacentes geralmente são separados por um “isolador”.
Elementos regulatórios de ação TRANS
Fatores de transcrição
proteína que se liga a um elemento cis-regulador (por exemplo, um acentuador) e assim, direta ou indiretamente controla o início da transcrição;
a presença desses fatores são essenciais à transcrição, mas não podem, por si só aumentar ou diminuir a taxa de transcrição.
Há 2 classes de fatores de transcrição:
a. Fatores de transcrição gerais: necessários para transcrição de todos os genes. Necessários para que as polimerases se liguem ao DNA.
Fatores específicos: responsáveis pela expressão de genes em células específicas.
Níveis de regulação em eucariotos
Estrutura da Cromatina: genes acessíveis à RNApoli II (herança epigenética)
Transcricional: altera quais genes são transcritos e sua taxa de transcrição
Pós-transcricional: ocorre no núcleo e envolve processamento diferencial e velocidade de maturação de mRNA, ou a estabilidade da molécula de mRNA
Traducional: alteração no tempo de vida do mRNA, na ligação aos ribossomos, na eficiência de tradução pelos ribossomos.
Pós-traducional: mudanças adicionais para a funcionalidade e/ou estabilidade da proteína (dobras, quebras, fosforilação)
Nível Transcricional
maioria dos genes → controle nível transcricional
regulação da expressão relacionada ao empacotamento damolécula de DNA
Remodelagem da cromatina (histonas)
Histonas determinam o grau de condensação do DNA (cromatina)
Para os genes serem expressos, é preciso que o DNA esteja descompactado.
Em geral, são modificações nos aminoácidos das histonas responsáveis pela remodelagem da cromatina (mudança de posição dos nucleossomos). Dentre os processos estão:
-Acetilação (lisina): H3 e H4 → abre a cromatina, ativa a transcrição
-Metilação (lisina ou arginina)
-Fosforilação (serina)
-Ubiquitinação (lisina)
-Ribosilação
Desacetilação: condensa a cromatina, impede (desliga) transcrição
Metilação do DNA
dinucleotídeos 5’-CpG-3’: união de C+G por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA → ilhas CpG (regiões promotoras)
grupos metil inseridos no carbono 5’ das C nas sequências CpG
Metilação ocorre em 70-80% dos sítios CpG ( com envelhecimento)
São estáveis e herdáveis
Inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição (reprime expressão) → Silenciamento Gênico
Metilação atua:
1. Controle da expressão gênica espacial e temporal
2. Integridade cromossômica e segregação centromérica
3. Recombinação
4. Inativação do cromossomo X
5. Proteção contra elementos genéticos móveis
6. Imprinting genômico
7. Envelhecimento
As funções celulares dependem do equilíbrio entre metilação e acetilação:
Ilhas CpG ↔ hipometiladas
Regiões intergênicas ↔ hipermetiladas
Ex.: Gene PHLDA2 em bovinos: proteína que atua na diferenciação da placenta apenas um alelo é expresso, o outro é metilado, se ambos alelos se expressam há supercrescimento da placenta, levando ao desenvolvimento de síndromes
Silenciamento de cromossomo inteiro: inativação do X
Inativação aleatória de um dos dois cromossomos X em cada célula, em um estágio inicial do desenvolvimento de fêmeas (Compensação de dose) torna a quantidade da maioria dos produtos gênicos equivalentes à dose única de cromossomo X nos machos.
Corpúsculo de Barr (estrutura heterocromática)
Ex.: Gato Tortoiseshell
Imprinting Genômico
Genes autossômicos com um padrão incomum de herança
Ex.: camundongos (cromossomo 11)
-IGF2 ( insulin-like growth factor 2): alelo expresso herdado do pai
-H19 (long non-coding RNA, atua como supressor tumoral): alelo expresso herdado da mãe
Metilação dos genes na formação dos gametas
Visão geral da regulação transcricional
Maquinaria necessária para gerar essa diversidade de padrões de transcrição gênica inclui sequências reguladoras de ação cis e proteínas reguladoras (trans).
Dois grandes grupos de proteínas reguladoras (elementos de ação trans):
1. Complexo de RNA polimerase II: se ligam a elementos proximais do promotor
2. Fatores gerais de transcrição: se ligam a sequências reguladoras de ação tris
Aparato molecular controlador da transcrição em células humanas:
1.RNA polimerase (em azul, nº representam as subunidades)
2.Fatores de transcrição basais (moléculas reguladoras trans = A,B, F, E, H)
3.Fatores regulatórios cis (acentuadores e repressores da transcrição)
Controle da transcrição por Hormônios
hormônios lipossolúveis (esteróides, ácido retinóico e hormônios da tireóide) são capazes de se difundir pela membrana plasmática, interagindo com receptores hormonais